O uso de plantas medicinais acompanhou o Homem ao longo da sua história. Mais recentemente o benefício empírico destas plantas tem sido cientificamente comprovado ou refutado porque, apesar de se tratar de produtos naturais, isso não significa que sejam inócuos, devendo ser submetidos a vários ensaios clínicos e científicos que comprovarão se a sua toma está isenta de risco.
O extracto de folhas de Ginkgo biloba tem demonstrado, na maioria dos estudos, efeitos biológicos benéficos para a saúde humana, tais como, a inibição da produção de radicais de oxigénio, a captação de radicais livres, efeitos anti-lipoperoxidativos, redução de danos neuronais, redução da agregação plaquetária, acção anti-inflamatória, anti- tumoral e anti-envelhecimento (Chan et al, 2007). Mas, apesar de a maioria dos estudos demonstrar os efeitos quimioprotectores dos polifenóis presentes neste e noutros extractos de origem vegetal, existem também estudos que demonstram uma natureza dual destes compostos que podem actuar como pró-oxidantes (Babich et al, 2011). O estudo realizado pretendeu dar um modesto contributo para a compreensão do modo de acção do extracto de folhas de Ginkgo biloba ao nível do DNA, isto porque a informação relativa à genotoxicidade e tumorigenicidade destes produtos é limitada. Como previamente referido, a escolha das células HepG2 prendeu-se com diversos factores de entre os quais o facto de o fígado ser o principal órgão responsável pela biotransformação da maioria dos xenobióticos ingeridos. Muitos autores defendem ser fundamental que os compostos sejam avaliados relativamente à sua toxicidade hepática estimando-se in vitro se o fígado seria capaz de metabolizar o composto teste (Liu e Zeng, 2009).
Os resultados obtidos apontam para um aumento dos danos no DNA das células HepG2 quando expostas durante uma hora com extracto de folhas de Ginkgo biloba, algo que foi avaliado utilizando a técnica do Ensaio do Cometa. O nível de dano obtido está dependente da concentração de extracto utilizada: comparativamente ao ensaio controlo (Gb = 0 g/L) foi para concentração de 10 g/L que se verificou um aumento dos danos no DNA tanto para os ensaios sem tratamento FPG como para o ensaios em que se utilizou esta enzima. As concentrações de 0,5 e 5 g/L avaliadas não se repercutiram num aumento de nenhum dos dois tipos de danos analisados.
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Tendo por base a menor concentração de extracto de folhas de Ginkgo biloba analisada (0,5 g/L) pretendeu-se investigar de que modo a sua adição às células HepG2 poderia influenciar o DNA ao longo do tempo. Para tal realizaram-se ensaios do cometa ao fim de uma, 4 e 24 horas após a adição do extracto às células em cultura. Apurou-se que, ao nível das quebras de cadeia de DNA, não se verificaram alterações ao longo do tempo em estudo encontrando-se este valor ao nível dos ensaios controlo. O dano oxidativo foi o que aumentou significativamente atingindo-se um máximo após 4 horas de incubação. Das três possíveis respostas celulares à exposição a polifenóis: (a) stresse oxidativo moderado e despoletar dos sistemas de defesa antioxidante após uma exposição moderada, (b) subjugação dos sistemas de defesa antioxidante e indução da morte celular por apoptose após uma exposição intermédia a elevada e (c) subjugação das defesas antioxidantes celulares e dano oxidativo que conduz à morte celular por necrose após uma exposição muito elevada (Babich et al, 2011), pode pressupor-se que a que se verificou neste estudo sobre o efeito do extracto de Ginkgo biloba ao longo do tempo, foi a primeira, isto porque se verificou uma tendência de diminuição do dano oxidativo das 4 para as 24 horas, apesar de esta não ser significativa. O alargamento do tempo de exposição analisado poderia confirmar esta hipótese.
A natureza pró-oxidante do extracto de folhas de Ginkgo biloba verificada neste estudo através do ensaio do cometa foi já identificada em outros estudos que utilizam estratégias diferentes na avaliação do stresse oxidativo induzido às células tais como a avaliação do nível da glutationa, da peroxidação lipídica ou de enzimas antioxidantes celulares (Babich et al, 2011).
