As plantas medicinais são geralmente consideradas como possuidoras de uma ampla gama terapêutica e baixos níveis de risco toxológicos. No entanto, os fármacos derivados de plantas podem conter constituintes que exercem efeitos secundários não desejados (Ernst e Barnes, 1998). Deste modo, os produtos fitoterapêuticos, assim como as drogas sintéticas, devem ser avaliados por critérios de eficácia, qualidade e segurança (Hecker et al, 2002; Couzinier e Mamatas, 1986).
O presente estudo permite inferir, ao nível de ensaios em cultura de células in vitro, que a incubação com extracto aquoso bruto de folhas de Ginkgo biloba, isto é, feito a partir de folhas da árvore sem qualquer processamento posterior, poderá representar um potencial perigo genotóxico devido, principalmente, à presença de ácidos ginkgólicos. Os estudos de Zuang (2001) e Hecker e colaboradores (2002) já tinham demonstrado a redução do número de células viáveis quando expostas a este extracto vegetal e o presente estudo contribuiu, com dados genotóxicos, para uma compreensão alargada dos mecanismos subjacentes à acção nefasta que o extracto bruto pode representar para as células.
O potencial antigenotóxico e quimioprotector já descrito noutros estudos sobre o extracto de folhas de Ginkgo biloba foi também refutado nos ensaios realizados. Este tipo de conclusões tem sido retirada para vários extractos de origem vegetal, nutrientes e micronutrientes que são empiricamente considerados benéficos.
Este estudo, no entanto não afasta os notórios benefícios da toma do extracto de Ginkgo
biloba na melhoria das capacidades cognitivas, efeito dilatador dos vasos sanguíneos e
impedimento da oxidação do colesterol LDL, sendo consequentemente importante na prevenção de doenças vasculares. A toma de fármacos à base de Ginkgo biloba vendidos em farmácias está, à partida, isenta de riscos uma vez que há um processamento do extracto de modo a que a concentração de ácidos ginkgólicos não ultrapasse os 5 ppm, concentração esta considerada segura. Por outro lado, os ginkgolides e o bilobalide já demonstraram ser capazes de ultrapassar a barreira hemato- encefálica que é o principal entrave de muitos compostos estudados que, apesar de potencialmente benéficos, não exercem qualquer função em estudos in vivo (Lang et al, 2010). A questão levantada neste estudo coloca-se quando o extracto de folhas de
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princípios benéficos e nefastos extraídos em água. Existem dois aspectos a ter em conta neste caso: o primeiro prende-se com o facto de esta infusão natural parecer à partida inócuo podendo conduzir a uma ingestão acima do recomendável; além disto, deve notar-se que os benefícios do extracto de Ginkgo biloba são principalmente direccionados para uma faixa etária acima dos 40 anos o que a nível genético pode acarretar um efeito nefasto sinergético uma vez que, aos danos no DNA e mutações adquiridos ao longo da vida, se poderão juntar os danos induzidos por constituintes prejudiciais da toma do extracto. Em última análise isto poderia potenciar o desenvolvimento de doenças com uma base genética, como o desenvolvimento de cancro.
É por esta razão que a produção de extractos de plantas medicinais padrão deve obedecer ao princípio do seu enriquecimento em compostos terapeuticamente relevantes e exclusão de substâncias com possíveis propriedades nefastas. Assim, durante a produção do extracto padrão de folhas de Ginkgo biloba, EGb 761, que é comercializado, as fracções contendo ácidos ginkgólicos são removidas enquanto as concentrações mínimas dos constituintes terapeuticamente activos estão garantidas. A eliminação destes compostos e outros alquilfenóis do extracto padrão é justificável sob considerações toxicológicas e, por razões de segurança, não é aceitável permitir concentrações destes compostos que excedam os níveis propostos (Hecker et al, 2002). A relevância clínica desta afirmação é sublinhada por alguns relatos médicos em que se verificou o desenvolvimento de dermatites de contacto sistémicas após a ingestão oral de suplementos de Ginkgo biloba com elevadas quantidades de ácidos ginkgólicos (Chiu et al, 2002).
Uma questão relevante prende-se com o facto de cerca de 25% das drogas comercializadas terem origem vegetal. Mas, apesar disso, esta é uma com um enorme potencial de evolução visto existirem entre 250 000 a 500 000 espécies vegetais sendo que apenas uma pequena percentagem está a ser estudada.
O estabelecimento de plantas in vitro é provavelmente um dos pontos cruciais na elaboração de fármacos à base de espécies vegetais isto porque, quando a planta ou parte de planta têm origem no campo pode ocorrer uma grande variabilidade dos compostos benéficos e nefastos sendo esta inconstância uma das principais dificuldades
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de uma produção em massa. Outras questões prendem-se com a bioacumulação de substâncias tóxicas, por parte da planta, devido à poluição e também com a salvaguarda dada à biodiversidade que, por vezes, é colocada em causa com a sobre-exploração de algumas plantas.
