Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa Stricto Sensu em Ciências Genômicas e
Biotecnologia
INVESTIGAÇÃO DE ALTERAÇÕES CITOGENÉTICAS
RELACIONADAS A LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA
FAMILIAR POR MEIO DA TÉCNICA DE ANÁLISE
CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO
Brasília - DF
2013
Autor: Jorge Vaz Pinto Neto
Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira
INVESTIGAÇÃO DE ALTERAÇÕES CITOGENÉTICAS
RELACIONADAS A LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA FAMILIAR POR MEIO DA TÉCNICA DE ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito para obtenção do Título de Doutor em Ciências Genômicas e Biotecnologia
Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira
Coorientadoras: Profª. Dra. Rosângela Vieira de Andrade e Profª Dra. Juliana Mazzeo.
Brasília 2013
7,5cm
Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB P659i Pinto Neto, Jorge Vaz.
Investigação de alterações citogenéticas relacionadas à leucemia linfóide crônica familiar por meio da técnica de análise cromossômica por microarranjo. / Jorge Vaz Pinto Neto – 2014.
92 f.; il.: 30 cm
Tese (doutorado) – Universidade Católica de Brasília, 2014. Orientação: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira
Coorientação: Rosângela Vieira de Andrade
1. Leucemia linfóide. 2 Análise citogenética. 3. Antecipação genética. 4. Prognóstico. I. Pereira, Rinaldo Wellerson, orient. II. Andrade, Rosângela Vieira de, coorient. III. Mazzeo, Juliana, coorient. IV. Título.
Tese de Doutorado de autoria de Jorge Vaz Pinto, intitulado "INVESTIGAÇÃO DE ALTERAÇÕES CITOGENÉTICAS RELACIONADAS A LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA FAMILIAR POR MEIO DA TÉCNICA DE ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO", apresentado como requisito para obtenção do grau de Doutor em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, em 16 de dezembro de 2013, aprovado pela banca examinadora abaixo assinada:
___________________________________ Prof. Dra. Carmen Sílvia Passos Lima Faculdade de Ciências Médicas – Unicamp/SP
___________________________________ Dr. Carlos Alberto Pinto da Silveira Hospital e Base de Brasília – SES/DF ___________________________________
Prof. Dr. Felipe Saldanha Araújo Faculdade de Ciências da Saúde - UnB ___________________________________
Prof. Dr. Robert Edward Pogue
Ciências Genômicas e Biotecnologia – UCB
Brasília 2013
Dedico esse trabalho às pessoas que mais amo e sem as quais a vida perderia todo o sentido:
Aymoré Vaz Pinto, meu modelo de pai, homem, professor e cientista;
Gabriela Pinheiro Pinto (in
memorian), com a lembrança boa das
nossas “noites em claro” (e não foram poucas!); Adriana Dornellas C. D. de Oliveira, por ter me proporcionado 26 anos de grandes transformações (que passaram tão depressa!) e por ter me agüentado esse tempo todo (tenho ainda muito pique para pelo menos mais 30!); Amanda Duarte Vaz Pinto, que chegou primeiro e por isso sofreu mais (“filhota”, eu já te amava muito antes de tudo isso, e agora então nem se fala!); Gabriel Duarte de Oliveira Vaz Pinto, veio depois, deu mais sorte... chegou para completar o time, já se achando o “dono da bola” (e desde a maternidade todo mundo sabe que é muito bom ter você aqui por perto!).
AGRADECIMENTOS
Professor Rui Caldas: por que confiou e meu deu “mais uma chance”.
Rinaldo Wellerson Pereira: meu orientador predileto, que como todo grande brasileiro “não desiste nunca”... e não desistiu de mim!
Rosângela Vieira de Andrade: que entre tantas outras orientações, fez a última revisão comigo... antes de ir para Paris.
Juliana Mazzeo: entrou por último, mas para exercer um papel fundamental... além de tudo é a representante internacional do projeto!
Carmen Silvia Passos Lima: por ter me ensinado desde muito cedo o “valor da sopa de letrinhas”... muito obrigado!
Felipe Albuquerque Marques: grande amigo e consultor particular para assuntos de bioquímica e formatação... valeu!
Larissa Lemos M. Cavalcante e Laureane Pavanelli: queridas colegas de pós-graduação, obrigado pela preciosa ajuda e pela paciência.
Um agradecimento especial aos pacientes e familiares que serviram de motivação e que generosamente doaram seu tempo e “seu sangue” para que esse trabalho fosse possível.
