A interpretação dos resultados do teste, porém, requer alguns cuidados (Ullrich et al., 1996). O teste baseado na redução de um com posto por elétrons desviados da cadeia de transporte de elétrons afetará a taxa de crescimento do organismo. Teoricamente o seqüestro de elétrons em nível de succinato- e NAD(P)H- desidrogenases reduz a produção de ATP na cadeia respiratória de 3 A T P 's para somente um ATP. Na prática, esta retirada nunca funciona com eficiência máxima. Dados obtidos por Smith & McFethers (1997) indicam que a relação entre consumo de oxigênio e redução de formazana em células de E. coli é de cerca de 5 para 1, ou seja 5 moles de oxigênio são consumidas para cada mol de formazana produzida, o que indica que somente 20% dos elétrons da cadeia de transporte de elétrons são absorvidos pelo CTC. A redução da disponibilidade de energia na célula tam bém afetará a capacidade do microrganismo em absorver com postos, como por exemplo a glucose, que, devido à sua reduzida co n ce n tra çã o em am bien tes n a tura is, são assimilados por sistemas de transporte dependentes de ATP. Todos estes fatores contribuem para reduzir a taxa de crescimento de organismos expostos ao CTC ou a outros com postos de atuação sim ilar. Ullrich et al. (1996) afirmaram que as taxas de crescim ento calculadas com base em dados sobre a q u a n tid a d e de m ic ro rg a n is m o s a tiv o s o b tid a s co m CTC seria m
XIV. DETERMINAÇÃO DE MICRORGANISMOS METABOLICAMENTE ATIVOS EM AMBIENTES NATURAIS
superestimadas e irreais, comparadas às taxas calculadas com com postos radioativos. O cálculo utilizado é, porém, questionável. O consumo de tim idina radioativa medido na amostra foi dividido pelo número de microrganismos ativos determinados por auto-radiografia, m uito maior do que o número de organismos ativos no teste de CTC. Este cálculo, obviamente, resulta em uma superestimação da taxa de crescim ento dos organismos marcados com CTC. O correto seria determinar a taxa de conversão de substratos radioativos separadamente para os organismos marcados com CTC e depois determinar as suas taxas de crescimento. Este exercício, porém, indica claramente o significado do teste de CTC. A redução de CTC ocorre primordialmente no interior de células com taxas de m etabolism o significativas, pois só serão detectados os organismos onde a abstração de cerca de 20% dos elétrons transferidos na cadeia respiratória reduz uma quantidade de CTC suficiente para detecção por fluorescência. O teste, portanto, identifica os organismos mais ativos em um ambiente. Organismos com metabolismo mais lento só serão detectados com métodos radioativos. Apesar de seu maior número (Ullrich et al., 1996), a sua contribuição para as taxas de biotransform ação total em um ambiente será consideravelm ente menor do que a contribuição das células com metabolismo mais intenso detectadas com CTC.
Trabalhos sobre formas viáveis, mas não cultiváveis de microrganismos indicam que o teste de CTC detecta níveis m uito reduzidos de metabolismo. Em experimentos sobre a form ação de células viáveis, mas não cultiváveis de C am pylobacter jejun i, o número to ta l de células detectado por DAPI permaneceu inalterado em 108/mL ’ durante os 30 dias do experimento, o número de organismos detectáveis por plaqueamento diminuiu para menos de 1CFU m L 1 após 16 dias e o número de células detectáveis por CTC permaneceu por volta de 107/m L 1 durante os últim os 14 dias do experimento (Tholozan et al., 1999). Resultados similares foram obtidos com Salmonella
INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO
Procedimento
O teste de CTC pode ser feito ta n to com os substratos naturais presentes no ambiente, ou seja, sem a adição de fontes de nutrientes exógenas, como com substratos adicionados ao meio. Antes de cada experim ento, devem ser feitos alguns experimentos para otim ização do teste. Os seguintes fatores devem ser considerados:
- Tempo de incubação: é o tem po de exposição da amostra que permite
detectar o maior número de células ativas. O tem po de incubação ideal varia entre 4 e 6 horas para solos (Winding et al., 1 99 4 ; Yu et al., 1995) a 1 hora, no caso de am ostras de água (Schaule et al., 1993; Kawai et al., 1999). O tem po ideal de incubação deve ser determ inado separadam ente para cada tip o de am ostra . Tem pos m ais c u rto s produzirão resultados mais repre senta tivos para as am ostras, pois in c u b a ç ã o p ro lo n g a d a o o d e a tiv a r o m e ta b o lis m o de c é lu la s senescentes.
- Concentração de CTC: as concentrações ideais de CTC para incubação
variam entre 2mM e 1 OmM e devem ser determinadas em experim entos preliminares.
- Forma de incubação: as am ostras devem ser agitadas, se possível,
durante o período de incubação
- Adição de substratos: a adição de substratos às amostras pode estim ular
a produção de CTC. Nem todos os substratos são, porém, adequados para este fim . Deve-se tam bém considerar que esta adição altera as condições metabólicas das células e que nem todos os organism os presentes na amostra reagirão da mesma forma a uma substância. Se o o b je tivo do e xp e rim e n to fo r o e stu d o de sistem as n a tu ra is, é recomendável conduzir os testes de CTC somente com os substratos naturalmente presentes na am ostra.
