Indicadores biológicos e bioquímicos da qualidade do solo: manual técnico. - Portal Embrapa

(1)

EnJttpt

ISSN 1 5 1 6 - 4 6 9 1

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Centro Nacional de Pesquisa de Monitoramento e Avaliação de Impacto Am biental

M in isté rio da A g ric u ltu ra e do A b a ste cim e n to

INDICADORES BIOLOGICOS

E BIOQUÍMICOS

DA QUALIDADE DO SOLO

■ ■ ■ ■ Manual Técnico H H B H I

Coordenadores:

Rosa Toyoko Shiraishi Frighetto Pedro José Valarini

Jaguariúna, SP

(2)

EMBRAPA MEIO AMBIENTE - Documentos 21

Exemplares dessa publicação podem ser solicitados à:

Embrapa Meio Ambiente

Rodovia SP 3 4 0 - km 1 27,5 - Tanquinho Velho Caixa Postal 69 1 3 820 -0 00, Jaguariúna, SP Fone: (19) 3 8 6 7 -8 7 5 0 Fax: (19) 3 8 6 7 -8 7 4 0 sac@cnpma. embrapa. br

w w w . crtpma. embrapa.br

Fundação de Estudos e Pesquisas em Agronomia, Medicina, Veterinária e Zootecnia - FUNEP

Via de acesso Professor Paulo Donato Castellane, s/n Bairro Rural 1 4 8 8 4 -9 0 0 - Jaboticabal, SP

Fone: (16) 323-1 322 Fax: (16) 323 -2 8 5 2 livraria @ funep. com. b r

w w w . funep. com .br

Comitê de Publicações: Magda Aparecida de Lima, Aldemir Chaim, Célia Maria M. de Souza Silva,

Franco Lucchini, Júlio Ferraz de Queiroz e Maria Cristina Tordin.

Coordenação Editorial

Maria Cristina Tordin e Regina Lúcia Siewert Rodrigues - Embrapa Meio Ambiente

Revisão

Maria Cristina Tordin

Normalização bibliográfica

Maria Amélia de Toledo Leme

Diagramação e editoração

Franco Ferreira de Moraes

Projeto gráfico

Foto da capa

Luiz Toledo de Barros Rizzo

Tratamento das ilustrações

18 edição

1a impressão (2000): 40 0 exemplares

A reprodução não autorizad a desta publicação, no todo ou em parte, co n s titu i vio la çã o do C opyright* (Lei n°. 9 61 0).

CIP. Brasil. Catalogação-na-publicaçâo Embrapa Meio A m biente

FRIGHETTO, R. T .S .; VA LA R IN I, P.J., Coords. Indicadores

biológicos e bioquímicos da qualidade do solo: m anual

té c n ic o . J a g u a riú n a : Embrapa M eio A m b ie n te , 2 0 0 0 . 1 9 8 p . (Em brapa M eio A m b ie n te . D o c u m e n to s , 2 1 ).

CDD - 6 3 1 .4

(3)

PREFÁCIO

Os avanços na tecnologia e na industrialização, associados às mudanças introduzidas no manejo agrícola, trouxeram consigo não somente benefícios ao ser humano mas também problemas ambientais. Para atender a esta nova demanda, a microbiologia e a bioquímica, como dois integrantes da ciência ambiental, precisaram buscar novos prismas de análise para solucionar questões relacionadas às práticas agrícolas, à ecologia microbiana do solo, à ecotoxicologia e aos diversos aspectos da biotecnologia. Esse novo desafio precisou englobar também tecnologias microbianas associadas às rizosferas, aplicadas, por exemplo, na reabilitação de solos degradados. O conhecim ento de m étodos e seu embasamento teórico é fundamental para o sucesso do trabalho e para a cooperação com outras áreas correlatas da ciência ambiental.

O grande desafio é desenvolver ou adaptar m étodos para monitorar e avaliar o impacto antropogênico sobre os processos biológicos do solo e sobre os organism os que nele h a b ita m , em c o n d içõ e s de cam po. Devido à complexidade das propriedades biológicas e bioquímicas, qualquer índice de qualidade do solo deve incluir diversas variáveis dessas áreas para que estas possam refletir a realidade dos complexos processos que compõem a qualidade do solo. Esses parâmetros devem, tam bém , atender às necessidades dos estudos, como: análise de risco causado pelo uso de pesticidas em solos aráveis; análise e previsão de risco pelo uso de lodo de esgoto, com posto,etc; monitoramento do impacto causado pelo uso da terra e predição das mudanças na qualidade do solo em decorrência da adoção de novas práticas, impacto causado pelo derramamento intencional ou acidental de com postos químicos, avaliação da melhoria na qualidade do solo após sua remediação, ou na caracterização de diferentes solos segundo critérios físico-químicos, biológicos, bioquímicos etc.

O tratam ento desses dados tam bém precisou buscar uma nova filosofia de análise para atender a essa demanda tão complexa, incorporando-se, para tanto, a ferramenta matemática de análise m ultivariada de dados, descrita em um dos capítulos deste manual.

(4)

O presente manual descreve m étodos e técnicas de análise dos indicadores biológicos e bioquím icos norm alm ente usados para com por os índices de qualidade do solo, interfaceando, para tanto, a biologia, a microbiologia, a química e a bioquím ica do solo, cujos conceitos e métodos experimentais foram adotados em nossos laboratórios.

Rosa Toyoko Shiraishi Frighetto Pedro José Valarini

(5)

SUMARIO

COLABORADORES, 9

RECOMENDAÇÕES ESPECIAIS, 11

I. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE INTEGRADA DO SOLO, 13

II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS

NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS, 19

III. DETERMINAÇÃO DA UMIDADE, PH

E CAPACIDADE DE RETENÇÃO DE AGUA DO SOLO, 37

IV. PROBLEMAS ENCONTRADOS

NA AVALIAÇÃO DE MICRORGANISMOS DO SOLO, 41

V. MÉTODOS BÁSICOS PARA CONTAGEM DE PATÓGENOS DO SOLO: MEIOS SELETIVOS

PARA ISOLAMENTO, AVALIAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO, 45

VI. DETERMINAÇÃO DE ACTINOMICETOS, LEVEDURAS, BACTÉRIAS ESPORULANTES E SOLUBILIZADORES DE FOSFATO NO SOLO, 53

VII. AVALIAÇÃO DE FUNGOS MICORRÍZICOS

(6)

VIII. METODOLOGIA PARA AVALIAÇÃO

DE FIXADORES SIMBIÓTICOS DE NITROGÊNIO DO SOLO, 77

IX. A IMPORTÂNCIA DA CELULASE

NA DEGRADAÇÃO DE MATÉRIA ORGÂNICA, 89

X. USO DE CROMÓFOROS NA DETECÇÃO

DE ENZIMAS EXTRACELU LARES DE FUNGOS, 99

XI. ANÁLISE DE FOSFATASE ÂCIDA E ALCALINA: COMPONENTE DO ÍNDICE DE QUALIDADE BIOQUÍMICA DO SOLO, 103

XII. MÉTODOS PARA DETECÇÃO

DAS MUDANÇAS QUÍMICAS NA RIZOSFERA, 111

XIII. ANÁLISE DA ATIVIDADE DE DESIDROGENASE, 119

XIV. DETERMINAÇÃO DE MICRORGANISMOS

METABOLICAMENTE ATIVOS EM AMBIENTES NATURAIS,

POR CTC (5-CYANO-2,3-DITOLUYL TETRAZOLIUM CHLORIDE), 125

XV. ESTIMATIVA DA ATIVIDADE MICROBIANA:

MÉTODO DE HIDRÓLISE DO DIACETATO DE FLUORESCEÍNA, 133

XVI. ESTIMATIVA DA ATIVIDADE

MICROBIANA DO SOLO POR CROMATOGRAFIA GASOSA, 139

XVII. TEOR DE ERGOSTEROL PARA ESTIMAR

(7)

XVIII. ANÁLISE DA BIOMASSA MICROBIANA

EM CARBONO: MÉTODO DE FUMIGAÇÃO-EXTRAÇÃO, 157

XIX. DETERMINAÇÃO

DE POLISSACARÍDEOS DE ORIGEM MICROBIANA

E SUA IMPORTÂNCIA NA ESTRUTURAÇÃO DO SOLO, 167

XX. ESTIMATIVA DA QUALIDADE

DE RESÍDUOS VEGETAIS INCORPORADOS AO SOLO

E SUA IMPORTÂNCIA NA CICLAGEM DE NUTRIENTES, 175

XXI. PERFIL DE ENRAIZAMENTO

(8)