“Somos todos muito ignorantes. O
que ocorre é que nem todos ignoram
as mesmas coisas.”
Referência: PINTO NETO, Jorge Vaz. Título: Investigação de alterações citogenéticas relacionadas a leucemia linfóide crônica familiar por meio da técnica de análise cromossômica por microarranjo. 2013. 92 folhas. Tese (Doutorado em Ciências Genômicas e Biotecnologia – Universidade Católica de Brasília, Brasília – DF, 2013.
A leucemia linfóide crônica (LLC) é a leucemia mais comum nos países ocidentais. A baixa incidência entre orientais e a maior prevalência entre familiares de primeiro grau de portadores de LLC constituem fortes evidências da influência dos fatores genéticos da população e do indivíduo nesta patologia. Estudos epidemiológicos de base populacional demonstram que em até 9% dos casos são encontradas evidências de acúmulo de casos de LLC entre os membros de uma mesma família, caracterizando uma forma da doença denominada de “LLC familiar”. Ensaios com múltiplas gerações indicam que na LLC familiar a idade média para o início da doença nos descendentes é significativamente mais precoce quando comparada a dos pais e que nesses casos a LLC eventualmente se comporta de maneira mais agressiva, caracterizando o fenômeno de “antecipação genética” (AG). Anormalidades cromossômicas podem ser detectadas na maioria dos pacientes com LLC e estão associadas ao prognóstico, destacando-se del(11q23), del(13q14), +(12) e del(17p), as quais foram arroladas com a fisiopatogênese da LLC em um circuito de interação “TP53-microRNA”, com o envolvimento dos genes ATM,
MDM2, BCL-2, MCL1, TP53 e dos microRNAs miR-15a, miR-16-1 e miR-34b/c.
A análise de anormalidades cromossômicas em nível submicroscópico em LLC familiar constitui um excelente modelo para a identificação de possíveis fatores relacionados com a suceptibilidade e com a fisiopatogênese dessa doença. No presente estudo avaliamos a apresentação da LLC comprometendo três indivíduos de uma mesma família. Informações clínicas e dados laboratoriais estão disponíveis para os três indivíduos afetados e para cinco não-afetados. O diagnóstico de LLC foi confirmado por imunofenotipagem (citometria de fluxo). Com DNA extraído de células mononucleares e de saliva, procedemos a análise cromossômica por microarranjo (CMA) para os oito sujeitos da pesquisa. Vinte e três alterações cromossômicas envolvendo regiões codificantes foram identificadas nos indivíduos afetados, entre as quais destacam-se a +(12) em um indivíduo e del(13q14) em dois indivíduos. A CMA revelou também que em um dos indivíduos com del(13q14) a deleçao ocorreu em homozigose (com consequente perda de heterozigose) e estava associada a uma doença de comportamento mais agressivo (início mais precoce e menor tempo de duplicação linfocitária), caracterizando ao fenômeno de AG nesta família. Novos estudos serão necessários para que o sistema de estadiamento citogenético/molecular possa ser validado no ambiente da LLC familiar. Neste contexto, o fenômeno de AG deve ser somado aos demais fatores para que
Palavras-chave: Leucemia linfóide. Análise citogenética. Análise em microsséries. Antecipação genética. Prognóstico.
ABSTRACT
The chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent leukemia in Western countries. The low incidence among Chinese and Japanese and a higher prevalence in CLL patient first-degree relatives constitutes strong evidence of the influence of genetic factors on this disease. Population-based studies have shown that approximately 9% of patients report a family history of CLL and now two forms of the disease are recognized: sporadic and "familial CLL". Clinical trials with multigenerational pedigrees of familial CLL have described that younger generations have an earlier age of onset than older generations, and in some cases this is associated with a more aggressive disease, sugesting the presence of genetic anticipation (GA). Chromosomal abnormalities can be detected in most patients with CLL and some of them are associated to the prognosis of the disease, specially (11q23), del(13q14), +(12) and del(17p). These chromosomal abnormalities have been implicated with the CLL pathogenesis and a feedback circuit of interaction "microRNA-TP53" has been described with the involvement of the genes ATM, MDM2, BCL-2, MCL1, TP53 and the microRNAs miR-15a, miR-16-1 and miR-34b/c. The study of chromosomal abnormalities in submicroscopic level (CMA) in familial CLL constitutes an excellent plataform to identify possible factors related to the susceptibility and the pathogenesis of this disease. The present study was conducted to evaluate the CLL affecting three members of the same family. Clinical information and laboratory data are available for eight subjects: three affected and five controls. The diagnosis of CLL was confirmed by immunophenotyping (flow cytometry). CMA was performed with the DNA extracted from mononuclear cells and saliva from all eight subjects. Twenty-three chromosomal abnormalities involving coding regions were detected in the affected members, and at least three (13%) of these abnormalities were directly related to the pathogenesis of CLL: +( 12 ) in one subject and del(13q14) in two others. CMA also revealed that in one of the subjects presenting del(13q14) the deletion occured in homozygosity, resulting in chromosomal loss of heterozygosity. These findings were associated to a disease with more aggressive behavior (earlier onset and shorter lymphocyte-doubling time), confirming the the presence of GA in this family. Further studies are needed before the cytogenetic/molecular staging system can be validated in the context of familial CLL. Accordingly, GA should be integrated to other factors in order be tested in a new model for the assessment of familial CLL prognosis.