Alguns estudos demonstram que ocorre a geração de H2O2 no meio de cultura DMEM
quando este é suplementado com extracto de Ginkgo biloba. Os componentes do meio tais como sais inorgânicos, vitaminas e aminoácidos contribuem para a geração de ROS. (Babich et al, 2009). Reconhece-se também que o pH é um parâmetro importante uma vez que a instabilidade dos polifenóis em pH alcalino conduz à sua auto-oxidação causando a geração de ROS em meios de cultura modificados com os extractos vegetais (Babich et al, 2011).
Existem também estudos como o elaborado por Yeu e colaboradores (2000) que se debruçam sobre compostos únicos presentes no extracto de Ginkgo biloba, como a
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ginkgetina, demonstrando também a ocorrência de elevados níveis de ROS intracelulares em células de carcinoma cervical OVCAR-3.
A acção da quercetina (um ginkgoflavonóide) foi também estudada utilizando o ensaio do cometa demonstrando-se que esta danifica de modo significativo o DNA através de quebras nas cadeias do DNA e do aumento de 8-oxoGUA (Silva et al, 2002; Yamashita e Kawanishi, 2000).
O nível de danos no DNA obtido pode dever-se a um aspecto importante a ter em conta e que se refere ao facto de, neste estudo, se ter usado extracto bruto, isto é, sem qualquer processamento após a sua obtenção a partir das folhas da árvore. Deverá notar-se que os estudos científicos realizados no âmbito do extracto de folhas de Ginkgo biloba têm por base o extracto padrão EGb761 que é processado de modo a obter-se 24% de flavonóides glicosilados, 6% de terpenóides e 5 a 10% de ácidos orgânicos (Vasseur, et
al, 1994). Ou seja, os ácidos ginkgólicos que, pelas suas propriedades tóxicas, são
practicamente removidos dos extractos processados (Jaggy e Koch, 1997) estavam presentes no extracto utilizado neste estudo.
De acordo com vários estudos, os ácidos ginkgólicos presentes na Ginkgo biloba têm demonstrado propriedades citotóxicas, mutagénicas, carcinogénicas e genotóxicas (Liu e Zeng, 2009; Fuzzati et al, 2003; Hecker et al, 2002; Baron-Ruppert e Luepke, 2001; Koch et al, 2000; Westendorf e Regan, 2000; Siegers, 1999). Posto isto, existem orientação de várias autoridades reguladoras que requerem a remoção parcial dos ácidos ginkgólicos de extractos de Ginkgo biloba usados terapeuticamente de modo a obter-se uma concentração limite de, no máximo, 5ppm.
No estudo de Siegers (1999) o potencial tóxico dos ácidos ginkgólicos foi testado em várias linhas celulares humanas e de animais (I-407, HepG2, HaCat, LLC-MK2 e LLC- PK1) representando deste modo diferentes sistemas de órgãos. Tendo por base o teste IC50 verificou-se que os dois extractos de folhas de Ginkgo biloba padrão (com 2,2 e 3 ppm de ácidos ginkgolicos) foram significativamente menos citotóxicos que as fracções contendo ácidos ginkgólicos. Estima-se que o extracto bruto de Ginkgo biloba contenha 2,2% deste tipo de ácidos (Siegers, 1999).
Estudos demonstram que os ácidos ginkgólicos originam uma libertação de lactato desidrogenase (LDH) indicando que a sua actividade tem por base danos na membrana
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celular. Por sua vez o extracto padrão EGb761 não induz esta libertação mesmo em concentrações elevadas demonstrando não possuir propriedades citotóxicas. No entanto, inibe a proliferação celular (Heckeret al, 2002).
O estudo de Hecker e colaboradores (2002) demonstrou que os ácidos ginkgólicos exercem efeitos tóxicos complexos que, dependendo do tipo celular e da concentração utilizada, podem causar diferentes padrões de dano e culminar em morte celular por apoptose ou necrose.
