XVIII. ANÁLISE DA BIOMASSA MICROBIANA EM CARBONO: MÉTODO DE FUMIGAÇÃO-EXTRAÇÃO M = m 1 => 0 ,4 = m 1 => 39 ,21 g MolxV(L) 98 ,02 x1 d = m => 1,835 = 39.21 => V = 39.21 => 21,4m L V V 1,835 2 1 ,4 --- 96% X --- 100% X = 2 2 ,3m L
5. ( NH4)2Fe(S04)2 x 6H20 3 3 ,3 m M : pesar 13 ,05 36g de sulfato ferroso amoniacal PA e dissolver em 1 litro de solução de ác. sulfúrico a 0 ,4 molar, em balão volum étrico.
M = m 1 => 0 ,0 3 3 3 = m, => 13,0536g MolxV(L) 392x1
6. H2S 0 4/H 3P 04 (2:1): medir 1 50m L de ácido fosfórico concentrado, em uma proveta e 300m L de ácido sulfúrico concentrado, em uma outra proveta, obtendo-se uma m istura total de 450m L.
OBS: o ác. fosfórico deve ser adicionado sempre antes do ác. sulfúrico.
7. Indicador Ferroina: pesar 1 ,4 8 5 g de 0-fenantrolina monohidratada, 0 ,6 9 5 g de sulfato ferroso heptahidratado e, num balão volum étrico, dissolver em 100mL de água destilada.
P adronização de S ulfato Ferroso A m o n ia c a l 0 ,0 3 3 3 m o lar
Pipetar 3m L de solução de K2Cr20 7 a 0 ,0 6 6 7 molar em um erlenmeyer de 125m L, 50m L de água destilada, 1 5ml_ de ác. sulfúrico concentrado e 4
INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO
gotas de indicador ferroina. Procede-se a titu la çã o com su lfa to ferroso amoniacal, utilizando-se bureta de 50ml_.
Determ ina-se o ponto final quando a solução passar de verde para verm elho. NR = V mL de K2Cr20 7 x Molaridade H2S 0 4 V mL de (NH4)2Fe(S02) x 6H 20 V, = 3 5 ,6m L V 2 = 3 5 ,7 m L média = 3 5 ,6 5 m L NR = 3 x 0 .4 => NR = 0 ,0 3 3 7 (normalidade real) 3 5 ,6 5 fc = NR => 0 ,0 3 3 7 => 1,01 2 (fator de correção) NT 0 ,0 3 3 3
Extração de solos com K2S 0 4 a 0 ,5 M o lar
Ao pesar o solo, acrescenta-se a umidade nele encontrada, procedendo- se da seguinte maneira, considerando que a umidade encontrada foi de 5,5 9% , temos:
25 + 5 .5 9 x 25a = 26 ,40 g 100
Neste caso, pesar 2 6 ,4 0 g de solo ao invés de 25g descrito no método.
Fumigação do solo
Pesar 25g de solo, acrescido da quantidade relativa à umidade, em um béquer de 100m L e colocar num dessecador forrado com papel de filtro umedecido com água destilada. No centro do dessecador colocar um béquer
XVIII. ANÁLISE DA BIOMASSA MICROBIANA EM CARBONO: MÉTODO DE FUMIGAÇÃO-EXTRAÇÃO
co n te n d o cerca de 25 m L de c lo ro fó rm io lavado (livre de etanol), para fum igação. Fazer vácuo por alguns m inutos e deixar no escuro por 24h.
Após esse período, evacuar todo o vapor de clorofórm io, fazendo-se sucessivamente vácuo e entrada de ar, por aproxim adam ente 6 vezes, sempre dentro de uma capela com exaustão. Transferir os solos contidos nos béqueres para frascos plásticos com tampa rosqueável, adicionar 100m L de solução aquosa de K2S 0 4a 0,5 molar. A gitar por 30 m inutos em mesa orbital, deixar decantar e filtrar o sobrenadante sobre papel de filtro W hatm an n° 42. 0 extrato pode ser armazenado em geladeira até sua utilização para análise (nunca além de duas semanas).
Solo IMão-Fumigado
Pesar 25g de solo, acrescido de quantidade relativa à umidade, em béquer de 100m L e proceder diretam ente à extração com solução aquosa de K2S 0 4 a 0 ,5 molar agitando-se por cerca de 30 m inutos em agitador de mesa orbital, deixar decantar e filtra r o sobrenadante. O extrato pode ser armazenado em geladeira até a sua análise.
Obs.: a. Para obter uma melhor separação do sobrenadante, pode-se usar uma
centrífuga.
b. Se o solo é muito rico em MO, aumentar a proporção entre o solo e o extrator.
Biomassa microbiana em carbono pelo método de oxidação com dicromato
(Anderson & Ingram, 1993).
Na presença de ácido forte, a matéria orgânica é oxidada e o crômio (+ VI) é reduzido ao crômio ( + III). O dicrom ato remanescente é quantificado por titulação.
INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO
- Acrescentar 2mL de dicrom ato de potássio 66 ,7m M e 1 5mL de ácido sulfúrico/fosfórico (2:1).