Key words: Leukemia, lymphoid. Cytogenetic analysis. Microarray analysis. Anticipation, genetic. Prognosis.
LISTA DE ABREVIATURAS
AG: antecipação genética.
CMA: análise cromossômica por microarranjo CHK2: cinase checkpoint 2.
CNV: variação no número de cópias. CTH: célula tronco hematopoiética. EUA: Estados Unidos da América. FISH: hibridização fluorescente in situ. Hb: hemoglobina.
Ig: imunoglobulina.
LBM: linfocitose B monoclonal. LDH: desidrogenase lática. LLC: leucemia linfóide crônica.
LLPC: linfoma linfocítico de pequena células. MO: medula óssea.
OMS: Organização Mundial de Saúde. pb: pares de base.
PCR: reação em cadeia da polimerase PS: performance status.
REAL: Revised European American Lymphoma Classification. RT-PCR: reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa SG: sobrevida global.
SNP: polimorfismos de nucleotídio único TCI: termo de consentimento informado. TDL: tempo de duplicação linfocitária.
FEPECS: Fundação de Ensino e Pesquisa em Ciências da Saúde. ZAP-70: proteína cinase 70 associada a cadeia Zeta.
Figura 1: Relação entre a linfometria e o risco de evolução para leucemia linfóide crônica em indivíduos com linfocitose B monoclonal. ...18 Figura 2: Incidência de leucemia linfóide crônica e outras neoplasias de células B por faixa etária. ...20 Figura 3: Heredograma demonstrando o agrupamento de casos de leucemia linfóide crônica em uma família...22 Figura 4: Detecção de alterações cromossômicas em 500 pacientes com leucemia linfóide crônica pelas técnicas de citogenética convencional e hibridização fluorescente in situ. ...26 Figura 5: Cariótipo de um caso de leucemia linfóide crônica determinado como 46,XX,del(11)(q21),del(13)(q14). ...27 Figura 6: Cariótipo de um caso de leucemia linfóide crônica determinado como 46,XY,+12. ...28 Figura 7: Citologia em sangue periférico de paciente com leucemia linfóide crônica...30 Figura 8: Citometria de fluxo em um caso de leucemia linfóide crônica. ...31
Figura 9: Sobrevida global na leucemia linfóide crônica de acordo com o status mutacional do gene IGVH. ...35 Figura 10: Curvas de sobrevida global de acordo com os grupos de risco determinados pelas alterações citogenéticas e moleculares na leucemia linfóide crônica. ...37 Figura 11: Representação esquemática do desenvolvimento de células de leucemia linfóide crônica humanas em modelo de transplante xenogênico de células tronco hematopoiéticas provenientes de pacientes portadores de leucemia linfóide crônica. ...38 Figura 12: Circuito de interação "TP53-microRNA" como modelo fisiopatogênico na leucemia linfóide crônica. ...40 Figura 13: Heredograma de leucemia linfóide crônica familiar com três membros afetados. ...43
Figura 15: Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo, contendo amostras de DNA extraído dos diferentes indivíduos...59 Figura 16: Visão geral da análise cromossômica por microarranjo de todos os cromossomos dos sujeitos da pesquisa indicando que nenhuma alteração foi encontrada simultânea e exclusivamente entre os afetados. ...62 Figura 17: Análise cromossômica por microarranjo do DNA de mononucleares do indivíduo B2 demonstrando a presença de +(12). ...64 Figura 18: Análise cromossômica por microarranjo do DNA de mononucleares do indivíduo B6 demonstrando a presença de del(13q14) em heterozigose. ...65 Figura 19: Análise cromossômica por microarranjodo do DNA de mononucleares do indivíduo C8 demonstrando a presença de del(13q14) em homozigose. ...66 Figura 20: Comparação do análise cromossômica por microarranjo obtido à partir de células da saliva e de mononucleares do indivíduo B2 não revela diferenças significativas. ...67 Figura 21: Comparação do análise cromossômica por microarranjo obtido à partir de células da saliva e de mononucleares do indivíduo B6 não revela diferenças significativas. ...68 Figura 22: Comparação do análise cromossômica por microarranjo obtido à partir de células da saliva e de mononucleares do indivíduo C8 não revela diferenças significativas. ...69