Por sua vez, um estudo de Liu e Zeng (2009) demonstrou que a toxicidade dos ácidos ginkgólicos em células HepG2 foi superior à estimada em hepatócitos primários de ratos devido a diferenças no metabolismo de fase II. Estudos realizados em hepatócitos primários de rato demonstraram existir morte celular quando as células foram incubadas com ácidos ginkgólicos na concentração de 10 mg/L e quebras de cadeia e indução da proliferação celular em concentrações inferiores (0,1 a 3 mg/L) (Hecker et al, 2002). As concentrações utilizadas nos estudos referenciados são muito superiores às adicionadas às células HepG2 no presente estudo. Assim, ocorrendo um coerente aumento na citotoxicidade positivamente correlacionado com o aumento da concentração de ácidos ginkgólicos, a questão – concentrações de extracto de Ginkgo biloba tendo em vista uma posterior transição dos resultados obtidos in vitro para efeitos in vivo – é algo difícil de avaliar. As concentrações de Ginkgo biloba usadas no presente estudo não têm uma relevância fisiológica em termos de um organismo no seu todo, como aliás acontece na maioria dos estudos. Os testes realizados em células em cultura são, no entanto, a primeira etapa nos estudos de compostos possivelmente terapêuticos.
O estudo de Liu e Zeng (2009) revelou que a combinação de toma de ácidos ginkgólicos e fármacos como o Omeprazole (indutores das enzimas CYP1A e 3A) pode conduzir à biotransformação destes ácidos em compostos ainda mais tóxicos, tendo esta descoberta relevância ao nível da polimedicação em que os indivíduos combinam vários tipos de fármacos com suplementos com extracto de Ginkgo biloba vendido em farmácias, ervanárias e supermercados.
Por outro lado, os ácidos ginkgólicos já demonstram possuir acções benéficas como actividade moluscicida (controle de moluscos, como lesmas e caracóis) (Chen et al, 2007), antimicrobiana e funções antitumorais (Chen et al, 2008). Relativamente ao
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inibem o seu crescimento e são menos tóxicos que a Azitromicina (antibiótico) para células HFF (Hecker et al, 2002).
Desde a introdução do Paraquato como herbicida em 1962 que se especula acerca do seu mecanismo de citotoxicidade (Peter et al, 1992). Estudos demonstram que esta toxicidade ocorre via peroxidação lipídica (Tawara et al, 1996), dano oxidativo mitocondrial (Cochemé e Murphy, 2008) e danos no genoma (Peter et al, 1992). Em investigação científica o PQ é utilizado para aumentar os níveis do radical superóxido quando se pretende investigar o stresse oxidativo (Cochemé e Murphy, 2008).
Os danos pelo Paraquato podem ser induzidos directamente na molécula de DNA ou através da produção de radicais livres devida à forte peroxidação lipídica induzida. A peroxidação de lípidos polinsaturados dá origem a uma gama de substâncias que possuem o potencial de danificar o DNA. Estas substâncias incluem peróxidos lipídicos e espécies que contém electrões desemparelhados como os radicais alcoxil e peroxil (Martínez-Tabche et al, 2004; Burcham, 1998).
O potencial genotóxico do PQ tem sido estudado em diferentes organismos e linhas celulares desde 1970 revelando a indução de alterações cromossómicas e genotoxicidade. A acumulação de H2O2 gera a produção dos radicais hidroxilo
altamente tóxicos através da reacção de Fenton (Nicotera et al, 1985; Tanaka e Amano 1989) e consequentemente quebras na cadeia de DNA e degradação da desoxiribose (Salam et al, 1993; Martínez-Tabche et al, 2004). Também têm sido relatadas modificações na actividade de enzimas mitocondriais (Konstantinova e Russanov, 1999). Por outro lado, também existem estudos em que estas alterações não foram observadas (Ortiz et al, 2000).
No entanto, a genotoxicidade deste herbicida revela-se pouco estudada comparativamente ao que se sabe sobre os mecanismos pelos quais o Paraquato induz peroxidação lipídica e danos na mitocôndria. Posto isto, os resultados obtidos neste estudo tiveram pouco termo de comparação e a sua comprovação deveria ser feita com estudos posteriores usando outras técnicas de analise de danos no DNA.
