René Peter Schneider
Introdução
O conhecim ento da fração de m icrorganism os fisio lo g ica m e n te ativos de uma população microbiana em am bientes naturais é uma das inform ações mais im portantes em ecologia m icrobiana. Enquanto que os m é todo s de contagem total de células microbianas por meio de fluo rocrom o s, com o por exemplo, a acridina laranja ou DAPI ( 4 ' ,6 '-d ia m id in o -2 -p h e n ylin d o l) estão r e la tiv a m e n te bem e s ta b e le c id o s , a d e te r m in a ç ã o do n ú m e ro de m icrorganism os ativo s está sujeita a m u ita s in ce rte za s. P rim eiram e nte, deve-se definir o que poderia ser considerado um m icrorganism o ativo para depois v e rific a r se os m é todo s u tiliz a d o s para a d e te rm in a ç ã o d e ste s
INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO
organism os são adequados ou não. Em term os de molécula, a atividade microbiana consiste em uma seqüência de reações químicas coordenadas, que permitem ao organismo gerar energia, biomassa ou liberação de alguma substância ao meio ambiente. O resultado desta atividade é a transform ação de substâncias. A atividade metabólica pode resultar na produção de biomassa, com ou sem divisão de células, na produção de algum metabólito ou na mera s o b re v iv ê n c ia do o rg a n is m o , ca ra cte riza d a pela m a n u te n çã o de sua integridade física e fisiológica, mas sem alteração da quantidade de biomassa por célula ou mesm o com redução do valor deste parâm etro. No meio am biente, to d a s estas m anifestações de ativid ade m icrobiana ocorrem simultaneamente, sendo que a grande maioria dos organismos se encontram em estado de senescência, tam bém denominado "viável, mas não cultivável". Somente pequena parte das células se encontra na fase de crescim ento, que depende da disponibilidade de suprim ento adequado de nutrientes. Este suprimento pode variar dependendo da sazonalidade, do horário do dia, ou mesmo de processos mais aleatórios, como o contato do microrganismo com e x c re m e n to s ou m e sm o c a d á v e re s . A lé m d is s o , gra n d e p a rte dos m icrorganism os no meio am biente (solo em particular) vive associada a superfícies na form a de biofilm es.
A diversidade de com postos orgânicos do meio ambiente que pode ser utilizada por m icrorganismos é enorme devido ao papel desses organismos na reciclagem de nutrientes. A análise de amostras ambientais por meio de m étodos de determ inação de bactérias em am ostras am bientais, cujos organismos dependem da formação de colônias em meios de cultura sólidos, muitas vezes, produzem resultados inferiores por várias ordens de grandeza em relação à con tag em to ta l de m icro rga nism o s. O baixo núm ero de microrganismos ativos nestes meios ocorre devido aos seguintes fatores:
- somente pequena parte dos microrganismos presentes no meio ambiente está na fase de crescimento;
- m uitos organism os no meio ambiente têm crescim ento lento. Sua detecção demandaria tem pos de incubação de várias semanas, com
XIV. DETERMINAÇÃO DE MICRORGANISMOS METABOLICAMENTE ATIVOS EM AMBIENTES NATURAIS
as colônias de crescim ento mais lento sendo encobertos por colônias de crescimento mais rápido;
- a grande diversidade metabólica dos m icrorganismos do meio ambiente dificulta sua replicação nos meios de cultura.
Uma quantificação dos m icrorganism os ativos em um ambiente mais realista pode ser feita com m étodos de identificação direta das bactérias ativas, como por exemplo a incubação de m icrorganismos com substratos cuja redução em algum ponto da cadeia respiratória produz com postos coloridos ou detectáveis por fluorescência. Os indicadores citoquím icos mais usados nestas medições são derivados de sais de tetrazólio (Thom et al., 1993). O 2-(p-iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-feniltetrazólio (INT) é o com posto mais utilizado para quantificação da atividade de microrganismos em amostras ambientais, principalmente em situações onde a quantificação pode ser feita após a extração do produto de redução do tetrazólio, a formazana. A redução intracelular do INT produz um cristal de formazana detectável por microscopia de campo claro. O método, porém, não perm ite a visualização do cristal em ambientes opacos.
Um outro derivado do sal tetrazó lio , o cloreto de 5-cia no -2,3 -dito lu il tetrazólio (CTC), quando reduzido, produz um com posto que se acumula no interior da célula e pode ser detectado pela fluorescência vermelha (excitação: 3 8 0 nm, emissão: 602 nm, coeficiente de extinção: 1 ,6 2 4 x 1 O4 L/moM x cm (Rodriguez et al., 1992). A com binação do CTC com um marcador de DNA que produza fluorescência em um com prim ento de onda diferente, como por exemplo, o DAPI (excitação: 340nm ; emissão: 450nm ), permite analisar, em uma mesma amostra, a quantidade to ta l de células (contagem dos organismos marcados com DAPI) e os organismos ativos naquele ambiente (contagem com CTC).
Estudos com parativos sobre os sítios de abstração de elétrons na cadeia respiratória de E. co/i indicam que com o INT os elétrons são abstraídos das enzimas succinato e NAD(P)H desidrogenase, da ubiquinona e dos citocrom os b555 e b556, enquanto que, no caso do CTC, os elétrons são transferidos
INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO
das duas desidrogenases (Smith & McFethers, 1997). A oxidação de O, está mais diretam ente acoplada à redução do CTC do que do INT (Sm ith & McFethers, 1 997).
O teste de CTC pode ser utilizado para quantificação de m icrorganismos ativos em amostras de água (Ullrich et al. 1996; Tholozan et al., 1999; Kawai et al., 1 999), em biofilmes microbianos (Rodriguez et al., 1 992; Schaule et al., 1993), no solo (Yu et al., 1 9 9 5 ; W inding et al., 1 994) e ar (Hernandez et al., 1999).