DESCRIÇÃO DAS ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS

A obtenção de DNA de boa qualidade e em quantidade adequada permitiu a realização de CMA que foi capaz de identificar diversas alterações cromossômicas submicroscópicas no material examinado: células mononucleares de todos os indivíduos testados (marcados com “” no heredograma da figura 13) e células de saliva dos indivíduos afetados por LLC.

Na avaliação geral, com a aplicação da técnica de CMA no DNA extraído dos mononucleares, identificamos CNVs em 50 regiões cromossômicas envolvendo todos os indivíduos analisados, das quais 38 constituíam deleções e 17 representam ganhos (em cinco das regiões com CNVs notamos a concomitância de deleções e ganhos em diferentes indivíduos). Entre as deleções, três CNVs (1q44, 2q32 e 6p22) foram descartadas por estarem abaixo do padrão considerado ideal para identificação pelo sinal de hibridização (menor que 25 sondas). Foram também desconsideradas para a análise dos resultados as CNVs relacionadas com regiões cromossômicas sem função conhecida (1q24.3, 2q21.3, 6q12, 9p21.3, 13q21.33, Xq27.3), aquelas identificadas de modo coincidente em um dos indivíduos afetados e nos indivíduos não-afetados e as presentes exclusivamente nos indivíduos não- afetados (sem relação provável com os mecanismos de herança ou progressão de doença). Dessa forma, restaram 23 CNVs diretamente relacionadas a regiões codificantes (genes e/ou introns), equivalendo a 15 regiões de deleção e oito de ganho (Tabelas 13 e 14).

Nas Tabelas 13 e 14 podemos observar que sete das 23 CNVs identificadas (quatro com deleção e três com ganhos) estavam presentes simultaneamente nos três indivíduos afetados (B2, B6 e C8). Ainda sobre este conjunto de CNVs, nos quatro eventos de deleção as alterações foram também encontradas em pelo menos um dos indivíduos não-afetados (B5, C5, C6, C7 ou C9). Nenhuma alteração cromossômica estava presente de maneira simultânea e exclusiva em todos os indivíduos afetados (Figura 16).

Tabela 13: Variações no número de cópias (deleções) relacionadas com regiões codificantes detectadas por análise cromossômica por microarranjo nos indivíduos afetados.

Deleções Função codificante relacionada Indivíduo

1p33 Inclui parte do gene AGBL4 C8

1q21.3 CNV inclui gene LCE1D B2

3p11 CNV inclui intron EPHA3 B2, B6

3q28 CNV inclui intron TP63 B2, C8

5q35 CNV inclui gene BTNL3 B2, B6, C8(*)

8p11 CNV inclui genes ADAM5P e ADAM3A B2, B6, C8(*)

10q11.22 CNV inclui genes CTSL1P2, FAN21B, ANXA8L2 e ANTXLL B2

11q14 CNV inclui gene TRIM4 B6

11p15 CNV inclui genes OR52M5 e OR52M1 B2

11p15 CNV inclui gene MRGPRX1 B6

12p13.3 CNV inclui genes SLC2A3 e SLC2A14 B2, B6, C8(*)

13q14.2 Inclui genes DLEU1, DLEU2, miR-15-A, miR-16-1, miR-3613,

TRIM13, KCNRG, ST13P4, DLEU7, DLEU-AS1, RNASEH2B- AS1 e RNASEH2B

B6, C8

16p13.3 CNV inclui intron LMF1 B2

19p11 CNV inclui gene ZNF826P B2

Xp21.2 CNV inclui intron IL1RAPL1 B2, B6, C8(*)

Descrição das regiões identificadas como deleções pela análise cromossômica por microarranjo e da respectiva função gênica possivelmente comprometida, em cada um dos sujeitos da pesquisa. (*) indica que a alteração também foi identificada em pelo menos um dos indivíduos não-afetados.

Tabela 14: Variações no número de cópias (ganhos) relacionadas com regiões codificantes detectadas por análise cromossômica por microarranjo nos indivíduos afetados.

Ganhos Função codificante relacionada Indivíduo

4q13.2 CNV inclui parte do gene UGT2B17 B2, B6, C8(*)

10q11.22 CNV inclui genes SYT15, GPRIN2, PPYR1 e

LOC643650 B6, C8

11p11 CNV inclui intron LOC440040 C8

trissomia 12 B2

16p11 CNV inclui genes LOC283914, LOC146481,

LOC100130700 B2

17q21.1 CNV inclui parte do gene KANSL1 B2, B6, C8(*)

22q11 CNV inclui genes IGLL5 e miR-650 B2, B6, C8(*)

Xp22.3 CNV inclui gene SHOX B2, C8

Descrição das regiões identificadas como ganhos pela análise cromossômica por microarranjo e da respectiva função gênica possivelmente comprometida, em cada um dos sujeitos da pesquisa. (*) indica que a alteração também foi identificada em pelo menos um dos indivíduos não-afetados.

Figura 16: Visão geral da análise cromossômica por microarranjo de todos os cromossomos dos sujeitos da pesquisa indicando que nenhuma alteração foi encontrada simultânea e exclusivamente entre os afetados.