CO LABO RADO RES

Adriana Parada Dias da Silveira

Centro de Solos e Recursos Agro - IAC Caixa Postal 28 1 3 0 0 1 -9 7 0 Campinas-SP apdsil@iac. barao. br

Arquimedes Lavorenti

Departam ento de Química - ESALQ/USP Caixa Postal 9 1 3 4 1 8 -9 0 0 Piracicaba-SP Alavoren @carpa. ciagri. usp.br

Heloísa Ferreira Filizola

Embrapa Meio Ambiente Caixa Postal 69 1 3 8 2 0 -0 0 0 Jaguariúna-SP filizola @cnpma. embrapa. br

Itamar Soares de Melo

Embrapa Meio Ambiente Caixa. Postal 69 1 3 8 2 0 -0 0 0 Jaguariúna-SP itamar@cnpma. embrapa. br

Jane L. Faull

Dep. o f Biology, Birkbeck College, University of London j. nicklin @biology. bbk. ac. uk

Marcelo Martins de Sena

Instituto de Química - Unicamp Caixa Postal 6154 1 3 0 8 3 -9 7 0 Campinas-SP marcsen @iqm. unicamp. br

Maria José Valarini

PqC - Instituto de Zootecnia Caixa Postal 60 1 3 4 6 0 -0 0 0 Nova Odessa-SP mjvalarini@izsp. br

(9)

Milton Ricardo de Abreu Roque

Embrapa Meio Ambiente Caixa Postal 69 1 3 8 2 0 -0 0 0 Jaguariúna-SP mroque@cnpma. embrapa. br

Nelson Frighetto

Laboratório de Síntese Orgânica - CPQBA/UNICAMP Caixa Postal 61 71 1 3 0 8 1 -9 7 0 Campinas-SP frigheto @cpqba. unicamp. br

Pedro José Valarini

Embrapa Meio Am biente Caixa Postal 69 1 3 8 2 0 -0 0 0 Jaguariúna-SP valarini@ cnpma. embrapa. br

Regina Teresa Rosim Monteiro

Laboratório de Ecotoxicologia - CENA/USP Caixa Postal 96 1 3 4 0 0 -9 7 0 Piracicaba-SP m onteiro@ cena.usp.br

René Peter Schneider

In s titu to de Ciências Biomédicas - USP A v. Prof. Lineu Prestes, 1374 0 5 5 0 8 -9 0 0 São Paulo-SP Schneide@icb. usp. br

Ronei Jesus Poppi

In s titu to de Química - Unicamp Caixa Postal 61 54 1 3 0 8 3 -9 7 0 Campinas-SP ronei@ iqm. unicamp. br

Rosa Toyoko Shiraishi Frighetto

Embrapa Meio Am biente Caixa Postal 69 1 3 8 2 0 -0 0 0 Jaguariúna-SP rosa @cnpma. embrapa. b r

Shirlei Scramin

Embrapa Meio Am biente Caixa Postal 69 1 3 8 2 0 -0 0 0 Jaguariúna-SP scram in @cnpma. embrapa. br

(10)

RECOMENDAÇÕES ESPECIAIS

Os laboratórios da Embrapa Meio Am biente possuem "M anual de Normas e Procedimentos de Segurança" próprios. Vale ressaltar que cada laboratório, pelas suas particularidades, demanda normas de segurança e de gerenciamento diferenciadas. Descrevemos aqui apenas algumas recomendações básicas para a condução eficiente dos trabalhos com a devida precaução.

M anipulação de reagentes

• Qualquer reagente ou solução deve SEMPRE estar devidam ente rotulado e identificado (nome do produto, concentração, data do preparo e quem preparou).

• Ler SEMPRE o conteúdo do rótulo para se inform ar sobre as recomendações ou consultar literatura especializada, antes de manipular qualquer produto.

• Manipular reagentes voláteis SOMENTE dentro da capela com exaustão, para prevenir a inalação de gases tóxicos.

• Usar luvas e óculos de segurança para manipular substâncias tóxicas. Usar máscara para gases voláteis, mesmo operando na capela.

• NUNCA pipetar com a boca. Usar acessórios apropriados.

(11)

M anejo do Lixo Laboratorial

• Acondicionar restos de soluções e produtos de reações em recipientes apropriados, devidam ente id e n tific a d o s , para p o s te rio r d e sca rte (ou incineração). Ter o cuidado em não m isturar substâncias incom patíveis. Consultar um técnico de segurança.

• Nunca despejar substâncias químicas nas pias.

• Solventes devem ser acondicionados em bombonas separados das soluções aquosas (contendo, por exemplo, metais e substâncias tóxicas).

• Acondicionar dejetos sólidos (poliacrilamida e plásticos contam inados) no recipiente específico.

• Os meios de cultura utilizados nos ensaios devem sofrer autoclavagem antes de serem descartados.

• Agulhas, lâminas e ponteiras devem ser depositadas em "lixos especiais" e NUNCA em cestos para "lixos com uns".

Uma orientação sobre descarte seguro de pequenas quantidades de substâncias químicas de uso nos laboratórios pode ser encontrada no catálogo A ldrich Catalogue Handbook of Fine Chem icals. Para in fo rm a çõ e s mais detalhadas, consultar as seguintes bibliografias:

PITT, M.J. et al. Handbook of laboratory waste disposal. Chichester: Ellis Horwood, 1985.

ARMOUR, M .A. Hazardous laboratory chemicals disposal guide. Boca Raton: CRC Press, 1 991.

LUNN, G. et al. Destruction of hazardous chemicals in the laboratory. 2. ed. Chichester: J. Wiley, 1994.

(12)

I. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE INTEGRADA DO SOLO

I. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE

INTEGRADA DO SOLO

Rosa Toyoko Shiraishi Frighetto Pedro José Valarini

Quais parâmetros definem a qualidade do solo?

Devido à sua importância, muitas tentativas de definição da qualidade do solo estão descritas na literatura (Doran & Parkin, 1994; Persson & Otabbong, 1994), bem como sugestões de métodos e estratégias para sua caracterização (Domsch et al., 1 983; Brookes, 1 993; Doelman & Vonk, 1 994; León & van Gestel, 1994; Kennedy & Papendick, 1995a; Kennedy & Smith, 1995b; Torstensson, 1993; Torstensson, 1997). Doran & Parkin (1994) sugeriram que a qualidade do solo deve ser d e fin id a com o sendo "a capacidade, de um dado solo, em funcionar no ecossistema para sustentar a produtividade biológica, manter a qualidade ambiental e promover a saúde do animal e da planta".

A qualidade do solo pode melhorar ou deteriorar dependendo dos fatores que a influenciam . Porém existem aqueles fatores que são fixos e, portanto,

(13)

INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO

não podem ser m odificados, tais com o: geológico, topográfico, clim ático e o tem po.

C om postos xen obió ticos e m itid o s por fontes locais ou aqueles presentes em locais de descarte são, norm alm ente, restritos em termos espaciais. Mas estes podem se to rn a r m u ito concentrados a ponto de afetarem a qualidade do solo. A lém do mais, esses com posto s, quando o atingem podem ser tra n sp o rta d o s pelo processo de adsorção/dessorção, ser transform ados ou não ao longo do perfil de solo e a tin g ir as águas superficiais e subterrâneas, dependendo das características deste.

O utro parâm etro a ser considerado é o papel dos microporos na sorção e liberação de poluentes (Bergstrõm & Stenstrõm , 1998) e sua im portância na biodisponibilidade dos com posto s xenobióticos, sendo necessários, portanto, estudos mais profundos. Os m icroporos, que ocupam a interface entre as trê s fa se s do solo (só lid o , líq u id o e ar), abrigam m uitas das respostas relacionadas à questão de lixiviação e transporte de com postos químicos pelo perfil do solo.

O ecossistem a do solo pode, tam bém , sofrer distúrbios em conseqüência das práticas agrícolas, com o o preparo, fertilização, controle de doenças e pragas, tip o s de cultura, processo de colheita etc.

O grande desafio é desenvolver ou adaptar métodos para m onitorar e avaliar o im p a cto an tropogênico sobre os processos biológicos do solo e sobre os organism os que nele habitam , em condições de campo. Qualquer índice de qualidade do solo deve incluir, além dos índices convencionais e oficiais (físico e quím ico), diversas variáveis biológicas e bioquímicas para que, em c o n ju n to , possam re fle tir os complexos processos que afetam a qualidade do solo. Esses parâm etros, analisados de forma integrada, devem, tam bém , atender às necessidades pertinentes ao estudo e ao ecossistema.