Os resultados obtidos neste estudo utilizando a técnica do ensaio do cometa devem ser complementados com vários outros testes, como os teste de redução do tetrazólio MTT, método de exclusão do azul de tripano ou de captação do vermelho neutro de modo a avaliar-se o crescimento celular, a viabilidade, a integridade e a morfologia das células quando incubadas com o extracto vegetal de Ginkgo biloba (Hecker et al, 2002). A avaliação dos efeitos deste extracto noutras linhas celulares e modelos in vivo permitiria deslindar, de uma forma mais aprofundada, quais os riscos reais da toma de uma infusão de folhas de Ginkgo biloba.
A realização do trabalho aqui apresentado permitiu concluir que a utilização do Paraquato é um meio eficaz e barato de se produzir dano oxidativo na linha celular HepG2. De facto este herbicida é capaz de aumentar a geração de radicais livres concomitantemente com a formação enzimática de radicais monocatiónicos de Paraquato na presença de NADPH, induzindo posteriormente dano oxidativo no DNA (Tanaka e Amano, 1989; Nicotera et al, 1985; Bus et al, 1974; Dodge e Harris 1970; Gage, 1968).
A relevância dos compostos capazes de induzir este tipo de danos, expressa-se na investigação fundamental de danos no DNA e a sua reparação in vitro, em estudos de quimioprotecção onde se avalia a capacidade de protecção das células por parte de fitoquímicos ou a acção de nutrientes e micronutrientes contra danos oxidativos. Além disto, deverá notar-se que o dano oxidativo base no DNA é um possível factor da etiologia do cancro, pelo que estudos nesta área são também desejáveis (Collins, 2004). O presente estudo revelou também que o aumento da concentração de Paraquato acrescentado a células HepG2 contribui para o acréscimo dos danos no DNA até ao ponto em que, provavelmente, as células começam a bombear o xenobiótico de novo para o meio de cultura diminuindo a quantidade de danos no DNA como forma de
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proteger a sua integridade. Este pequeno indício de um mecanismo de protecção contra compostos citotóxicos e genotóxicos coloca em hipótese a realização de estudos posteriores que o confirmem ou refutem mas que, mesmo assim, poderão elucidar a comunidade científica sobre aspectos como a importância das proteínas MDR na resistência das células cancerígenas às drogas quimioterapeuticas. Um outro tipo de estudos possíveis poderá debruçar-se sobre a forma como certos compostos de origem vegetal poderiam ser úteis, combinados com a quimioterapia, ao inibirem a acção das proteínas MDR, como demonstra o estudo de Li e colaboradores (2011). Esta é uma área ainda inexplorada cujo potencial poderá ser significativo.
Como anteriormente referido, deve ter-se em conta que as concentrações de Paraquato e o tempo de exposição aferidos neste estudo são válidos para a linha celular HepG2 com todas as características inerentes a uma linha celular de carcinoma hepatocelular, podendo estas características ser distintas ou até inexistentes noutras linhas celulares ou em células recentemente obtidas de uma origem in vivo.
Os ensaios do cometa são uma técnica que, sendo possível variar ou introduzir etapas ao protocolo base, permitem uma avaliação aprofundada e específica da acção de diferentes compostos ao nível do DNA. Os ensaios do cometa – FISH (hibridação in
situ fluorescente) utiliza sondas de cDNA ou oligonucleotidos que reconhecem
sequências de interesse, sendo úteis na avaliação das taxas de reparação especificas de um gene após a exposição a baixas doses a um agente que danifica o DNA visto que, permitem localizar cromossomas, regiões de cromossomas, classes de DNA ou genes específicos. Outra variante interessante é a exposição das células ao composto teste após a sua incorporação na agarose LMP e após a etapa de lise. Deste modo, a avaliação do efeito do composto ao nível do DNA é directa e não está dependente do metabolismo celular (Collins, 2004).
Concluindo, o presente estudo permitiu apurar:
O aumento da concentração de Paraquato contribui para o acréscimo dos
danos no DNA das células HepG2 até ao ponto em que mecanismos de protecção celular são activados contra uma toxicidade aguda;
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O aumento do tempo de exposição das células ao Paraquato nas
concentrações menores (1 e 1,5 µM) resulta no incremento do dano oxidativo;
A utilização de Paraquato é uma alternativa viável aos métodos usados
para a indução de dano oxidativo no DNA. Para as células HepG2 obtém-se o nível máximo de dano oxidativo após 4 horas de incubação ao Paraquato nas concentrações de 1 ou 1,5 µM;
O extracto bruto de folhas de Ginkgo biloba é capaz de aumentar o nível de
danos no DNA devido à presença de ácidos ginkgólicos;
Este extracto vegetal, em bruto, induz o acréscimo do dano oxidativo do
DNA ao longo do tempo e não manifesta o potencial antigenotóxico descrito em estudos científicos que utilizam extracto processado.
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