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Os resultados obtidos neste estudo demonstraram o aumento significativo do dano oxidativo para as concentrações de Paraquato 1 e 1,5 µM às 4 e 24 horas de incubação o que era expectável visto que a metabolização deste composto na célula, como já foi referido, acarreta a produção de espécies reactivas de oxigénio. A pouca diferença entre ensaios com e sem tratamento enzimático FPG após 1 hora de incubação para todas as concentrações estudadas está de acordo com o estudo realizado por Dusinská e colaboradores, apesar de, neste estudo de 1998 os valores de percentagem de DNA na cauda serem superiores visto que as células utilizadas – macrófagos alveolares e células epiteliais tipo II – não possuirem os mecanismos de destoxificação presentes nas células HepG2.
O estudo de Martínez-Tabche e colaboradores (2004) demonstrou uma diminuição no nível de danos no DNA induzidos pelo Paraquato no último período de incubação (8 dias) provavelmente como resultado da reparação estimulada pela mutagénese. No presente estudo verificou-se uma tendência de diminuição (apesar de não significativa) no nível de dano oxidativo das 4 para as 24 horas de incubação das células para a concentração de 1 µM de Paraquato. A avaliação de uma exposição das células ao Paraquato alargada no tempo poderia esclarecer esta dinâmica celular.
Um dos resultados obtidos neste estudo e que não vai de encontro ao estudo de Dusinská e colaboradores (1998), em que com o aumento da concentração de Paraquato ocorre um concomitante aumento nos níveis de dano do DNA das células, é o facto de, aos 30 minutos de incubação, para a concentração PQ = 5 µM o nível de quebras de cadeia de DNA diminuir comparativamente à concentração PQ = 1,5 µM. Para o mesmo tempo, o dano oxidativo diminui de forma significativa de PQ = 1,5 µM para PQ = 2 µM. Uma explicação possível poderá ser a existência de proteínas de Multi-
Drug Resistance (MDR) nas células HepG2. As proteínas MDR são capazes de
bombear os xenobióticos para fora da citomembrana, usando a energia do ATP. Este mecanismo é complexo e envolve a sobrexpressão destas proteínas transportadoras de drogas quando as células são expostas a compostos tóxicos como o Paraquato. Apesar de as células utilizadas no estudo de Dusinská e colaboradores (1998) também expressarem este tipo de proteínas, este mecanismo deverá ser mais expressivo na linha celular HepG2 visto tratarem-se de células tumorais e serem células hepáticas (Gao et
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Interessante será também verificar que as concentrações de Paraquato utilizadas no estudo aqui apresentado e no estudo de Dusinská e colaboradores (1998) de modo a obter resultados significativos em termos de genotoxicidade são da ordem dos micromolar (µM) (10 µM é a concentração mais elevada do estudo de 1998 obtendo-se para esta concentração uma percentagem de DNA na cauda dos cometas na ordem dos 60%). No entanto, nos estudos sobre o mecanismo de toxicidade do Paraquato através da peroxidação lipídica e de danos na mitocôndria as concentrações utilizadas são significativamente superiores. Por exemplo, segundo o estudo de Peter e colaboradores (1992) em termos de peroxidação lipídica induzida por Paraquato a concentração de 2,5 mM é a concentração mínima para que os resultados comecem a ser significativos. Posto isto, a indução de genotoxicidade deverá ser alvo de maior interesse por parte da comunidade científica de modo a compreender-se melhor esta faceta da citotoxicidade induzida pelo Paraquato.
Vários compostos têm sido utilizados na indução de stresse oxidativo, nomeadamente o peróxido de hidrogénio (H2O2), o cloreto de cádmio (CdCl2), sulfato e cobre (CuSO4),
luz visível e poluentes ambientais em geral (Shukla et al, 2011). Mas muitos outros compostos têm sido estudados como potenciais indutores deste tipo de danos no DNA e o presente estudo propôs-se também a estudar de que forma o Paraquato poderia ser utilizado na indução do dano oxidativo. E, de facto, os resultados obtidos demonstram que este herbicida é capaz de induzir stresse oxidativo sem aumentar o nível de danos de cadeia quando as células são submetidas às concentrações de 1 ou 1,5 µM durante pelo menos 4 horas. É de salientar, no entanto, que estes resultados foram obtidos tendo por base um estudo feito em células HepG2 que, sendo células de carcinoma de fígado possuem enzimas de destoxificação, protectoras da célula em geral e do DNA em particular, que poderão estar presentes de forma menos significativa noutros tipos de células, pelo que a concentração utilizada e o tempo de exposição das células ao herbicida podem variar muito na obtenção dos mesmo resultados. O trabalho de Dusinská e colaboradores (1998) demonstra as diferenças que existem em termos de dano no DNA para as mesmas concentrações de Paraquato e os mesmos tempos de exposição mas utilizando dois tipos de células diferentes – macrófagos alveolares e pneumócitos.