No caso dos estudos ecotoxicológicos, a minhoca foi selecionada como parâm etro anim al, e tam bém ou tros invertebrados foram sugeridos para testes

(14)

I. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE INTEGRADA DO SOLO laboratoriais de efeitos indiretos. Porém ainda não existe um m étodo validado para te ste s que possam ser adotados em con dições de cam po. Estudos baseados no com portam ento, reprodução, m udança na com unidade etc. foram sugeridos, mas estes apresentam problem as operacionais, com o alto custo e consum o de tem po.

Os microbiologistas, por outro lado, utilizaram m étodos que refletem a e s tru tu ra da com unidade (Bâáth e t a l., 1 9 9 8 ) e a tiv id a d e m ic ro b ia n a (Torstensson et al., 1998; Palmborg et al., 1 9 9 8 ; Pell et al., 1998; Stenstrõm e t al., 1 9 9 8 ), porém estes te ste s ainda a p re se n ta m va ria çõ e s na sua sensibilidade (Domsch et al., 1983; Dighton, 19 9 7 ). Há quem acredite que a determinação da variabilidade de m icorrização por profundidade possa abrir novos horizontes de pesquisa e o funcionam ento do ecossistema seria utilizado para criar relevantes sistemas de teste (Kling & Jacobsen, 1998). Os fungos micorrízicos arbusculares (FMA) constituem a interface viva entre o solo e as raízes de plantas para o transporte de nutrientes. Estes são considerados grupos de microrganismos do solo de importância direta na absorção de nutrientes pelas plantas herbáceas. Os FMA ta m b é m c o n trib u e m na fo rm a çã o de agregados do solo e na proteção de plantas contra a estiagem e os patógenos do solo. Portanto, na avaliação da qualidade do solo é im portante considerar o enfoque qualitativo e quantitativo desse parâm etro (Kling & Jacobsen, 1998).

As enzimas estão presentes no solo na fo rm a b ió tica associada aos microrganismos viáveis ou às faunas do solo e na form a não associada às células vivas (abióticas), como enzimas extracelulares, células m ortas ou complexadas aos colóides orgânicos e m inerais. A atividade enzim ática no solo tem um papel importante por participar da catálise de inúmeras reações necessárias para o ciclo de vida de m ic ro rg a n is m o s no s o lo , para a decomposição de resíduos orgânicos no ciclo de nutrientes e na form ação da matéria orgânica e estrutura do solo. As enzim as apresentam grande potencial como indicadoras da qualidade do solo por estas serem sensíveis às variações induzidas pelos fatores ambiental e de m anejo, e os procedim entos de sua análise são relativamente simples e rápidos (D ick,1 9 9 4 )

(15)

Sendo o solo uma m atriz m u ito heterogênea, o m étodo de amostragem deve levar em consideração a presença de grande variabilidade. Seria desejável que fo s s e e la b o ra d o um p ro c e d im e n to g e o e s ta tís tic o para m apear a d istrib u içã o dos co n tam in antes nos solos (caracterização do problema) e que este fosse utilizado com o um a ferram enta propícia para acom panham ento am ostrai e dos resultados de m onitoração.

R E F E R Ê N C IA S B IB L IO G R Á F IC A S

B À Â T H , E.; FROSTEGARD, Â .; D ÍA Z -R A V IN A , M .; TU N LID , A. M icrobial c o m m u n ity based m e a su re m e n ts to e s tim a te h e a vy m etal e ffe c ts in soil: th e use o f p hosph olipid fa tty acid patterns and bacterial c o m m u n ity tolerance. Ambio, v .2 7 , p .5 8 -6 1 , 1998.

BERGSTRÕM, L.; STENSTRÒM, J. Environm ental fate of chem icals in soil. Ambio, v .27, p. 16-23, 1998.

BROOKES, P. C. The potential of microbiological properties as indicators in soil pollution monitoring. In: SCHULIN, R., ed. Soil monitoring: early detection and surveying o f soil contam inatio n and degradation. Basel: Birkháuser Verlag, 1 9 9 3 . p .2 2 9 -2 5 4 .

DICK, R.P. Soil enzime a ctivitie s as indicators o f soil quality. In: DORAN, J.W .; COLEMAN, D.C.; BEZDICEK, D .F.; STEW AR T, B .A ., ed. Defining soil quality for a sustainable environment: proceedin gs o f a sym posium . M adison: Soil Science S o cie ty o f A m erica, 1 9 9 4 . p. 107-1 24. (SSSA Special P ublication, 35).

DIGHTON, J. Is it possible to develop m icrobial te s t system s to evaluate pollution e ffe c ts on soil n u trie n t c y clin g ? In: V A N STR AALEN , N .M .; L0KKE, H ., ed. Ecological risk assessment of

contaminants in soil. London: Chapman & Hall, 1997. p .51 -6 9 .

DOELMAN, P.; V onk, J .W . Soil m icroorganism s o f global im portance to consider e cotoxicology in an econom ical and ecological w a y. In: DONKER, M. H. E.; EIJSAKERS, H.; HEIMBACH, F., ed.

Ecotoxicology of soil organisms. Boca Raton: Lewis Publishers, 1 9 94. p .9 1 -1 0 4 .

DOMSCH, K. H.; JA G N O W , G.; ANDERSON, T.-H. An ecological concept fo r assessment of side- e ffe c ts o f agrochem icals on soil m icroorganism s. Residue Reviews, v .86, p .6 5 -1 0 5 , 1 983. DORAN, J. W .; PARKIN, T.B. D efining and assessing soil q u a lity . In: DORAN, J .W .; COLEMAN,

D.C.; BEZDICEK, D .F.; STEWART, B.A., ed. Defining soil quality for a sustainable environment: proceedings o f a sym posium . M adison: Soil Science Society of Am erica, 1994. p .3 -2 1 . (SSSA Special P ublication, 35).

(16)

I. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE INTEGRADA DO SOLO KENNEDY, A. C .; Papendick, R.l. M icrobial c h a ra c te ris tic s o f soil q u a lity . Journal of Soil and

W ater Conservation, v . 50, p .2 4 3 -2 4 8 , 1995.

KENNEDY, A. C.; S m ith , K.L. Soil m icrobial d iv e rs ity and th e s u s ta in a b ility o f a g ric u ltu ra l soil.

Plant and Soil, v. 1 70, p .7 5 -8 6 , 1995.

KLING, M.; JACOBSEN, I. A rbuscular m ycorrhiza in soil q u a lity assessm ent. Ambio, v .2 7 , p .29- 34, 1998.

LEÓN, C. D.; V A N GESTEL., C .A .M . Selection of a set of laboratory ecotoxicology tests for the

effects assessment of chemicals in terrestrial ecosystem s. A m s te rd a m : V rije U n iv e rs ite it,

1994.

PALMBORG, C .; BRINGM ARK, L.; BRINGMARK, E.; NORDGREN, A . M u ltiv a ria te a n alysis of m icrobial a c tiv ity and soil organic m a tte r at a fo re s t site sub je cte d to lo w -le v e l heavy m etal contam ination. Ambio, v .2 7 , p .53-57, 1998.

PELL, M .; STENBERG, B.; TORSTENSSON, L. Potential d e n itrific a tio n and n itrific a tio n te s ts fo r evaluation o f pesticide e ffe c ts in soil. Ambio, v . 27, p .2 4 -2 8 , 1 998.

PERSSON, J.; OTABBONG, E. Soil fe rtility and regulating fa c to rs . In: Fertility of cultivating soils. Stockholm : Sw edish Environm ental Protection Board, 1 9 9 4 . p .9 -6 9 .

STENSTRÕM, J .; STENBERG, B.; JOHANSSON, M. Kinetics of substrate-induced respiration (SIR): theory. Ambio, v .27, p .3 5 -3 9 , 1998.

TORSTENSSON, L. Soil biological variables in environmental hazard assessment: g uidelines. Stockholm : Sw edish Environm ental Protection A g e n cy, 1 9 9 3 . 166p.

TORSTENSSON, L. M icrobial assays in soil. In: TARRADELLAS, J. B.; BITTON, G.; ROSSEL, D., ed. Soil ecotoxicology. Boca Raton: CRC Press/ Lew is Publisher, 1 9 9 7 . p .2 0 7 -2 3 4 .

TORSTENSSON, L.; PELL, M .; STENBERG, B. Need o f strategy fo r evaluation o f arable soil quality.

(17)

18 - Manual Técnico

INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQuíMICaS DA OUAlIDADE DO SOLO

(18)

II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS

II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS

NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS

Ronei Jesus Poppi M arcelo M artins de Sena

Introdução

Com a crescente sofisticação das té c n ic a s in s tru m e n ta is de análise q u ím ic a , im p u ls io n a d a pelo a v a n ç o de m ic r o p r o c e s s a d o r e s e m icrocom putadores nos laboratórios, técnicas de tra ta m e n to de dados mais com plexas do ponto de vista m atem ático e e s ta tís tic o tornaram -se uma realidade (Bruns & Faigle, 1985).