Tabela 1: Incidência de leucemia linfóide crônica na população norte-americana, distribuição por etnia e sexo...19 Tabela 2: Sistema de estadiamento de Rai para leucemia linfóide crônica. ...33 Tabela 3: Sistema de estadiamento de Binet para leucemia linfóide crônica. ...34 Tabela 4: Principais fatores prognósticos laboratoriais na leucemia linfóide crônica...35 Tabela 5: Sistema de avaliação prognóstica citogenética e molecular da LLC. ...36 Tabela 6: Confirmação do diagnóstico de leucemia linfóide crônica nos indivíduos afetados...54
Tabela 7: Hemograma completo dos indivíduos não-afetados. ...55
Tabela 8: Características clínicas dos indivíduos afetados por leucemia linfóide crônica familiar ao diagnóstico e durante o período de acompanhamento. ...56 Tabela 9: Exames laboratoriais de interesse prognóstico para leucemia linfóide crônica (indivíduos afetados). ...57 Tabela 10: Estadiamento clínico e citogenético/molecular dos indivíduos afetados. ...57 Tabela 11: Valores hematimétricos ao diagnóstico e após a evolução da LLC. ...58 Tabela 12: Resultado da quantificação do DNA extraído dos diferentes sujeitos da pesquisa. ...59 Tabela 13: Variações no número de cópias (deleções) relacionadas com regiões codificantes detectadas por análise cromossômica por microarranjo nos indivíduos afetados...61 Tabela 14: Variações no número de cópias (ganhos) relacionadas com regiões codificantes detectadas por análise cromossômica por microarranjo nos indivíduos afetados...61
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...17
1.1 LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA (LLC) ...17
1.1.1 Definição...17 1.1.2 Epidemiologia ...18 1.1.3 Quadro clínico...22 1.1.4 Alterações laboratoriais...24 1.1.5 Alterações citogenéticas...25 1.1.6 Diagnóstico ...30
1.1.7 Avaliação clínica do prognóstico (estadiamento) ...32
1.1.8 Avaliação laboratorial do prognóstico...34
1.1.9 Fisiopatologia...36 2 JUSTIFICATIVA ...41 3 OBJETIVOS ...42 3.1 OBJETIVO GERAL ...42 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...42 4 MATERIAL E MÉTODOS...43 4.1 POPULAÇÃO DO ESTUDO...43
4.1.1 Coleta de amostras e obtenção de dados clínicos...44
4.1.2 Imunofenotipagem por citometria de fluxo ...45
4.1.3 Separação das células mononucleares ...46
4.1.4 Extração de DNA de células mononucleares ...47
4.1.5 Extração e purificação de DNA de células da saliva...47
4.1.6 Verificação da qualidade e quantificação das amostras de DNA...48
4.2 AVALIAÇÃO CITOGENÉTICA POR ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO (CMA) ...48
4.2.1 Preparação do DNA genômico...49
4.2.2 Digestão com Nsp I, ligação de adaptadores e amplificação...49
4.2.3 Mistura dos produtos das PCRs, purificação e quantificação...50
4.2.4 Fragmentação dos produtos das PCRs ...51
4.2.5 Marcação do DNA fragmentado com biotina...51
4.2.6 Hibridização ...51
4.2.7 Lavagens dos GeneChip® e marcação com fluoróforos...52
4.2.8 Escaneamento dos GeneChip®, captação de imagens e análise no software Chromosome Analysis Suite 1.2.2 (Affymetrix®) ...52
5 RESULTADOS ...54
5.1 CONFIRMAÇÃO DO DIAGNÓSTICO DE LLC...54
5.2 PESQUISA DA PRESENÇA DE LBM NOS INDIVÍDUOS NÃO-AFETADOS ...54
5.3 DESCRIÇÃO DOS ACHADOS CLÍNICOS ...56
5.5 AVALIAÇÃO DO PROGNÓSTICO DOS INDIVÍDUOS PORTADORES
DE LLC ...57
5.6 AVALIAÇÃO DE QUALIDADE E QUANTIFICAÇÃO DO DNA EXTRAÍDO ...58
5.7 DESCRIÇÃO DAS ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS SUBMICROSCÓPICAS IDENTIFICADAS POR MEIO DE CMA ...60
6 DISCUSSÃO...70
7 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ...80
REFERÊNCIAS ...82
APÊNDICE ...91
1 INTRODUÇÃO
1.1 LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA (LLC) 1.1.1 Definição
A LLC é uma doença linfoproliferativa de linfócitos B monoclonais funcionalmente incompetentes, caracterizada pelo acúmulo progressivo de células morfologicamente semelhantes ao linfócito maduro no sangue, na medula óssea (MO) e nos tecidos linfáticos (GOLDIN; SLAGER, 2007). De acordo com a última versão da Classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS), a LLC é uma das onco-hematopatias que compõe o grupo das neoplasias de células B maduras e pode ser considerada como “idêntica” ao linfoma linfocítico de pequenas células (LLPC), a primeira representando a forma predominantemente “leucêmica” e o segundo a forma predominantemente “tumoral” da mesma doença (SWERDLOW, 2008).