- Efetuar a digestão ácida, colocando os tubos com pequenos funis nas bordas para proporcionar o refluxo, em bloco digestor por 30 m inutos à 100°C.
- Após esse período, deixar esfriar e transferir o volume dos tubos para um Erlenmeyer de 125ml_, lavar os tu b o s com porções de água destilada e com pletar o peso até 50 gramas com água destilada.
Obs.: Se o laboratório possuir proveta de 50m L calibrada e aferida, poderá
utilizar esta, com pletando o volum e até 50m L em vez de 50 gramas. - Adicionar 7 gotas de indicador ferroína e titu la r com sulfato ferroso
amoniacal padronizado utilizando bureta de 50mL.
- A solução inicial é verde e, à medida que se vai adicionando o titula nte , ela passa a azul-claro e o ponto final é determ inado pelo aparecimento da coloração vermelho-intenso.
Obs.: As alíquotas do extrato e das soluções são medidas com pipetas
volum étricas.
Cálculo da biomassa de carbono em solo (Vance et al., 1 987; Joergensen,
1996).
Fórmula usada para concentração (|ig m L'1): - [(H-S)/C]x[(M xD/A)xEx1000]
onde:
H = vol. (mL) branco quente
S = vol. (mL) sol. sulfato ferroso consum ido pela amostra C = vol.(mL) branco frio
M = molaridade do dicrom ato consum ido
XVIII. ANÁLISE DA BIOMASSA MICROBIANA EM CARBONO: MÉTODO DE FUMIGAÇÃQ-EXTRAÇÃO
D = vol. (mL) do dicrom ato adicionado a mistura A = vol. (mL) da alíquota do extrato
E = conversão de Cr + 6 para Cr + 3
Fórmula usada para concentração (|ig gsolo 1): = C(ug/ml) x [K/IDW + W)]
onde:
K = vol. de extração DW = peso seco W = % de água
Fórmula para cálculo da Biomassa em carbono (^ig gsolo '): = Ec(F-NF)/0.38
onde:
Ec = a diferença entre a concentração em ju.g gso lo1 do Fumigado e do Não- fum igado
Observações:
- Durante a estocagem da solução em geladeira, antes da análise, podem form ar precipitados brancos de Ca S 0 4, especialmente se a solução for armazenada em freezer. Nessa situação, não é necessário dissolver o precipitado, pois este não interfere no processo de análise.
- 0 teor da umidade no solo interfere na análise. Em solos m uito secos, o cloro fórm io afeta pouco os m icrorganism os. Inclusive, a atividade enzimática e, conseqüentemente, a auto/ise é mais lenta nesses solos (Sparling & W est, 1989; Sparling et al., 1990).
INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO ---
R EFER ÊN C IA S B IB LIO G R Á FIC A S
ANDERSON, J .M .; INGRAN, J.S .I., ED. Tropical soil biology and fertility: a handbook of methods. W a llingford: CAB International, 1993.
JOERGENSEN, R.G. The fum igation-extraction method to estimate soil microbial biomass: calibration o f th e kec value. Soil Biology and Biochemistry, v .28, p .25-31, 1996.
M A N A H A N , S.E. The G eosphere and geoche m istry. In: STANLEY E.; M A N A H A N , S.E., ed. Environmental chemistry. 6.ed. Boca Raton: CRC Press, 1994. p.433-458 .
PICCOLO, A . ed. Humus substances in terrestrial ecosystems. A m sterdam : Elsevier Science, 1996.
POWLSON, D .S.; JENKINSON, D.S. The e ffe c ts of biocidal treatm ents on metabolism in soil. II. Gamma irradiation, autoclaving, air-drying and fumigation w ith chloroform or m ethyl bromide. Soil Biology and Biochemistry, v .1 9, p.1 7 9 -1 8 8 , 1976.
SIQUEIRA, J .O .; MOREIRA, F.M .de S.; GRISI, B.M.; HUNGRIA, M .; ARAÚJO , R.S., ed. Microrganismos e processos biológicos do solo- perspectiva ambiental. Brasília: Embrapa-SPI, 1 9 9 4 . p .40-41.
SPARLING, G.P.; W EST, A .W . Im portance o f soil water content when estim ating soil microbial C, N and P by the fu m ig a tio n -e xtra ctio n m ethod. Soil Biology and Biochemistry, v .21, p.245-253 , 1989.
SPARLING, G .P.; FELTHAN, C .W .; R eynolds, J .; W est, A .W .; Singleton, P. Estim ation o f soil microbial C by fum igation-e xtra ction m ethod: use on soils of high organic matter content, and a reassessm ent o f th e kEC-fa cto r. Soil Biology and Biochemistry, v .22, p .301 -307, 1990. VANCE, E.D.; BROOKES, P.C.; JENKINSON, D.S. An extraction method for measuring soil microbial
biom ass C. Soil Biology and Biochemistry, v .1 9, p.703-707, 1987.
---XIX . DETERMINAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS DE ORIGEM MIC R O BIAN A E SUA IMPORTÂNCIA NA ESTRUTURAÇÃO DO SOLO