A análise de dados é uma parte essencial em to d o exp erim e nto , sendo univariada quando som ente uma variável é m edida siste m a tica m e n te nas várias am ostra s. Há m u ito tem po a e s ta tís tic a u n iv a ria d a vem sendo aplicada a problem as quím icos, mas a sua u tiliz a ç ã o to rn o u -se m u ito lim itada. Nas últim as décadas, a análise m u ltiv a ria d a fo i introduzida no tratam ento de dados químicos, ganhando rapida m en te popularidade e dando origem a uma nova disciplina, batizada Q u im io m e tria . O m odelo e sta tístico

(19)

dos m étodos m ultiva riad os leva em consideração a correlação e n tre m uitas v a riá v e is m e d id a s s im u lta n e a m e n te , p e rm itin d o a e x tra ç ã o de um a quantidade m uito m aior de inform ação.

A seguir, será descrito, como exemplo, o estudo da utilização de m étodos quim iom étricos em análise de solos. O solo é uma estrutura com plexa formada pela influência de fatores geológicos, topográficos, clim áticos, tem porais e antropogênicos; é também a parte mais im portante da geosfera, de onde provém a maior parte dos nossos alimentos. Além disso, ele funciona com o uma espécie de filtro ambiental para a purificação da água e do ar (Torstensson et al., 1 998).

O interesse maior na análise de solos está centrado nos parâm etros químicos (concentração de metais e nutrientes, pH etc.), físicos (com pactação, um idade etc.) e biológicos (processos m icrobianos, e tc .), os quais são considerados indicadores de sua qualidade. Dentre os parâm etros do solo, o mais estudado é a m atéria orgânica (MO). Ela controla m u ita s de suas propriedades e é um fa to r central na manutenção de sistem as agrícolas sustentáveis (conceito de manejo do solo) e no controle da erosão. As substâncias húm icas (Piccolo, 1 9 9 6 ), polím eros naturais fo rm a d o s pela atividade de microrganismos durante a decomposição de plantas e animais, são um a p a rte da MO que e x e rc e im p o rta n te papel no tr a n s p o r te , biodisponibilidade e complexação de nutrientes e metais pesados no solo. Além destes, o u tro grande in te re sse na análise de solos é m e d ir sua contaminação por pesticidas e m etais pesados. Para o acom panham ento de todos esses parâmetros, a química analítica tem contado, nos últim o s anos, com um grande avanço no desenvolvim ento de técnicas instrum entais, tais como espectroscopia e crom atografia.

Os métodos quim iom étricos possuem um enorme potencial no tra tam e nto das questões descritas acima. Entretanto, até a segunda m etade dos anos 80, a sua presença na literatura era escassa. A partir dos anos 9 0 , nota-se um aumento significativo de suas aplicações, elevando a capacidade de se extrair inform ações dos dados provenientes da análise de solos. Com isto, 20 - Manual Téncico

(20)

II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS pode-se afirm ar que está em curso um processo de substituição de muitos m étodos tradicionais de análise univariados por m étodos m ultivariados. Mas esse processo está ainda em seu com eço e há a necessidade de uma ampla divulgação, para que cada vez mais, m aior número de pesquisadores tomem con tato com esta ferram enta de otim ização, que é a quim iom etria.

M étodos descritivos exploratórios

1. Análise de Componentes Principais (PCA)

A Análise dos Componentes Principais, PCA (Geladi & Kowalski, 1986; Martens & Naes, 1989; Zampronio, 1998) (do inglês "Principal Component A n a ly s is "), possui por finalidade básica a redução de dados a partir de com binações lineares das variáveis originais.

A PCA decompõe uma matriz de dados X (onde as n linhas são as amostras e as m colunas, as variáveis) de posto ("ra n k") h, como uma soma de matrizes de posto igual a 1, como na equação 1:

X = M, + M 2 + M 3 + ... + M h (1)

onde o posto expressa o número de vetores linearmente independentes de uma m atriz.

Essas novas matrizes de posto um são produtos de vetores chamados "scores", t h, e "loadings", ph. Estes "scores" e "loadings" podem ser calculados por um ajuste de mínimos quadrados. A operação é equivalente ao cálculo de autovetores e autovalores de uma m atriz por "Singular Value Decomposition" (SVD). A equação pode ser representada na forma vetorial,

^ — ^1 P 1 ^2 P 2 ... Ph ^

(21)

INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO X = TP'

ou graficam ente, como na Figura 1

(3) m I m 1 m P'i P'2 X = ti I + *2 1 n n + ... +

Figura 1. Representação gráfica da som atória dos produtos dos vetores scores e loadings.

Para exem plificar t h e p h, a Figura 2 ilustra no plano bidimensional duas variáveis, x, e x 2. A Figura 2A mostra uma com ponente principal (CP), a reta que aponta na direção de maior variabilidade das amostras (pontos 1 a 6) da Figura 2B. Os "scores" t h são as projeções das amostras na direção da CP (Fig. 2B) e os "loadings" p h são os cossenos dos ângulos formados entre a CP e cada variável (Fig.2A).

As novas variáveis, as CPs, são ortogonais entre si e, portanto, não correlacionadas. Normalmente, as primeiras CPs explicam a maior parte da variância total contida nos dados e podem ser usadas para representá-los.

A Análise de Fatores é adotada em boa parte da literatura como sinônimo de PCA, porém alguns autores (Jõreskog et al., 1976; Forina et al., 1988) definem esses term os como m étodos diferentes, com base no modo com o os fatores (ou CPs) são definidos. Na PCA os fatores devem explicar o máximo da variância contida em todas as variáveis observadas, enquanto que na análise de fatores, eles devem explicar o máximo da intercorrelação entre as variáveis. Neste trabalho, de acordo com a maioria da literatura em química, ambos os term os, fatores e CPs, serão tratados como equivalentes.

(22)

Figura 2. Representação de uma C om ponente Principal (CP) no caso de duas variáveis: (A) os loadings são os ângulos do vetor direção; (B) os scores são as projeções das amostras

1 -6 na direção da CP. Notar que os dados estão centrados na média.

2. Aplicações de métodos exploratórios em análise de solos

A PCA é um método exploratório porque ajuda na elaboração de hipóteses gerais a partir dos dados coletados, contrastando com estudos direcionados nos quais hipóteses prévias são testadas. Ela é capaz de realizar a separação entre a informação im portante e a redundante.

Para a análise exploratória, é de fundamental im portância entender que os "s c o re s " fornece m a co m posiçã o das CPs em relação aos objetos (am ostras), enquanto os loadings fornecem essa mesma com posição em re la çã o às v a riá v e is . C om o as CPs são o rto g o n a is e, p o rta n to , não correlacionadas, é possível examinar as relações entre os objetos através dos gráficos dos scores, projetados nas primeiras CPs, e entre as variáveis, através dos gráficos dos loadings. Esses gráficos apresentam informações úteis sobre tendências subjacentes e características da estrutura dos dados, tais com o agrupam entos de o b je to s ou variáveis e caracterização dos chamados outliers (amostras mal com portadas, que não se encaixam no modelo). 0 estudo conjunto de scores e loadings permite estim ar a influência

(23)

de cada variável em cada objeto e pode ser feito através dos assim chamados gráficos bip/ots. Nos b ip lo ts, am bos, scores e loadings, são normalizados e re p re s e n ta d o s em um m e sm o e sp a ço , fa c ilita n d o , d e sta m aneira, a visualização das relações recíprocas entre objetos, variáveis e CPs.

A aplicação desta ferram enta está exem plificada no estudo da avaliação de propriedades do solo, realizado em duas regiões distintas do estado de São Paulo.

2.1 Á valiação de propriedades do solo

Nenhuma medida isolada, seja biológica, física ou química, poderá dar uma ampla visão da qualidade do solo. Existe, portanto, a necessidade de uma avaliação integrada dos diversos aspectos dessa qualidade (Torstensson et al., 1 99 8).

Esta estratégia fo i aplicada no estudo com parativo entre sistemas de manejo do solo que utilizam m icrorganism os benéficos associados aos restos culturais, aqui cham ados sustentáveis, com sistem as que fazem uso intensivo de herbicidas e fun gicida s, cham ados convencionais (Sena et al., 1998, 1999, 2 0 0 0 ). Espera-se que a incorporação de MO e de restos de culturas, combinada com a inoculação de m icrorganism os benéficos em substituição ao uso de agrotóxicos, proporcione uma melhora nos parâmetros químicos, biológicos e bioquím icos, além de aum entar a estabilidade do solo em comparação com práticas de manejo convencionais.

