4. Resultados e discussão
4.2 Condições ótimas de hidrólise de quitosana para os coquetéis de Celulase e β-Glicosidase
No presente estudo, avaliou-se a imobilização de enzimas não-específicas presentes em dois coquetéis comerciais, com o objetivo de hidrólisar quitosana (celulase e β-glicosidase, evetualmente referidas como C e G, respectivamente) por adsorção e por ligações covalente. Entretanto, antes de se avaliar a imobilização, foi realizado um ensaio prévio para determinar as condições ótimas de hidrólise de quitosana por C e G. Além de permitir o máximo desempenho das enzimas, esse ensaio também foi importante para que houvesse uma padronização das unidades enzimáticas no processo de imobilização, parâmetro chave para analisar o sucesso do processo.
Portanto, as soluções das enzimas foram dispostas junto com a solução de quitosana nas condições de hidrólise previamente citadas e os resultados da atividade enzimática apresentada por elas estão dispostos na Tabela 4.2.
Capítulo 4 – Resultados e discussão 45
Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado Tabela 4.2. Atividade quitosanolítica de C e G em diferentes temperaturas e pH.
C (U/mL) G (U/mL)
pH/T 45 oC 55 oC 65 oC 45 oC 55 oC 65 oC 4,0 0,09 ± 0,05Ab 0,10 ± 0,02Ab 0,08 ± 0,01Ac 2,05 ± 0,01Aa 2,10 ± 0,05Aa 2,29 ± 0,17Aa 5,0 0,10 ± 0,01Ab 0,13 ± 0,07Aa 0,11 ± 0,03Bb 1,91 ± 0,07Ab 1,89 ± 0,00Ab 1,93 ± 0,16Ab 6,0 0,14 ± 0,02Aa 0,23 ± 0,03Aa 0,14 ± 0,06Aa 1,48 ± 0,06Ac 1,49 ± 0,01Ac 1,39 ± 0,01Ac
*As letras minúsculas diferentes representam atividades enzimáticas significativamente diferentes em pHs diferentes, em uma mesma temperatura para p ≤ 0,05, para cada coquetel.
** As letras maiúsculas diferentes representam atividades enzimáticas significativamente diferentes em temperaturas diferentes, em um mesmo pH para p ≤ 0,05, para cada coquetel.
Como pode ser observado, a temperatura não apresentou uma influência significativa em relação à expressão de atividade quitosanolítica pela amostra G e tão pouco para a amostra C. Não existem na literatura muitos trabalhos relacionando β-glicosidases com a hidrólise de quitosana, mas celulases são utilizadas em diversas temperaturas para a hidrólise de quitosana, o que corrobora o resultado (XIA; LIU; LIU, 2008). Portanto, a temperatura ótima de hidrólise para os dois coquetéis foi de 55 oC. Destaca-se que a escolha desse valor está em concordância com os resultados apresentados por ARAÚJO et al. (2016b).
Com relação ao pH, este apresentou uma influência significativa no desempenho das duas amostras. A amostra C apresentou suas maiores atividades no pH 6,0, enquanto a amostra G foi favorecida pelo pH 4,0. Portanto, essas condições foram seguidas para as hidrólises de quitosana ao longo do trabalho para cada um dos coquetéis.
É interessante ressaltar que a amostra G apresenta sempre uma atividade quitosanolítica maior em comparação com a amostra C, independente da temperatura e pH. Esse resultado é interessante pois a β-glicosidade, em geral, hidrolisa a celobiose e a parte não redutora da celulose.
4.3 Imobilização por adsorção
A adsorção é uma estratégia amplamente utilizada para purificação e imobilização de enzimas. As condições usadas no processo se modificam de acordo com cada enzima, tendo em vista que o processo é diretamente influenciado pela estrutura da referida proteína. A Tabela 4.3 ilustra os valores médios e os desvios, em porcentagem, para o rendimento (Y) e a atividade recuperada (ar) para as três amostras avaliadas no presente estudo. Destaca-se que todas as
enzimas utilizadas obtiveram sucesso ao serem adsorvidas na resina Streamline SP, porém em condições diferentes.
