Estabilidade térmica

A temperatura é um parâmetro chave para processos enzimáticos sendo, portanto, de suma importância avaliar a perda de atividade enzimática em altas temperaturas para atestar a viabilidade de se utilizar uma dada enzima em processos operando com temperaturas mais elevadas. Caso a enzima não seja estável, a imobilização é um artifício para melhorar essa

Capítulo 4 – Resultados e discussão 51

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado característica (DE ALBUQUERQUE et al., 2018). Há ainda a possibilidade da imobilização desfavorecer a estabilidade térmica, resultando em uma menor conservação da atividade enzimática quando comparado com a enzima livre (ROMO-SÁNCHEZ et al., 2014).

No presente estudo as três amostras foram submetidas à temperatura degradante de 70

o_{C nas suas formas livre e nas melhores condições de imobilização por adsorção e ligações}

covalentes. Assim, tempos de até 1 h foram avaliados. Os resultados referentes às amostras de celulase estão presentes na Figura 4.2.

Figura 4.2. Perda da atividade quitosanolítica a 70 o_{C da celulase em seu estado livre (linha}

contínua), imobilizada por adsorção (linha tracejada) e imobilizada por ligações covalentes (linha pontilhada) em função do tempo.

Durante o teste de estabilidade de temperatura, a amostra C apresentou uma boa estabilidade em todas as amostras, inclusive na sua forma livre mantendo-se uma atividade maior que 60% após uma hora de reação. As duas estratégias de imobilização proporcionaram mais estabilidade à enzima do que a sua forma livre depois dos 60 min. A enzima imobilizada pelo método de ligações covalentes apresentou um melhor desempenho no geral, apesar de ter apresentado uma perda de atividade similar à da enzima livre no primeiro minuto. O método de imobilização por adsorção resultou em um melhor desempenho do que a enzima livre até os dez minutos, mas após esse período, ambos os sistemas apresentaram um comportamento semelhante.

Portanto, ao final do ensaio, a enzima livre apresentou uma boa conservação da atividade quitosanolítica (57,70 ± 1,09%), no entanto as imobilizações melhoram ainda mais a

estabilidade (64,11 ± 3,48% para a adsorção e 71,43 ± 11,54% para as ligações covalentes), e os resultados estão de acordo com o encontrado na literatura, com cerca de 70% da atividade enzimática preservada (AHMED et al., 2018; AHMED; CHANG; TSAI, 2017). Yu e colaboradores (2012) obtiveram resultados semelhantes com imobilização por ligações covalentes de celulases, onde as enzimas imobilizadas apresentaram uma cerca de 75,00% da atividade enzimática inicial, enquanto a livre preservou cerca de 55,00% da atividade inicial, depois de 1 hr de incubação a 70 oC. Em outro estudo, a celulase imobilizada em carragenina por ligações covalentes apresentou pouca diferença na estabilidade térmica a 70 oC em relação à sua forma livre (YUAN et al., 2016).

Os resultados da estabilidade térmica da amostra G estão apresentados na Figura 4.3. Pode-se observar que, apesar desta enzima ser uma enzima comercial, a forma livre teve uma queda considerável na atividade quitosanolítica após 20 min e ambas as estratégias de imobilização melhoraram a estabilidade. No início do ensaio, até 10 min, todos os sistemas apresentaram um comportamento semelhante, mas depois eles passaram a se diferenciar. O sistema com ligações covalentes apresentou um bom resultado depois de 60 min, com mais de 50% da atividade enzimática preservada.

A literatura destaca que sistemas imobilizados por ligações covalentes vêm se apresentando como boa alternativa para melhorar a estabilidade térmica da β-glicosidase (DE ANDRADES et al., 2019; SHUDDHODANA; GUPTA; BISARIA, 2018). Porém, o método de imobilização por adsorção foi o que teve o melhor desempenho entre os analisados, apresentando mais de 80% da atividade inicial preservada. Ahmed et al., (2013) imobilizou β- glucosidases por ligações covalentes em esponja e obteve que a 70 oC depois de 60 min, a forma imobilizada preservou 9.1% da atividade enzimática inicial enquanto a forma livre não apresentou nenhuma atividade.

Capítulo 4 – Resultados e discussão 53

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado Figura 4.3. Perda da atividade quitosanolítica da amostra G em seu estado livre (linha

contínua), imobilizada por adsorção (linha tracejada) e imobilizada por ligações covalentes (linha pontilhada) durante 60 minutos a 70 oC.

A Figura 4.4 apresenta os resultados do teste de estabilidade térmica da amostra Q. Pode-se observar que a enzima livre teve uma grande perda de atividade no primeiro minuto, mas apesar de ser um coquetel enzimático não-comercial, a enzima apresentou uma boa estabilidade ao final dos 60 min, retendo por volta de 40% de sua atividade inicial. No entanto, os sistemas imobilizados aprimoraram ainda mais a estabilidade, conservando mais de 70% da atividade inicial para as enzimas com a imobilização por ligações covalentes e por adsorção, sendo a última levemente mais estável. Há relatos na literatura de que a partir de 30 oC já há perda de atividade enzimática para quitosanases (QIN et al., 2019), então o fato de que as duas técnicas de imobilização promoveram uma estabilidade adequada à quitosanase em uma condição de desnaturação (70 oC) é notável. El-Sayed (2017) imobilizou quitosanases em em quitina por ligações covalentes e obteve um resultado inferior em termos de estabilidade térmica dos obtidos neste trabalho, tendo em vista que o sistema imobilizado preservou apenas cerca de 30% da atividade inicial e a enzima livre apresentou 0% da atividade inicial após 60 min encubados a 70 oC.

Figura 4.4. Perda da atividade quitosanolítica da amostra Q em seu estado livre (linha

contínua), imobilizada por adsorção (linha tracejada) e imobilizada por ligações covalentes (linha pontilhada) durante 60 minutos a 70 oC.

A Tabela 4.5. indica os tempos de meia vida calculados para as formas livre e imobilizadas das amostras. É importante notar que, como a maioria dos sistemas não alcançaram a meia-vida no tempo do experimento, os t1/2 foi calculado através da extrapolação,

considerando o comportamento de uma cinética de primeira ordem. Apesar do resultado final do teste de estabilidade térmica não ter apresentado diferença estatística para a amostra C, na Figura 4.5., o t1/2 aumentou consideravelmente, dobrando com as ligações covalentes. A

amostra G apresentou resultados melhores dos que encontrados na literatura, por exemplo, Ahmed et al., (2013) reportaram um aumento de 49,5 para 56,8 min para enzimas imobilizadas por ligações covalentes. A amostra Q também apresentou uma melhora considerável no t1/2.

Tabela 4.5. Tempo de meia-vida (t1/2) em minutos das amostras enzimáticas nas diferentes

formas estudadas

Amostra/Estado Livre Adsorvida Ligações covalentes

C 86,64 99,01 173,27

G 36,48 138,62 63,00

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