Estabilidade à mudança de pH

Por serem proteínas, e assim composto anfóteros, as enzimas são estruturas altamente carregadas eletricamente, portanto a mudança de pH durante os processos industriais podem afetar diretamente o desempenho desses biocatalizadores. Quando se está lidando com a imobilização, o pH torna-se um fator ainda mais essencial pois a sua mudança pode implicar na desagregação da enzima pelo suporte (RODRIGUES et al., 2013). Portanto, é importante avaliar se as enzimas avaliadas no presente estudo são estáveis em uma grande faixa de pHs e se as estratégias de imobilização melhoram a estabilidade destas.

A estabilidade da amostra C para diferentes pHs é mostrada na Figura 4.6. Pode-se observar que a enzima apresentou comportamentos diferentes para cada pH em seu estado livre e nas formas imobilizadas. Assim como aconteceu com o ensaio de temperatura, a amostra C já se apresentava muito estável para pHs diferentes na sua forma livre. Nos pHs 4,0 e 5,0, o processo de adsorção diminuiu a estabilidade da enzima quando comparado com a forma livre. Uma hipótese, para esse comportamento, é de que tais pHs tenham promovido a dessorção da enzima do suporte. Para o pH 4,0, a estratégia de imobilização por ligações covalentes resultou em uma estabilidade enzimática estatisticamente igual à da forma livre, mas para pH 5,0, as ligações covalentes melhoraram significativamente a estabilidade. Pode-se atribuir a piora do desempenho das amostras imobilizadas por adsorção nos pHs 4,0 e 5,0 com a proximidade com o pI das enzimas, o que pode provocar a sua dessorção (ver Figura 6.1.).

No pH 6,0, ambas as imobilizações melhoraram a estabilidade, sendo a estratégia de imobilização por ligações covalentes ligeiramente mais benéfica do que a por adsorção. O mesmo ocorreu no pH 7,0, mas nesse caso, a estratégia de imobilização por adsorção foi muito melhor do que a por ligações covalentes. Finalmente, no pH 8,0, a celulase livre apresentou uma elevada estabilidade e foi estatisticamente igual à enzima adsorvida e superior à enzima imobilizada por ligações covalentes. Embora no estudo de Jia et al., (2017) o processo de imobilização das celulases tenha sido por ligações covalentes, o sistema de ligações covalentes apresentou um comportamento bastante semelhante, alcançando o seu pico de estabilidade no pH 5,0, decaindo drasticamente até o pH 8,0.

Destaca-se que outros estudos na literatura mostraram que a forma livre pode ser mais estável que o complexo imobilizado em alguns pHs e temperaturas (BILAL et al., 2016; CHAN et al., 2019; SINGH; KAYASTHA, 2014). O estudo de Yu e colaboradores (2012), onde celulases comerciais foram imobilizadas por ligações covalentes no polímero Eldragit S100,

observaram que nos pHs 3,0 e 4,0 a forma livre da enzima se mostrou mais estável que a imobilizada, estando de acordo com os resultados encontrados neste estudo. O pH com máxima estabilidade da celulase imobilizada por ligações covalente foi o 5,0, sendo também o máximo encontrado em outros trabalhos da literatura (HOSSEINI et al., 2018; YU et al., 2012)

Figura 4.5. Perda de atividade quitosanolítica da amostra C nos pHs 4, 5, 6, 7 e 8 após 3 h em

temperatura ambiente nas formas livre (cinza escuro), imobilizada por adsorção (cinza médio) e imobilizada por ligações covalentes (cinza claro). Letras maiúsculas diferentes representam

valores que são significativamente diferentes em p ≤ 0,05 da mesma estratégia de imobilização para diferentes enzimas. Letras minúsculas diferentes representam valores

significativamente diferentes em p ≤ 0,05 entre as três formas de uma mesma enzima.

A estabilidade de G para diferentes pHs é mostrada na Figura 4.7. Pode-se observar que esta amostra é altamente estável em sua forma livre (provavelmente devido a estabilizantes presentes na formulação do coquetél), o que aparenta ser uma característica de β-glicosidase, já que é um comportamento que se repete na literatura (AHMED et al., 2013; ROMO-SÁNCHEZ et al., 2014). O processo de imobilização, neste caso, foi desfavorável para sua estabilidade. Embora a estratégia de imobilização por adsorção tenha apresentado um melhor desempenho do que a por ligações covalentes, ambas promoveram resultados iguais ou menores do que a própria enzima livre.

