Eletroforese por gel não desnaturante (gel nativo)

O gel não desnaturante, também chamado gel nativo, é uma técnica de separação para análise de proteínas que se baseia em três propriedades para a separação: diferenças de cargas, peso molecular (tamanho) e conformação. Este experimento foi efetuado para a verificação visual de possíveis monômeros, homodímeros e homotetrâmeros do TR que se formaram na presença e ausência do ligante em uma concentração de 1mg/mL (~25 μM), a 4°C.

Para os experimentos de oligomerização foram usados géis nativos do sistema Phast

System (Amersham-GE) de gradiente, com a concentração de poliacrilamida variando em um

gradiente de 8 a 25%. As proteínas foram submetidas à eletroforese, em sua forma nativa, após a gel filtração e clivagem da cauda de histidina. A concentração protéica utilizada foi de 1mg/mL do apo- e holo-TR.

Juntamente às amostras, um padrão de proteínas de conhecido peso molecular foi

submetido à eletroforese (kit de calibração de eletroforese GE-Amersham – alto peso molecular). Os géis foram corados com Coomassie blue. Os fatores de retardação (Rf) foram

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graficados como 100log(100x Rf) versus raio hidrodinâmico (Rh) na forma de um gráfico de Ferguson, a equação linear obtida foi então usada para calcular o Rh das bandas do TR102.

A eletroforese por gel não-desnaturante também foi utilizada para o monitoramento das condições de todas as proteínas, nesse caso foram avaliadas propriedades como agregação, oligomerização, modificações após a adição de ligantes e ligação ao DNA. Esse monitoramento foi realizado como uma pré-análise das proteínas antes de outros experimentos, principalmente para se checar a monodispersividade das amostras submetidas a experimentos de espalhamento de raios-X a baixos ângulos.

3.11.3. Estudo do estado de oligomerização do TR através de Dinamic Light Scattering (DLS)

A Espectroscopia de fotocorrelação (PCS) ou Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS) possui relação com a investigação da correlação entre fótons. A técnica de espalhamento de luz dinâmico mede as flutuações de luz espalhada pela amostra. É chamado de dinâmico porque reside no fato de possuir objetos espalhadores (no caso algumas moléculas de proteínas) que estão em movimento, dinamicamente se difundindo através da amostra. O DLS percebe quão rápido os objetos estão se movendo e relaciona este fato com o tamanho da molécula estudada.

A luz, quando interage com a matéria, pode ser absorvida ou espalhada. A dispersão ocorre pela interação dos elétrons com a radiação incidente, a qual induz a conversão desses elétrons em dipolos oscilantes que reemitem a radiação. Com isso os elétrons tornam-se fontes de radiação em movimento Browniano. O movimento Browniano das partículas em solução está relacionado tanto ao coeficiente de difusão das moléculas, quanto a seu tamanho e forma.

A função de autocorrelação é construída usando-se a diferença no número de fótons emitidos dentro dos intervalos de tempo usados pelo equipamento de intensidade e descreve a probabilidade de detectar-se um segundo fóton como uma função do tempo; ela descreve

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quando as moléculas espalhadas se moveram mais rápido que a escala de tamanho de um fóton (dada pelo inverso do vetor de espalhamento).

A taxa de decaimento da função de correlação é devida à difusão das partículas ou moléculas em solução. Desta maneira pode-se medir a constante de difusão destes espalhadores à partir da taxa de decaimento da função de autocorrelação. À partir desta constante (coeficiente de difusão translacional, D) pode-se calcular o raio hidrodinâmico através da equação de Stokes-Einstein: D = kBT / 6πηRH , onde kB é a constante de Boltzmann, T a temperatura absoluta em Kelvin, η é a viscosidade do solvente e o RH é o raio hidrodinâmico da partícula dispersante. O raio hidrodinâmico possui este nome pelo fato de que a hidrodinâmica da solução é levada em conta (como a viscosidade do solvente) correspondendo ao tamanho que os espalhadores aparentam ter em função do líquido em volta – partícula mais camada de solvatação.

A inversão de Laplace da função de correlação pode predizer a distribuição de tamanhos dos objetos os quais contribuem para a medida. Isto pode ser útil para encontrar pequenas quantidades de agregados em uma amostra. Espalhamento de luz é muito sensível para detectar qualquer grande espalhador porque o sinal espalhado por uma grande espalhador é muito mais forte que o sinal de um pequeno espalhador. Entretanto isto também é uma limitação da técnica: se há muito agregados, grandes partículas, eles irão sobrepujar o sinal de espalhamento das partículas menores.

A técnica do DLS foi empregada para estudar o estado de oligomerização em solução do receptor nuclear purificado, além disso, foi usada para o monitoramento de amostras usadas em outros experimentos, como o espalhamento de raios-X a baixos ângulos. Empregou-se o equipamento DynaPro MS (Protein Solutions) para monitorar a concentração e mudanças dependentes da presença do ligante, para os estados oligoméricos do receptor. As medidas foram realizadas a 4°C com tempo de aquisição de 2,5 segundos e 30 aquisições por medida. Foram feitas 5 medidas seqüenciais para cada concentração de apo e holo TR DBD-

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LBD e LBD. As características do solvente (quantidade de glicerol) foram registradas e descontadas, sendo que nesse trabalho utilizou-se 5% glicerol. Todas as amostras foram centrifugadas 10.000 rpm 10 min. 4oC, ou filtradas, antes de serem medidas. Os raios medidos em cada concentração foram promediados, seus desvios padrões foram calculados e graficados versus concentração de proteína, no programa Origin.

Essa técnica também foi utilizada para monitoramento das condições de todas as proteínas, nesse caso foram avaliadas propriedades como agregação, oligomerização, modificações após a adição de ligantes e ligação ao DNA. Esse monitoramento foi realizado como uma pré-análise das proteínas antes de outros experimentos, principalmente para experimentos de espalhamento de raios-X a baixos ângulos.

No documento Oligomerização, estruturas à baixa resolução, ligação ao DNA e ao ligante dos receptores... (páginas 64-67)