Isso se deve ao fato de serem enzimas diferentes, com tamanhos e conformações distintas. É importante mencionar que ambos os coquetéis C e G não possuem apenas um tipo de celulase/ β-Glicosidase, ou seja, trata-se de um conjuto de enzimas. Assim, por se tratar de uma mistura, a mudança na variável pH não apresentou uma influência clara para nenhuma das amostras, apesar de todas terem apresentado uma maior quantidade de proteínas com capacidade quitosanolítica precipitadas entre os pHs 4,0 e 4,8 (ver Figuras 6.1., 6.2. e 6.3. apresentada na seção “Apêndice”).
A Tabela 4.3. apresenta os resultados da imobilização da amostra C por adsorção. Observa-se que a atividade recuperada foi favorecida pelo nível inferior da razão enzima/suporte e pelo aumento do pH. A alta concentração de enzimas talvez tenha desfavorecido a atividade recuperada devido às interações causadas pela grande quantidade de enzimas adsorvidas no suporte, como já foi relatado na literatura (FERNANDEZ-LOPEZ et al., 2017). A diminuição do pH favoreceu o rendimento de forma discreta, o que pode ser atribuído ao fato da resina utilizada possuir grupos ligantes fortemente catiônicos, promovendo uma maior interação com os grupos carregados positivamente nas enzimas. De fato, ao simular os resultados como se fossem parte de um planejamento experimental 22 (ver Figura 6.4. na seção “Apêndice”), a carga enzimática apresenta um efeito mais expressivo em relação às respostas (positivamente para o Y e negativamente para o ar) frente ao pH. Portanto, a condição escolhida
Capítulo 4 – Resultados e discussão 47
Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado Tabela 4.3. Rendimento (Y) e atividade recuperada (ar) das amostras C, G e Q imobilizadas
por adsorção na resina Streamline SP.
Amostra Enzima/Suporte (U/gsuporte) pH Y (%) ar (%) ad(U/mL) C 25 5 91,52±0,21b 9,17±1,50a 0,21±0,03a 6 88,68±0,36c 9,72±0,65a 0,22±0,01a 50 5 94,99±0,56a 4,65±0,43b 0,22±0,02a 6 94,31±0,89a 5,51±0,63b 0,26±0,03a G 25 5 96,54±0,72b 55,55±4,08b 1,34±0,10c 6 96,09±0,02b 28,91±0,66c 0,69±0,02d 50 5 100,00±0,00a 62,35±0,67a 3,12±0,03a 6 100,00±0,00a 35,28±0,69c 1,76±0,03b Q 25 5 99,49±0,10a 7,99±0,96a 0,20±0,02a 6 99,27±0,08a 7,34±0,96a 0,18±0,02a 50 5 99,49±0,02a 3,77±0,63b 0,19±0,03a 6 99,46±0,09a 3,66±0,00b 0,18±0,00a
*Letras diferentes representam valores significativamente diferentes para p ≤ 0,05. As comparações foram realizadas para cada resposta diferente, de acordo com a enzima (amostras C, G ou Q) estudada.
Para a β-glicosidase, cujos resultados também estão apresentados na Tabela 4.3., a carga enzimática mais alta favoreceu o rendimento de 100%, enquanto que o efeito do pH no rendimento não foi significativo, conforme teste estatístico. A atividade recuperada foi favorecida pela maior carga enzimática, indicando que a resina Streamline possuia sítios ativos que favoreceram a adsorção das enzimas e que a concentração de enzimas/proteínas adsorvidas ao suporte não foi agente limitante entre a ligação dessas e o suporte. Romo-Sánchez et al., (2014) também observaram que a atividade enzimática das glicosidases só são desfavorecidas a altas concentrações de enzima na imobilização (> 200 μg/mL).