O prim eiro estudo foi realizado em três áreas no município de Suzano (região leste da Grande São Paulo) (Sena et al., 1999, 20 00). Na primeira área foram separadas quatro faixas, uma de agricultura sustentável (T1S), uma de pastagem (T2P), uma de agricultura convencional (T3C) e uma de mata nativa (T4M ); na segunda área foram separadas duas faixas, uma de agricultura sustentável (T5S) e uma de agricultura convencional (T6C); na

(24)

II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS terceira área foram separadas três faixas, um a de ag ricu ltu ra sustentável (T7S), uma de mata nativa (T8M) e uma de agricultura convencional (T9C). Foi analisado o conjunto das nove faixas. Para cada faixa foram coletadas 10 am ostras compostas de solo. Para cada am ostra foram medidos 21 parâm etros quím icos e biológicos: fósforo (P), m atéria orgânica (M O), pH, potássio (K), cálcio (Ca), magnésio (Mg), acidez total (H + A l), alum ínio (Al), som a de bases (S), capacidade de troca catiônica (CTC), volum e de saturação por bases (V), boro (B), cobre (Cu), ferro (Fe), m a nga nês (M n), zin co (Z n), b a cté ria s esporulantes (Bae), actinom icetos (Ac), m icro rga nism o s ce lu lo lítico s (Cel), teor de carbono em polissacarídeos (Ps) e atividade de desidrogenase (Dh).

A PCA foi aplicada aos valores m édios das 10 am ostras de cada faixa. Foi construída uma matriz 9x21 (9 fa ixa s x 21 variáveis). Neste tip o de a n á lise , os dados sem pre devem se r p r e v ia m e n te a u to -e s c a lo n a d o s (normalizados para média zero e variância um ), para assegurar que todas as variáveis contribuam igualmente para o m odelo, independente da escala em que foram medidas. Todos os cálculos foram fe ito s no "s o ftw a re " "M A T L A B 5 .2 ", utilizando o pacote "PLS Toolbox 2 .0 " (W ise & Gallagher, 19 98).

O objetivo principal da PCA é a redução da dim ensão dos dados originais. Estes são muitas vezes redundantes, porque estão correlacionados. As CPs são calculadas levando em conta essas correlações, mas elas mesmas não estão correlacionadas entre si (por isso, a ortogonalidade entre elas). Neste caso, as 21 variáveis originais devem ser reduzidas a um as poucas novas variáveis independentes (CPs), que expliquem a m aior parte da inform ação relevante, simplificando com isso, a inte rpretaçã o dos dados e elim inando a informação desnecessária. O sistema original de coordenadas (21 variáveis projetadas em 9 objetos) é transform ado, de m odo que o eixo da prim eira CP esteja na direção do máximo de variância co n tid a nos dados. A segunda CP deve ser ortogonal à primeira e explicar a m aior quantid ade de variância restante. E assim, sucessivamente, devem ser obtidas as outras CPs. A pós a transform ação, o analista deve escolher o núm ero de CPs que utilizará em seu modelo. Deve-se ressaltar que o p o n to de m aior d ific u ld a d e na PCA

(25)

consiste justam ente nesta escolha, não havendo uma regra geral. O analista deve tom ar a sua decisão baseado em considerações, tan to do ponto de vista estatístico (quantidade de variância explicada pelo modelo), quanto do ponto de vista físico/quím ico/biológico (interpretação/significado real das CPs).

Na presente análise, foi escolhido um modelo que, com duas CPs, explica 76% da variância dos dados originais. A terceira CP, que explica 11,3% da variância to tal, foi considerada sem im portância para a interpretação de tendências nos dados. A Tabela 1 m ostra a porcentagem de variância explicada por cada CP.

Tabela 1. Porcentagem de variância explicada por cada com ponente principal (CP). Dados de Suzano.

Número do com ponente

principal

% de variância explicada por esta CP

% Total de variância explicada pelo m odelo 1 5 1 .3 7 5 1 .3 7 2 2 4 .6 2 7 5 .9 9 3 11.32 87.31 4 0 4 .8 6 9 2 .1 7 5 0 3 .6 2 9 5 .8 0 6 02.31 98.11 7 01.01 9 9 .1 2 8 0 0 .8 8 1 0 0 .0 0 9 0 0 .0 0 1 0 0 .0 0 26 - Manual Téncico

(26)

Figura 3A. Resultado da análise de com ponentes principais (PCA), mostrando as duas primeiras com ponentes principais para os dados de Suzano: gráfico dos scores.

A Figura 3 mostra os gráficos das duas primeiras CPs. O gráfico de

scores (Fig. 3A) permite a caracterização de tendências entre as faixas. A

primeira CP (5 1,4% ) é responsável pela diferenciação entre os tipos de manejo do solo, enquanto a segunda (2 4,6% ) separa as faixas de acordo com a área de origem . Na CP1 as faixas de ag ricu ltu ra sustentável, T1, T5 e T7, apresentam valores positivos, contrastando com as faixas de mata, T4 e T8, que apresentam valores negativos; as faixas de agricultura convencional e pastagem, T2, T3, T6 e T9, apresentam valores intermediários. A CP2 possui valores positivos para as faixas da terceira área (T7-T9), intermediários para a segunda área (T5 e T6) e negativos para a primeira área (T1-T4).

(27)

INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO 4 3 2 sP CN 1 CD CN CN 0 CL <J -1 -2 -3 -6 - 4 - 2 0 2 4 6 CP 1 (5 1 .3 7 % )

Figura 3B. Gráfico dos loadings, para os dados de Suzano.

O gráfico de loadings (Fig. 3B) perm ite a caracterização de tendências entre as variáveis. Observando-se ao longo do eixo da CP1, as variáveis que mais influenciam diretam ente nas faixas sustentáveis (valores positivos) são P, pH, Ca, Mg, S, V, Mn, Zn, Bae e Cel, enquanto as variáveis que caracterizam a mata (valores negativos) são MO, H + AI, A l+3f Fe e Dh. Pode-se notar, ao longo do eixo da CP2, que as v a riá ve is que mais c o n trib u e m para a diferenciação entre as áreas são MO, CTC e B (influenciam diretam ente na terceira fazenda - valores positivos na CP2); e Cu e Dh (influenciam na primeira área - valores negativos na CP2). Através dos gráficos biplots (Fig. 3C) é possível visualizar conjuntam ente as relações entre as CPs, as faixas e as variáveis. No próximo exemplo, a discussão será feita somente através de biplots, já que estes condensam toda a informação contida nos gráficos de scores e de loadings.

Em um segundo estudo foram escolhidas três fazendas no município de Guaíra (região norte do Estado de São Paulo): Macaúba, Lagoa do Fogão e 28 - Manual Téncico •teAvi 1 1 1 — i— ---1 ■ i i i * 7S «T9C * 5S * 4M • Í 3C T2P i_ i i i i * 6C «ri s 1 I I 1---

(28)

1---II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS Cuiabanos (Sena et al., 1998, 2 0 0 0 ). Em cada fazenda foram separadas cinco faixas (correspondente a um quarto da área sob pivô central), duas de sistema sustentável, duas de sistema convencional e uma de mata nativa. Para cada faixa foram coletadas 10 amostras com postas do solo. Para cada amostra foram medidos 8 parâmetros biológicos e bioquímicos: pH, leveduras (Lev), actinom icetos (Act), m icrorganismos celulolíticos (Cel), microrganismos solubilizadores (Sol), teor de carbono em polissacarídeos (Ps) em mg/g de solo, atividade de desidrogenase (Dh) em |iL de H/g de solo e biomassa microbiana (BiM) em ^g de C/g de solo.

Figura 3C. Gráfico b ip lo t para os dados de Suzano.

Como no estudo anterior, a PCA foi aplicada aos valores médios das 10 amostras de cada faixa. Para cada fazenda, partiu-se de matrizes 5x8 (5 faixas x 8 variáveis), selecionando-se um modelo que, com duas CPs, explicou entre 85 e 91% da variância total (Macaúba: 8 7 ,3 7 % ; Lagoa do Fogão: 85 ,3 5 % ; Cuiabanos: 9 1 ,1 7 % ). A Figura 4 apresenta os gráficos biplots de CP1 x CP2 para as três fazendas: Macaúba (Fig. 4A), Lagoa do Fogão (Fig. 4B) e Cuiabanos (Fig. 4C).