Romo-Sánchez et al., (2014) também reportaram em seu estudo que a β-glicosidase após imobilização não demonstrou melhora na estabilidade frente ao pH sendo a forma livre

Capítulo 4 – Resultados e discussão 57

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado muito estável. Ou seja, resultados semelhantes ao obtido no presente estudo. Assim como aconteceu com a amostra C, a estabilidade da amostra imobilizada por adsorção aumenta com o aumento do pH, o que pode ser atribuído a uma menor instabilidade do sistema, tendo em vista o distanciamento do ponto isoelétrico das proteínas quitosanolíticas (ver Figura 6.2. na seção “Apêndice”). Yan et al. (2010) imobilizou β-glicosidases em diferentes partículas sólidas por adsorção (pH 5,5) e observaram que a forma livre da enzima também apresentou uma estabilidade superior a diferentes pHs do que as formas imobilizadas. Por sua vez, β- glicosidases imobilizadas por ligações covalentes também apresentaram comportamento semelhante às enzimas livres nos testes de estabilidade a mudança de pH, apesar das imobilizadas possuirem uma atividade recuperada levemente maior do que as amostras livres (VAZQUEZ-ORTEGA et al., 2018).

Figura 4.6. Perda de atividade quitosanolítica de G nos pHs 4, 5, 6, 7 e 8 após 3 h em

temperatura ambiente nas formas livre (cinza escuro), imobilizada por adsorção (cinza médio) e imobilizada por ligações covalentes (cinza claro). Letras maiúsculas diferentes representam

valores que são significativamente diferentes em p ≤ 0,05 da mesma estratégia de imobilização para diferentes enzimas. Letras minúsculas diferentes representam valores

significativamente diferentes em p ≤ 0,05 entre as três formas de uma mesma enzima.

A estabilidade da amostra Q para diferentes pHs é mostrada na Figura 4.8. Observa-se que essa enzima na forma livre apresentou resultados compatíveis com os encontrados por Araújo e colaboradores (2016b). É interessante destacar que na sua forma livre, a amostra

apresenta sua maior estabilidade no pH 6,0, o que não acompanha a tendência das amostras imobilizadas, cuja maior estabilidade se dá no pH 7,0.

No pH 4,0, ambos os métodos proporcionaram resultados semelhantes, mas nos pHs 5,0, 7,0 e 8,0, o sistema com imobilização por ligações covalentes teve um desempenho muito superior quando comparado ao sistema por adsorção. Nesse último sistema, a enzima foi mais estável apenas no pH 6,0, mas a diferença da enzima com ligações covalentes foi menor em relação aos demais sistema. Assim, a imobilização se mostrou importante para melhorar a estabilidade da quitosanase para a mudança do pH. Wang et al. (2018) também obtiveram uma melhora na estabilidade ao pH com a imobilização por ligações covalentes para todas os pHs testados. O coquetel apresenta os valores de potencial zeta mais próximos do 0 mV nos pHs da extremidade e maior atividade quitosanolítica do precipitado, indicando que o pI das enzimas está em pHs próximos a 4 e 7 (ver Figura 6.3 na seção “Apêndice”).

Portanto, esta queda do desempenho pode indicar a dessorção e precipitação das enzimas nos pHs mais baixos. A queda de desempenhos de todas as enzimas imobilizadas por adsorção no pH 8,0 pode estar relacionada com o caráter catiônico da resina utilizada que é enfraquecido com a maior concentração de íons OH-. É importante frisar que nos pHs intermediários, 5, 6 e 7, o processo de imobilização oferece uma estabilização de praticamente 100%, enquanto que a enzima livre apresenta menos de 60% da sua atividade inicial.

Capítulo 4 – Resultados e discussão 59

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado Figura 4.7. Perda de atividade quitosanolítica da Q nos pHs 4, 5, 6, 7 e 8 após 3 h em

temperatura ambiente nas formas livre (cinza escuro), imobilizada por adsorção (cinza médio) e imobilizada por ligações covalentes (cinza claro).Letras maiúsculas diferentes representam

valores que são significativamente diferentes em p ≤ 0,05 da mesma estratégia de imobilização para diferentes enzimas. Letras minúsculas diferentes representam valores

significativamente diferentes em p ≤ 0,05 entre as três formas de uma mesma enzima.