A atividade recuperada também foi favorecida pelo pH 5, resultado similar ao obtido por De Andrades et al. (2019), o que pode estar relacionado com o caráter fortemente catiônico da resina. É interessante notar que, apesar do pH não ter exercido grande influência na resposta Y, ele passa a ser de fundamental importância ao analisar a resposta ar (ver Figura 6.4. na seção
“Apêndice”). Os resultados obtidos também foram similares ao reportado por Ahmed et al. (2013), em que o melhor resultado para imobilização por adsorção de troca iônica foi com
rendimento de 72,2% e uma atividade recuperada de 31,71%, utilizando a resina Dowex 1x8 (pH 4,0). Destaca-se que no presente estudo, a melhor condição de imobilização da β- glicosidase foi com pH 5 e 50 U/gsuporte.
Em relação à amostra Q, obteve-se um excelente rendimento (maior que 99%), com um desempenho melhor do que o demonstrado na literatura, que foi em torno de 30% (KUROIWA et al., 2008). Nesse caso, o pH e a razão enzima/suporte não exerceram nenhuma influência no rendimento pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05), mas ao analisar o gráfico de Pareto (ver Figura 6.4. na seção “Apêndice”), o pH aparece com um efeito mais pronunciado do que a carga enzimática para esta resposta. No entanto, ao analisar a ar,tanto pelo teste de Tukey (p ≤
0,05) quanto por Pareto, o pH não possui influência significativa, ao contrário da carga enzimática, apresentando quase a metade da atividade recuperada no nível mais alto. Esse resultado pode estar relacionado com a mesma justificativa da celulase, com a grande quantidade de enzimas adsorvidas prejudicando o desempenho da atividade quitosanolítica, apesar de serem enzimas de baixa massa molecular.
4.4 Imobilização por ligações covalentes
O estudo da imobilização por ligações covalentes foi realizado para os três coquetéis enzimáticos, variando-se a carga enzimática e a concentração de glutaraldeído na preparação da sílica (ver Tabela 3.3). O glutaraldeído é responsável por fornercer os grupos aldeídos à sílica, e eles vão ser responsáveis por realizar as ligações covalentes com as enzimas (SONG; ALNAEELI; PARK, 2014). A Tabela 4.4 apresenta os valores médios e os desvios do rendimento (Y) e atividade recuperada (ar) para os três coquetéis enzimáticos.
A amostra C obteve altos valores de rendimento na imobilização por ligações covalentes, mas nenhum dos fatores apresentou efeito isolado sobre ele, apresentando na verdade um sinergismo entre eles, efeito observado também para a ar (ver Figura 6.5. na seção
“Apêndice”). O melhor resultado de imobilização se deu na maior concentração de glutaraldeído e menor concentração de enzima, o que pode implicar que uma maior concentração de grupos aldeídos no suporte e uma menor quantidade de enzimas adsorvidas se combinam para maximizar a atividade recuperada. Ao passo que, quando a carga enzimática aumenta, o valor da ar diminui para a metade, o que pode indicar impedimento estérico. Um
comportamento semelhante também foi observado por Jia et al. (2017), cujas celulases foram imobilizadas em agregados magnéticos e com ligações covalentes para hidrólise de material lignocelulósico. Eles obtiveram a concentração de 1% (v/v) de glutaraldeído como ótima, com
Capítulo 4 – Resultados e discussão 49
Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado valores superiores prejudicando o desempenho enzimático, o qual eles relacionaram com o fato do glutaraldeído também promover desnaturação. Logo, destaca-se que no presente estudo o melhor resultado para a celulase foi obtido com 25 U/gsuporte com a sílica tratada com 0,5 M de
glutaraldeído.
Tabela 4.4. Rendimento (Y) e atividade recuperada (ar) de C, G e Q imobilizadas em sílica-
gel por ligações covalente usando Glutaraldeído (Ga).