(29)

Em todos os casos, o primeiro fa to r a ser modelado foi a separação da faixa de mata (valores negativos na CP1) das demais faixas (valores positivos na CP1). As faixa s de m ata ca racterizara m -se por uma a lta biom assa microbiana (BiM) e uma baixa com posição de celulolíticos (Cel). A CP2 foi interpretada como sendo um fator de separação entre as faixas de sistema sustentável e convencional. Os parâmetros bioquím icos, polissacarídeos (Ps), desidrogenase (Dh) e biom assa m ic ro b ia n a (B iM ), se c o rre la c io n a ra m p o s itiv a m e n te com as fa ix a s de tra ta m e n to s u s te n tá v e l, e n q u a n to m ic ro rg a n is m o s c e lu lo lític o s e s o lu b iliz a d o re s (Sol) c o rre la c io n a m -s e negativamente. A Fazenda Macaúba apresentou a melhor separação entre faixas de sistemas sustentáveis e convencionais. Em todos os casos, a CP3 (que explicava entre 6 e 11 % da variância) foi descartada com o sendo um fator de diferenciação entre faixas de mesmo tratam ento.

Biplot: (o) scores normalizados 1 loadings

0.6 0 .4 £ p' o 0-2 CN <N Q. 0 CJ -0.2 -0 .4

Figura 4A. Resultado da análise de componentes principais (PCA), mostrando os biplots das duas primeiras componentes principais para os dados de Guaíra: Fazenda M acaúba.

1- — ■■■ ■ +Sol ■+Act +Lev •conv2 ■+Cel •convl 4Ps %nata PH+hÊ[1M --- ■ ---• sust1.sust2 ... ... 1 -0.5 0 0. CP 1 (6 6 .7 0 % ) 30 - Manual Téncico

(30)

II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS A PCA perm itiu, portanto, distinguir quais as variáveis ou fatores que mais influ encia ram na separação entre am ostras de solos subm etidas a diferentes tipos de manejo.

Biplot: (o) Scores norm alizados, ( + ) loadings

0 . 6---1---1---1---1---1---1---1---1---— ^ ---: • sustZ • mata 0 4 - I +Ps _ 0 .2 - I + - P h ^ ! T ev ã, -IBiM 5 o --- J _ ---PO <N _ _ Í « S U S tl o. - 0 . 2 - i -(Act u : ° - 4 " »(Jonv2 +P H •c<í>nv1 +Cel -0.6 -"°'?1 -0 .8 -0 .6 -0 .4 -0 .2 0 0 .2 0 .4 0 .6 0.8 CP 1 (5 0 .3 6 % )

Figura 4B. G ráfico biplot. Fazenda Lagoa do Fogão.

2 .2 O utras aplicações

Um exemplo importante encontrado na literatura é o trabalho de Stenberg et al. (1 9 9 8 ), que aplicou PCA para avaliar a qualidade de solos cultivados. Neste trabalho, as variáveis químicas, físicas e biológicas foram medidas em dois grupos de amostras: no primeiro, 52 amostras de um mesmo campo (chamado Ekhaga) e no segundo, 26 amostras de diferentes solos abrangendo toda a Suécia. A aplicação da PCA possibilitou a identificação das principais tendências nos dados (de acordo com as PCs) e relacionou-as com três fatores: matéria orgânica, pH e atividade microbiana. Além disso, foi possível visualizar a separação das amostras em função da granulometria, do tipo de cultura do solo e de sua localização geográfica.

Biplot: (o) Scores norm alizados, { + ) loadings

• mata -IBiM • sustZ +Ps + 4 Dh Lev cfc <? • •su st 1 -(Act o nv2 >nv1 + c e l 3l . . . .

(31)

INDICADORES BIOLÓGICOS E 8IOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO

Biplot: (o) Scores norm alizados, ( + ) loadings

0.8.--- .---,---+C el 0 . 6 - j • »conv1 0 . 4 - , o-Lev i +S ol | *c o n v 2 | ° ' 2 * i + D h ' ^ : • s u s t2 co n : = ° --- 7 5 ---f ...W è - ° - 2 - .m a ta | + A c t 4-BiM - 0 . 4 . j -0.6. ! -o.sl_______________ ._______________ l____________ ^ -1 -0 .5 0 0 .5 CP 1 (7 4 .5 2 % )

Figura 4C. Gráfico biplot: Fazenda Cuiabanos.

M uitos trabalhos recentes procuraram aplicar esse tip o de estratégia para avaliar a fertilidade do solo e com parar as condições de manejo. Estes estudos permitiram classificar solos de acordo com a sua fe rtilid ad e (Nolin et al., 1989), comparar nutrientes de plantas e solos (Ném eth et al., 1993) e determinar os fatores que controlam a mineralização de nitrogênio em solos úmidos (González-Prieto et a l., 1 9 9 2 ), a denitrificação em solos cultivados e não cultivados (Horwath et al., 19 98) e a deterioração de solos semi-áridos pelo seu uso (Quiroga et al., 19 9 8 ). Outra aplicação interessante foi o estudo dos parâmetros que controlam a atividade de m icro rg a n ism o s benéficos, para estabelecer um controle biológico (D uffy et al., 1997).

A utilização de modernas técnicas analíticas in strum e ntais pode gerar dados com grande potencial de inform ação, abrindo novos horizontes para as estratégias m ultivariadas. A Espectroscopia no In frave rm elh o (IV) é a técnica mais usada, principalm ente na determ inação de MO, sendo que o solo pode ser classificado de acordo com o seu te o r de MO (Henderson et al.,

32 - Manual Téncico 1 , a-Lev +S ol r + C e l • c o n v 1 • c o n v 2 + D h ' • s u s t2 + Ps ...■ fpH 1 •m a ta + A c t +B ÍM •su s

(32)

II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS 19 8 9 ). O utra opção é o uso da com binação PCA/IV na seleção de amostras de solo que tenham grande variabilidade de propriedades, partindo-se de uma grande população (Stenberg et a l., 19 95).

O utro grande o b jetivo das estratégias m ultivariadas exploratórias é o estudo da contam inação de solos por m etais pesados e outros poluentes. Os fatores (ou CPs) obtidos na PCA podem ser usados para caracterizar fontes poluentes de m etais pesados. Uma boa ilustração desta aplicação é o artigo de Krieg & Einax (1 9 9 4 ), que estudaram este tipo de contam inação em diferentes locais da Alemanha, próxim os a indústrias.

A PCA, além de ser usada no estudo direto dos contam inantes no solo, po de ser ú til na e s c o lh a das m e lh o re s c o n d iç õ e s para m é to d o s de determ inação. K okot et al. (1992) com pararam qual o melhor, dentre 18 extratores, para a digestão em forno de m icroondas de 5 metais determ inados por Análise de Absorção Atôm ica (AAS). Pyle et al. (1 996) estudaram qual a melhor, dentre as 4 técnicas analíticas instrum entais, para a determinação de chum bo e cádm io em 50 amostras de solo.

S teinheim er et al. (1 994) correlacionaram as variáveis que influenciam na e fic iê n c ia da e xtra çã o por fluído su p e rcrítico de pesticidas no solo. Alm endros (1 9 9 5 ) usou a Análise de Fatores por Correspondência para estudar as interações entre pesticidas e substâncias húmicas no solo e Helena et al. (2000) usaram a PCA no estudo da evolução temporal da com posição de águas subterrâneas.

Finalizando, constata-se que m étodos, como o estudo de correlações individuais entre variáveis, ainda são aplicados em sistemas como os aqui descritos, em bora para isso eles se m ostrem m uito limitados. Existe portanto, a necessidade de uma maior interdisciplinaridade na abordagem das questões do solo e, para isso, os "qu im iom e trista s" poderão desempenhar um papel im portante ju n to aos pesquisadores de áreas correlatas da ciência am biental.

(33)

---REFERÊNCIAS BIBLIO G RÁ FIC A S

ALMENDROS, G. Sorptive interactions of pesticides in soils tre a te d w ith m o d ifie d hum ic acids. European Journal of Soil Science, v .46, p .287-301, 1995.

BRUNS, R. E.; FAIGLE, J. F. G. Quimiometria. Química Nova, v .8, p .8 4 -9 9 , 1 985.

DUFFY, B. K.; OWNLEY, B. H.; WELLER, D. M. Soil chemical and physical properties associated w ith supression of take-all of w heat by trichoderma koningii. Phytopathology, v .8 7 , p. 1118- 1124, 1997.

FORINA, M .; ARM ANINO, C.; LANTERI, S.; LEARDI, R. M ethods o f v a rim a x ro ta tio n in fa c to r analysis w ith applications in clinicai and food chemistry. Journal of Chemometrics, v .3, p .1 15- 125, 1988.