XIV. DETERMINAÇÃO DE MICRORGANISMOS METABOLICAMENTE ATIVOS EM AMBIENTES NATURAIS
Formato do teste
O te s te é sim ple s e dem anda po ucos e q u ip a m e n to s e s p e c ífic o s : m icroscópio de fluorescência, sistema de filtração de amostras (de preferência m e m b ra n a de 0 ,2 m m ), c o ra n te s (CTC e DAPI, q u a lid a d e S igm a ou equivalente), água destilada ou de qualidade similar. No caso de amostras de solo, a incubação com CTC pode ser feita diretam ente no solo, sendo as bactérias separadas e coletadas em filtros após o térm ino da incubação. No caso de amostras de água, a incubação com CTC pode ser feita diretam ente na amostra, sendo esta analisada diretamente ou indiretam ente, após a coleta dos microrganismos em um filtro.
Recomenda-se preparar uma solução com alta concentração de CTC (solução-estoque), diluindo-se a quantidade apropriada do com posto em água d e s tila d a ou filtra d a por siste m a s com o por exem plo M illi-Q , am bas este rilizada s. A con centraçã o de CTC nesta solução-estoq ue deve ser calculada de maneira a perm itir diluições que não alterem demasiadamente o volume da amostra. Após a adição do CTC, a amostra deve ser incubada durante o tem po ideal estabelecido nos experimentos preliminares.
A análise do resultado é feita por microscopia de fluorescência, utilizando- se os filtros apropriados para excitação (380nm) e detecção da fluorescência e m itid a (6 0 2 n m ). O te ste pode ser com plem entado com o m étodo de contagem total de microrganismos baseado na marcação com DAPI ( 4 ', 6 '- diamidino-2-phenylindol, excitação: 340nm ; emissão: 450nm , Yu et al., 1 995). DAPI também é preparado como solução-estoque em água destilada ou similar, sendo adicionado à amostra a uma concentração de 1 m g/m l. Esta incubação é feita após a incubação com CTC e dura entre cinco e vinte minutos, devendo o tem po apropriado de incubação também ser verificado em experimentos p re p a ra tó rio s. As células m arcadas com DAPI e com CTC podem ser visualizadas simultaneamente na mesma amostra, pois as células marcadas com CTC fluorescem em cor verm elha, e aquelas m arcadas com DAPI fluorescem em cor amarela ou verde-claro.
REFERÊNCIAS B IB LIO G RÁ FIC A S
HERNANDEZ, M .; MILLER, S. L.; LANDFEAR, D. W .; MACHER, J. M. A combined fluorochrom e method for quantitation of metabolically active and inactive airborne bactéria. Aerosol Science and Technology, v .30, p. 145-160, 1999.
KAW AI, M.; YAM AGUCHI, N.; NASU, M. Rapid enumeration of physiologically active bactéria in purified w a te r used in the pharm aceutical m anufacturing process. Journal of Applied Microbiology, v .86, p.496-504, 1999.
MARSH, P.; MORRIS, N. Z.; WELLINGTON, E. M. H. Quantitative molecular detection of Salmonella typhimurium in soil and demonstration of persistence of an active but non-culturable population. FEMS Microbiology and Ecology, v .27, p .351 -363, 1998.
RODRIGUEZ, G. G.; PHIPPS, D.; ISHIGURO, K.; RIDGWAY, H. F. Use of a fluorescent redox probe fo r direct visualization of actively respiring bactéria. Applied and Environmental Microbiology, v.58, p .1801-18 08, 1992.
SCHAULE, G.; FLEMMING H.-C.; RIDGWAY, H. F. Use of 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride fo r q u a n tifyin g plankton ic and sessile respiring bactéria in drinking w ater. Applied and Environmental Microbiology, v .59, p.3850-3857, 1993.
SMITH, J. J.; MCFETHERS, G. A. Mechanisms of INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride), and CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride) reduction in Escherichia co li K-12. Journal of Microbiological Methods, v .29, p. 161-175, 1997.
THOLOZAN, J. L.; CAPPELIER, J. M.; TISSIER, J. P.; DELATTRE, G.; FEDERIGHI, M. Physiological characterization of viable-but-nonculturable Campylobacterjejunicells. Applied and Environmental Microbiology, v .65, p. 1110-1116, 1999.
THOM, S. M .; HOROBIN, R. W .; SEIDLER, E.; BARER, M. R. Factors affecting the selection and use o f tetrazolium salts as cytochemical indicators of microbial viability and activity. Journal of Applied Bacteriology, v .74, p.433-443, 1993.
ULLRICH, S.; KARRASCH, B.; HOPPE, H.-G.; JESKULKE, K.; MEHRENS, M. Toxic e ffe c ts on bacterial m etabolism of the redox dye 5-cyano-2,3-ditoluyl tetrazolium chloride. Applied and Environmental Microbiology, v .62, p.4587-4593, 1996.
WINDING, A .; BINNERUP, S. J.; S0RENSEN, J. V iability of indigenous soil bactéria assayed by respiratory a ctivity and grow th. Applied and Environmental Microbiology, v .60, p .2 8 6 9 -2 8 7 5 , 1994.
YU, W .; DODDS, W. K.; BANKS, M. K.; SKALSKY, J.; STRAUSS, E. A. Optim al staining and sample storage tim e for direct microscopic enumeration of total and active bactéria in soil w ith tw o fluorescent dyes. Applied and Environmental Microbiology, v .61, p .3 3 6 7 -3 3 7 2 , 1995.
INDICADORES BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DA QUALIDADE DO SOLO - ■ ■
XV. ESTIMATIVA DA ATIVIDADE MICROBIANA: MÉTODO DE HIDRÓLISE DO DIACETATO DE FLUORESCEÍNA