Amostra U/gsuporte %Ga Y (%) ar (%) ad (U/mL)
C 25 0,5 92,74±0,86b 16,26±2,31a 0,38±0,04b 1 96,48±0,052a 11,01±6,96a 0,27±0,17b 50 0,5 92,87±1,48b 8,48±1,33b 0,39±0,04b 1 91,37±0,41b 11,91±2,31a 0,54±0,10a G 25 0,5 100,00±0,00a 78,36±1,33b 1,96±0,26b 1 100,00±0,00a 46,72±6,30b 1,17±0,16c 50 0,5 84,71±1,69b 79,66±3,33a 3,37±0,09a 1 82,77±2,03b 88,66±6,81a 3,67±0,21a Q 25 0,5 99,71±0,09b 41,27±3,34a 1,03±0,08a 1 99,73±0,02b 37,02±3,85a 0,92±0,10ab 50 0,5 100,00±0,00a 16,34±2,18b 0,82±0,11ab 1 100,00±0,00a 14,23±2,12b 0,71±0,11b
*Letras diferentes representam valores significativamente diferentes para p ≤ 0,05.
Um comportamento diferente foi verificado com a β-glicosidase. Pode-se observar na Tabela 4.4. o decaimento do rendimento da imobilização à medida que a carga enzimática aumentou, atestando que os sítios ativos da sílica-gel já estavam saturados com 25 U/gsuporte. De
fato, a carga enzimática apresenta um efeito negativo significativo para o rendimento (ver Figura 6.5. na seção “Apêndice”). No entanto, quando a ar é analisada, é observado um
comportamento inverso e menos intenso no que concerne à variação dos tipos de sílica (com 0,5 e 1,0 M de glutaraldeído). No nível inferior (25 U/gsuporte), a atividade diminuiu com o
atividade aumentou e o rendimento diminuiu quando a concentração de glutaraldeído foi aumentada de 0,5 para 1 M. E foi constatado pelo gráfico de Pareto que, de fato, o efeito combinado das duas variáveis possui praticamente a mesma ordem de grandeza que a carga enzimática isolada, demonstrando um caráter sinérgico (ver Figura 6.5. na seção “Apêndice”). Tal comportamento já foi relatado na literatura, onde às vezes a mudança de um fator pode influenciar de forma oposta o rendimento e a atividade enzimática no processo de imobilização (CHAN et al., 2019). Portanto, a melhor condição para a imobilização de β-glicosidase por ligação covalentecovalente foi utilizando a sílica com 1% de glutaraldeído com uma carga enzimática 50 U/gsuporte, o qual apresentou resultados similares com o da literatura, como no
estudo realizado por Ahmed e colaboradores (2013), onde o melhor resultado de imobilização por ligações covalentes apresentado foi em esponja pré-tratada apenas com uma solução contendo 1.25% (v/v) de glutaraldeído (pH 4,0), obtendo um rendimento de aproximadamente 95,00% e uma atividade recuperada de aproximadamente 60,00%.
Com relação à quitosanase, altos redimentos foram alcançados em todas as condições, em alguns casos alcançando 100%, portanto as mudanças dos parâmetros não tiveram uma influência significativa neste aspecto em relação ao teste de Tukey, apesar da carga enzimática apresentar um influência significativa para ambas as respostas (ver Figura 6.5. na seção “Apêndice”). Entretanto, pode-se notar que a alta carga enzimática desfavoreceu a ar e alta
concentração de glutaraldeído não exerceu influência sobre o desempenho da imobilização. Um resultado similar foi obtido por Song et al. (2014), que utilizaram quitosanase comercial produzida por Streptomyces griseus. No presente estudo, o resultado foi atribuído à alta densidade de proteína no suporte, gerado tanto pelo aumento da carga enzimática quanto pelo grande número de grupos aldeídos disponíveis, que produziu impedimentos estéricos/difusionais. Portanto, nesse caso, os níveis mais altos das variáveis favoreceram a imobilização da enzima no suporte, mas não foram benéficas para a atividade quitosanolítica. Assim, a melhor condição de imobilização da quitosanase foi com 25 U/gsuporte com a sílica
tratada com 0,5% de glutaraldeído.