GELADI, P.; KOWALSKI, B. R. Partial least squares regression: a tu to ria l. Analitica Chimica Acta, v.1 8 5 , p .1-17, 1986.

GONZÁLEZ-PRIETO, S .J.; VILLAR, M. C.; CARBALLAS, M .; C A R B A L L A S , T. N itrogen mineralization and its controlling factors in various kinds o f hum id-zone soils. Plant and Soil, v.1 4 4 , p.31-44, 1992.

HELENA, B.; PARDO, R.; VEGA, M.; BARRADO, E.; FERNANDEZ, J .M .; FERNANDEZ, L. Temporal evolution o f groundw ater com position in na alluvial aquifer (pisuerga river, spain) by principal component analysis. Water Research, v .34, p.807-816, 2 0 0 0 .

HENDERSON, T. L.; SZILAGYI, A .; BAUMGARDNER, M. F.; CHEN, C. T .; LANDGREBE, D. A. spectral band selection for classification of soil organic m atter co n te n t. Soil Science Society of

America Journal, v .53, p .1778-17 84, 1989.

HORWATH, W. R.; ELLIOT, L. F.; STEINER, J. J.; DAVIS, J. H.; GRIFFITH, S. M. D enitrification in cultivated and noncultivated riparian areas of grass cropping system s. Journal of Environmental

Quality, v .27, p .225-231, 1998.

JÒRESKOG, K. G.; KLOVAN, J. E.; REYMENT, R. A. Geological factor analysis. A m ste rd a m : Elsevier Science, 1976.

KOKOT, S.; KING, G.; KELLER, H. L.; MASSART, D. L. M ic ro w a v e d ig e s tio n : an analysis of procedures. Analitica Chimica Acta, v .259, p.267-279, 1992.

KRIEG, M.; EINAX, J. Chemometric Characterization of Soil D epth Profiles. Fresenius Journal of

Analytical Chemistry, v .348, p.49 0 -4 9 5 , 1994.

MARTENS, H.; NAES, T. Multivariate caiibration. New York: John W iley & Sons, 1 989. p .97-108.

(34)

II. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS NA ANÁLISE INTEGRADA DE DADOS NÉMETH, T .; BORSZÉKI, J .; GEGUS, E. Correlation study of soil and plant nutritive elements by

principal co m p o n e n t analysis. Canadian Journal of Applied Spectroscopy, v .38, p. 121 -124, 1993.

NOLIN, M. C.; W A N G , C.; CAILLIER, M. J. Fertility grouping of m ontreal lowlands soil mapping units based on selected soil characteristics o f the plow layer. Canadian Journal of Soil Science, v.6 9 , p .5 2 5 -5 4 1 , 1989.

PICCOLO, A . Hum us and soil conservation. In: PICCOLO, A ., ed. Humic substances in terrestrial

ecosystems. A m sterdam : Elsevier Science, 1996. p .225-264 .

PYLE, S. M .; NOCERINO, J. M .; DEMING, S. N.; PALASOTA, J. A .; PALASOTA, J. M.; MILLER, E. L.; H ILLM AN , D. C.; KUHARIC, C. A.; COLE, W. H.; FITZPATRICK, P. M.; WATSON, M. A .; NICHOLS, K. D. Comparison of AAS, ICP-AES, PSA, and XRF in determining lead and cadmium in soil. Environmental Science and Technology, v .30, p .204-213 , 1996.

QUIROGA, A. R.; BUSCHIAZZO, D. E.; PEINEMANN, N. M anagem ent discrim inant properties in semiarid soils. Soil Science, v. 163, p.591 -597, 1998.

SENA, M .M .; POPPI, R.J.; FRIGHETTO, R.T.S.; VALARINI, P.J. Estudo quimiométrico do efeito de práticas de m anejo do solo sobre parâm etros bioquím icos e biológicos em Guaíra/SP. In : CONGRESSO BRASILEIRO DE QUÍMICA, 3 8 ., 1998, São Luís, M A . Anais... São Luiz: SBQ,

1998.

SENA, M. M .; POPPI, R. J .; FRIGHETTO, R.T.S.; VALARINI, P.J. A plicação da análise de componentes principais (PCA) no estudo do efeito de práticas de manejo de solos sobre parâmetros quím icos e b io ló g ico s em Suzano/SP. In: REUNIÃO AN U AL DA SBQ, 2 2 ., 1999, Poços de Caldas, MG. Anais... Poços de Caldas, SBQ, 1999.

SENA, M. M .; POPPI, R. J .; FRIGHETTO, R.T.S.; VALARINI, P.J. Avaliação do uso de m étodos quim iom étricos em análise de solos. Química Nova (artigo aceito para publicação em setembro/ 1999).

STEINHEIMER, T. R.; PFEIFFER, R. L.; SCOGGIN, K. D. Extraction o f atrazine, cyanazine, desethylatrazine, desisopropylatrazine, and m etolachlor from fo rtifie d western corn-belt soils by SFE w ith C 0 2 . Analytical Chemistry, v .66, p .6 4 5 -6 5 0 , 1994.

STENBERG, B.; NORDKVIST, E.; SALOMONSSON, L. Use of near infrared reflectance spectra of soils fo r objective selection o f samples. Soil Science, v .1 59, p. 109-114, 1995.

STENBERG, B.; PELL, M.; TORSTENSSON, L. Integrated evaluation of variation in biological, chemical and physical soil properties. Ambio, v .27, p .9-1 5, 1998.

TORSTENSSON, L.; PELL, M .; STENBERG, B. Need of a strategy fo r evaluation of arable soil quality. Ambio, v . 27, p .4-8, 1998.

(35)

WISE, B. M .; GALLAGHER, N. B. PLS Toolbox 2 .0 . Manson: Eigenvector Research, 1998. p .1 6- 24.

ZAMPRONIO, C. G. Determinação simultânea de ácidos fracos, em análise por injeção em fluxo, em pregando calibração m ultivariada não linear, por treinam ento de redes neurais artificiais. Campinas: Universidade Estadual de C am pinas-D epartam ento de Química Analítica, 1 998. Dissertação de Mestrado, p .30-40.

(36)

III, DETERMINAÇÃO DA UMIDADE, PH E CAPACIDADE DE RETENÇÃO DE ÁGUA DO SOLO

III. DETERMINAÇÃO DA UMIDADE, PH

E CAPACIDADE DE RETENÇÃO

DE ÃGUA DO SOLO

Regina Teresa Rosim Monteiro Rosa Toyoko Shiraishi Frighetto

São três os parâmetros fundam entais associados ao funcionam ento da cadeia biológica e bioquímica dos processos que ocorrem no solo, quais sejam a umidade, o pH e a capacidade de retenção de água.

Determinação da unidade

Procedimentos:

- Pesar aproximadamente 5g de solo úmido (passado por peneira de 2mm de malha) em recipiente de peso conhecido e em balança analítica; - Levar à estufa por 24 horas a 105°C;

- Após esse período, deixar esfriar em dessecador e pesar o recipiente com o solo seco ;

(37)

INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO - Calcular a um idade pela fórm ula:

U = W 2 - W 3 x 10 0% W 3 - W1

Onde:

W1 = p e s o do recipiente

W 2 = p e s o do recipiente + solo W 3 = p e s o do recipiente + solo seco

A um idade será dada em porcentagem correspondente à massa de solo.

D e rm in a ç ão do pH:

Medida do potencial, eletronicam ente, por meio de eletrodo combinado imerso em suspensão solo:líquido, na proporção de 1:2 ,5.

- Pesar em béquer de 50m L, 10g de solo; - A dicionar 25 m L de água deionizada ; - Deixar agitar por1 5 a 2 0 m inutos;

- Esperar decantar por cerca de 30 m inutos ou mais;

- M edir o pH do sobrenadante, no mínimo por 2 m inutos e anotar o valor.

D e te rm in a ç ã o da capacidade de retenção

de água

As avalições m icrobiológicas são conduzidas após o ajuste do conteúdo da água a um valor constante para todos os solos ou, preferencialmente, à capacidade de retenção de água, ou à percentagem desse valor. Isso assegura condições sem elhantes aos m icrorganism os quanto à disponibilidade de água, condição crucial para o seu crescim ento e atividade metabólica.

(38)

III. DETERMINAÇÃO DA UMIDADE, PH E CAPACIDADE DE RETENÇÃO DE Á G U A DO SOLO Material Funil de filtração Papel de filtro Frasco coletor Procedimento

Pesar em balança analítica 20g de solo com um idade natural, em duplicata, colocar sobre o papel de filtro acondicionado no fu n il e m ontado sobre o frasco coletor previamente pesado. A dicionar, em pequenas porções, 100g de água destilada (pesada em uma balança analítica) e deixar por uma noite. Cobrir com papel alumínio ou film e de plástico, para e vita r a evaporação. Após esse período, dar uma pequena batida na haste do fu n il para liberar as últim as gotas de água que ficam presas nela. Pesar novam ente, numa balança analítica, o frasco coletor. As te ste m u n h a s, ta m b é m em d u p lic a ta , são procedidas da mesma maneira, porém sem os solos.