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Pretendendo-se estudar um efeito quimioprotector do extracto de Ginkgo biloba, verificou-se que uma pré-incubação de 24 horas das células HepG2 com concentrações de 0,5 e 5 g/L de extracto de folhas de Ginkgo biloba acarretou um aumento do dano oxidativo do DNA quando estas foram submetidas ao tratamento com Paraquato 1 e 1,5 µM durante uma hora. O aumento deste tipo de danos no DNA comparativamente aos resultados obtidos para as mesmas concentrações e tempo de exposição ao Paraquato em células não pré-tratadas é substancial, sendo o extracto de Ginkgo biloba o pró- oxidante de maior destaque. A incubação com PQ, durante uma hora, não aumentou o nível de danos de DNA além daquele já previamente obtido para os ensaios com extracto bruto de Ginkgo biloba, 24 horas – não se verificou um efeito sinergético na indução de dano oxidativo quando o PQ é adicionado de forma consecutiva ao extracto. Os resultados obtidos na avaliação dos danos no DNA para a adição conjunta às células de extracto de Ginkgo biloba e Paraquato – diminuição significativa do nível de danos no DNA comparativamente aos danos obtidos na adição consecutiva destes compostos – pode indicar a activação de mecanismos de protecção das células. Muitos tipos de células e nomeadamente as células de carcinoma hepático HepG2 são dotadas de estratégias que permitem a sua sobrevivência, nomeadamente as proteínas MDR já mencionadas. Necessitando esta hipótese de ser corroborada, esta poderá ser uma das explicações que integrada noutras permitem perceber a biologia complexa da célula quando exposta a compostos citotóxicos.
Assim, apesar de a maioria dos estudos demonstrar uma faceta quimioprotectora dos compostos fenólicos existentes em produtos de origem vegetal (pelo que um dos possíveis resultados poderia ser que o extracto de folhas de Ginkgo biloba facilitasse a destoxificação do Paraquato e prevenisse a oxidação e mutação do DNA), os resultados obtidos neste estudo vão de encontro ao pequeno número de estudos que demonstram uma capacidade pró-oxidante deste extracto.
A um nível mais técnico pode fazer-se um apontamento relativamente aos ensaios cometa controlo em que as células HepG2 não foram sujeitas a nenhum tratamento, permanecendo todo o tempo em meio de cultura DMEM. Muitos autores defendem que um baixo nível de danos no DNA obtido nos ensaio cometa controlo são o melhor indicador de que as células estão vivas e capazes a facultar resultados fidedignos. Os
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ensaios cometa são mais fiáveis na avaliação da viabilidade celular (feita nas amostras antes de estas serem sujeitas aos diversos estudos) que o teste mais comummente utilizado – o teste de exclusão pelo azul de tripano – visto que neste teste as células podem captar o corante sem estarem mortas: este teste apenas testa a integridade da membrana celular (Collins et al, 2008).
A principal dificuldade encontrada ao longo da execução dos ensaios do cometa foi a perda dos géis. Esta situação ocorreu preferencialmente após a incorporação das células em agarose LMP e ocasionalmente durante as etapas de lise ou electroforese. A principal explicação apontada pelos investigadores tem sido o facto de, em atmosfera húmida, os géis não aderirem tão bem às lâminas de vidro. Uma das possíveis soluções é a substituição das lâminas por filme plástico para agarose (Gelbond®). Esta opção apesar de ser mais dispendiosa garante a aderência dos géis.
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