Cada um dos sujeitos da pesquisa está representado por uma linha colorida. Deleções estão representadas por “” e ganhos estão representados por “”. Os cromossomas 1, 12, 22 e Y estão identificados, o cromossoma 13 aparece destacado pelo quadrado azul.

Pelo menos três (13%) das alterações cromossômicas identificadas por meio da CMA estão diretamente relacionadas a fisiopatogênese da LLC em concordância com o mecanismo proposto por Wang e Wang em 2013 e representado na Figura 12 (WANG, C.; WANG, 2013): +(12) no indivíduo B2 e del(13q14) nos indivíduos B6 e C8 (Figuras 17, 18 e 19). Voltando a Tabela 9 podemos verificar que a del(13q14) foi previamente reconhecida no indivíduo C8 (submetido a investigação por FISH) mas não no indivíduo B6 (submetido a investigação por citogenética clássica).

Outra observação importante é que pela técnica de CMA ficou evidente que a ocorrência de del(13q14) em B6 e C8 se deu de maneira distinta, uma vez que a deleção foi identificada em heterozigose no primeiro indivíduo e em homozigose no segundo (Figuras 18 e 19). Este fato, aliado às demais diferenças no perfil citogenético submicroscópico, pode contribuir para a melhor compreensão da diferença de comportamento da LLC observada nestes sujeitos da pesquisa, a despeito das semelhanças destacadas pelos sistemas de estadiamento clínico e genético/molecular no momento do diagnóstico (como pode ser apreciado analisando as informações contidas na tabela 10).

O perfil de CMA obtido à partir das células da saliva dos indivíduos B2, B5 e C8 (afetados por LLC) está representado nas Figuras 20, 21 e 22, respectivamente. Como podemos notar, com exceção das alterações reconhecidamente associadas a patogênese da LLC previamente descritas (Tabelas 13 e 14, Figuras 17, 18 e 19), não houve distinção significativa entre o conjunto de alterações citogenéticas submicroscópicas identificado nas células da saliva com aquele observado nos mononucleares de sangue periférico.

Figura 17: Análise cromossômica por microarranjo do DNA de mononucleares do indivíduo B2 demonstrando a presença de +(12).

Deleções estão representadas por “” e ganhos estão representados por “”. O cromossoma 12 está destacado pelo quadrado azul e a trissomia do mesmo está representada pelo empilhamento de “”. As linhas pontilhadas em azul claro indicam os locais de hibridação das sondas de SNPs com os fragmentos de DNA. A presença de 4 linhas revela heterozigose duplicada pela +(12).

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Figura 18: Análise cromossômica por microarranjo do DNA de mononucleares do indivíduo B6 demonstrando a presença de del(13q14) em heterozigose.

Deleções estão representadas por “” e ganhos estão representados por “”. O cromossoma 13 está destacado pelo quadrado azul e a deleção da região q14 está representada por “”. As linhas pontilhadas em azul claro indicam os locais de hibridação das sondas de SNPs com os fragmentos de DNA. A presença de 3 linhas revela persistência de heterozigose.

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Figura 19: Análise cromossômica por microarranjodo do DNA de mononucleares do indivíduo C8 demonstrando a presença de del(13q14) em homozigose.

Deleções estão representadas por “” e ganhos estão representados por “”. O cromossoma 13 está destacado pelo quadrado azul e a deleção da região q14 está representada por“”. As linhas pontilhadas em magenta indicam os locais de hibridação das sondas de SNPs com os fragmentos de DNA. A presença de apenas 2 linhas revela perda de heterozigose (deleção bialélica ou em homozigose).

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Figura 20: Comparação do análise cromossômica por microarranjo obtido à partir de células da saliva e de mononucleares do indivíduo B2 não revela diferenças significativas.

Deleções estão representadas por “” e ganhos estão representados por “”. Os achados de análise cromossômica por microarranjo das células da saliva e dos mononucleares estão representados nas linhas magenta e verde, respectivamente. Os cromossomas 1, 22 e Y estão identificados, o cromossoma 12 está destacado pelo quadrado azul e a trissomia do mesmo está representada pelo empilhamento de“” na linha verde.

Figura 21: Comparação do análise cromossômica por microarranjo obtido à partir de células da saliva e de mononucleares do indivíduo B6 não revela diferenças significativas.

Deleções estão representadas por “” e ganhos estão representados por “”. Os achados de análise cromossômica por microarranjo de células da saliva e de mononucleares estão representados nas linhas verde e cinza, respectivamente. Os cromossomas 1, 22 e Y estão identificados, o cromossoma 13 está destacado pelo quadrado azul e a deleção da região q14 está representada por “” na linha cinza.

Figura 22: Comparação do análise cromossômica por microarranjo obtido à partir de células da saliva e de mononucleares do indivíduo C8 não revela diferenças significativas.

Deleções estão representadas por “” e ganhos estão representados por “”. Os achados de análise cromossômica por microarranjo de células da saliva e de mononucleares estão representados nas linhas amarela e magenta, respectivamente. Os cromossomas 1, 22 e Y estão identificados, o cromossoma 13 está destacado pelo quadrado azul e a deleção da região q14 está representada por “” na linha magenta.