Cálculo

% capacidade de retenção = [(1 OO-Wp) + W i]/d w t x 1 0 0

onde

Wp = peso da água percolada (g).

Wi = conteúdo da água (g) existente inicialm ente na am ostra. D w t = peso seco do solo (g).

(39)

(40)

IV. PROBLEMAS ENCONTRADOS NA AVALIAÇÃO DE MICRORGANISMQ DO SOLO

IV. PROBLEMAS ENCONTRADOS

NA AVALIAÇÃO

DE MICRORGANISMOS DO SOLO

Rosa Toyoko Shiraishi Frighetto René Peter Schneider

As determinações da biomassa microbiana e a atividade de microrganismos no solo apresentam um problema analítico complexo de avaliação. Vários estudos demonstraram que os métodos clássicos, como aqueles que envolvem o isolamento e subseqüente cultivo de microrganismos, não são adequados para q u a n tifica r os m icrorganism os no solo. O m étodo de contagem de m icrorganism os viáveis, em geral, subestim a a com unidade m icrobiana, quando comparado à técnica de contagem direta (Olsen & Bakken, 1987; Casida, 1 968; Faegri et al., 1 977). O baixo número de microrganismos ativos nos meios de cultura ocorrem devido aos seguintes fatores:

- somente pequena parte dos microrganismos presentes no meio ambiente está em fase de crescim ento;

- m uitos organismos têm crescim ento lento e sua detecção demandaria tem pos de incubação de várias semanas, com o risco de as colônias

(41)

de crescim ento lento serem encobertas por colônias de crescimento mais rápido;

- a grande diversidade metabólica dos microrganismos do meio ambiente dificulta sua replicação nos meios de cultura;

M étodos de contagem direta estão sujeitos, tam bém , às dificuldades técnicas quando se trata de ecossistemas do solo (Jenkinson & Ladd, 1981).

Corantes fluorescentes específicos, como por exemplo, o diacetato de fluoresceína (Schnürer & Rosewall, 1982) ou cloreto de 5-ciano-2,3-ditoluil tetrazólio (CTC) (Rodriguez et al., 1992), foram empregados para se determinar células m etaboiicamente ativas nos solos. Células ativas podem, também, ser determinadas pela combinação de auto-radiografia e m icroscopia (Bââth, 1 9 8 8 ; Ramsay, 1 9 8 4 ). E n tre ta n to , esta m etodo logia requer a tivid a d e enzimática na presença de substratos e está sujeita às lim itações associadas com a densidade de organismos e a espessura do biofilm e no campo da visão.

A existência dos problemas associados ao uso da contagem de organismos viáveis e microscopia para se estim ar a biomassa microbiana no solo tem estimulado pesquisas no desenvolvim ento de novos m étodos. Um deles trata de estim ar a biomassa microbiana medindo-se a concentração do componente bioquímico específico da célula microbiana. Componentes esses, geralmente, presentes em todas as células, como a análise de ácidos graxos fosfolipídicos (PLFA = Phospholipid fa tty acid), podem ser utilizados para se estim ar a biomassa bacteriana e fúngica do solo (Frostegârd & Bââth, 1996) e os com ponentes que são restritos a subgrupos, como o ergosterol para fungos (Eash et al., 1996) e o lipopolissacarídeo para bactérias (Zelles & Bai, 1993), são u tilizad os para se d e fin ir a e s tru tu ra da com unidade. Os m étodos bioquímicos não apresentam aqueles problemas associados ao método clássico que dependem do c re s c im e n to m icro b ia n o e, por c o n se q ü ê n cia , não apresentam o problema inerente à seleção microbiana aos nutrientes e nem requerem a remoção das células presentes nas superfícies. Os m étodos

(42)

IV. PROBLEMAS ENCONTRADOS NA AVALIAÇÃO DE MICRORGANISMQ DO SOLO bioquím icos são geralm ente e x tra tiv o s e estão m uitas vezes sujeitos à variabilidade da eficiência de extração e rom pim ento (lise) das células.

Nota-se que nenhum dos m é todo s, por si só, é absoluto, havendo necessidade de realizar um conjunto de análises para se estim ar a comunidade microbiana e a sua biomassa.

REFERÊNCIAS B IB LIO G R Á F IC A S

o o

BAATH, E. A utoradiographic determ ination o f m etabolically active fungai hyphae in forest soil.

Soil Biology and Biochemistry, v .20, p.1 23-1 25, 1988.

CASIDA, L. E. M ethods fo r the isolation and estim a tio n o f a c tiv ity o f soil bactéria. In: GRAY, T.R.G.; PARKINSON, D., ed. The ecology of soil bactéria. Liverpool: Liverpool University Press,

1968.

EASH, N. S.; STAHL, P.D.; PARKIN, T.B.; KARLEN, D.L. A sim plified m ethod fo r extraction of ergosterol from soil. Soil Science Society of America Journal, v .60, p.4 6 8 -4 7 1 , 1996. FAEGRI, A.; LID TORSVIK, V .; GOKSOYR, J. Bacterial and fungai activities in soil: separation of

bactéria and fungi by a rapid fractionation centrifugation technique. Soil Biology and Biochemistry, v.9, p.105-11 2, 1977.

FROSTEGÂRD, A .; BÂÁTH, E. The use o f phospholipid fa tty acid analysis to estim ate bacterial and fungai biomass in soil. Biology and Fertility of Soils, v .22, p .59-65, 1996.

JENKINSON, D. S.; LADD, J.N. Microbial biomass in soil: measurement and turnover. In: PAUL, E. A.; LADD, J.N ., ed. Soil biochemistry. N ew York: Mareei Dekker, 1981. v . 5, p.41 5-471. OLSEN, R. A.; BAKKEN, L.R. Viability of soil bactéria: optim ization of the plate-count technique.

Microbial Ecology, v .1 3, p .59-74, 1987.

RAMSAY, A. J. Extraction of bactéria from soil: efficiency of shaking or ultrasonication as indicated by direct counts and autoradiography. Soil Biology and Biochemistry, v. 16, p.475-481 , 1984. RODRIGUEZ, G. G.; PHIPPS, D.; ISHIGURO, K.; RIDGW AY, H. F. Use o f a fluorescent redox

probe fo r d ire ct visualization of a c tiv e ly respiring bactéria. Applied and Environmental

Microbiology, v .58, p .1 801-180 8, 1992.

SCHNÜRER, J.; ROSEWALL, T. Fluorescein diacetate hydrolysis as a measure o f total microbial activity in soil and litter. Applied and Environmental Microbiology, v .43, p .1 256 -1 2 6 1 , 1982.

(43)

ZELLES, L.; BAI, Q.Y. Fractionation of fa tty acids derived from soil lipids by soiid phase extraction and th e ir qu a n tita tive analysis by GC-MS. Soil Biology and Biochemistry, v .25, p .4 9 5 -5 0 7 , 1993.

INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO S O L O — — — - ...

INDICAOORES BIOLOGICOS E BIOQUiMICOS DA QUALIDADE DO SOLO

ZELLES, L.: BAI, Q, Y. Fractionation of fatty acids derived trom soillipids by SOlid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biology and Biochemistry, V .25. p.495-507, 1993.

(44)

V. MÉTODOS BÁSICOS PARA CONTAGEM DE PATÓGENOS DO SOLO

V. MÉTODOS BÁSICOS

PARA CONTAGEM DE PÁTÓGENOS

DO SOLO: MEIOS SELETIVOS

PÁRA ISOLAMENTO, AVALIAÇÃO

E IDENTIFICAÇÃO

Pedro José Valarini

Introdução

Os fitopatógenos do solo são fatores restritivos à maioria das culturas. Valarini et al. (1996 e 1997) observaram que^a com pactação do s o M e ra proporcional à 1 severidade das doenças causadas por Sclerotinia sclerotiorum (mofo branco), Fusarium solani e Rhizoctonia so/ani (podridões radiculares) e

Sc/erotium ro lfsii (podridão do colo), principalmente em culturas de feijão e

tomate. Para melhor compreender esta correlação, ressalta-se a importância do estudo integrado dos parâmetros físico, químico, biológico e bioquímico do solo.

0 isolamento e a contagem de microrganismos do solo nos proporcionam informação útil quanto ao efeito de fatores ambientais sobre a comunidade