Como veremos à seguir, o diagnóstico preciso de LLC requer a presença de linfócitos B em sangue periférico, predominantemente com morfologia de células maduras, em contagem superior a 5.000/mm3 e monoclonalidade demonstrada por imunofenotipagem (HALLEK et al., 2008). O termo “linfocitose B monoclonal” (LBM) é empregado para caracterizar indivíduos saudáveis (sem evidências clínicas ou laboratoriais de doenças linfoproliferativas) que apresentem células B maduras monoclonais em sangue periférico com contagem inferior a 5.000/mm3, na maioria da vezes com expressão fenotípica semelhante a da LLC (HALLEK et al., 2008; MOWERY; LANASA, 2012; RAWSTRON et al., 2008).
Utilizando citometria de fluxo de alta sensibilidade (com capacidade de detecção de micropartículas de tamanho até 20 vezes menor do que pela metodologia convencional), LBM pode ser detectada em até 5% dos indivíduos normais com idade superior a 60 anos, e em até 14% daqueles que apresentam linfocitose na avaliação de sangue periférico com a mesma faixa etária (NIETO et al., 2009; RAWSTRON et al., 2008; ROSSI et al., 2009). Empregando a mesma técnica em amostras de sangue estocado, acrescida de informações obtidas por meio de análise molecular com a pesquisa de rearranjo do gene IGHV por meio da reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-PCR), os pesquisadores foram capazes de demonstrar
que a condição de LBM antecedeu em anos o diagnóstico de LLC em virtualmente todos os pacientes daquela série (LANDGREN et al., 2009).
Em indivíduos com LBM, a taxa média de progressão para LLC com necessidade de tratamento é da ordem de 1 a 2% ao ano e o risco está relacionado com a contagem de linfócitos no sangue periférico (RAWSTRON et al., 2008; ROSSI et al., 2009) (Figura 1).
Figura 1: Relação entre a linfometria e o risco de evolução para leucemia linfóide crônica em indivíduos com linfocitose B monoclonal.
O gráfico demonstra que em indivíduos portadores de linfocitose B monoclonal o risco de evolução para leucemia linfóide crônica ao longo do tempo está relacionado com a linfometria aferida ao diagnóstico.
Fonte: adaptado de (RAWSTRON et al., 2008).
1.1.2 Epidemiologia
A LLC é a leucemia mais comum nos países ocidentais, representando cerca de 30% de todas as leucemias nos Estados Unidos da América (EUA), com taxas de incidência anual entre homens e mulheres de aproximadamente 5,9 e 3,1 casos para cada 100.000 habitantes, respectivamente (HOWLADER
N, 2013) (Tabela 1). Na Europa, enquanto a taxa de incidência de LLC entre homens é bastante semelhante à observada nos EUA (5,87 para 100.000 habitantes por ano), a incidência anual da doença entre as mulheres é ligeiramente superior (4,01 para 100.000 habitantes) (SANT et al., 2010). A Inglaterra destaca-se como um dos países que apresenta uma das maiores taxas de incidência anual, com média de 6,4 casos para cada 100.000 habitantes (8,1 para homens e de 4,8 para mulheres) (SMITH et al., 2011).
Tabela 1: Incidência de leucemia linfóide crônica na população norte-americana, distribuição por etnia e sexo
Etnia Masculino Feminino
Todas as etnias 5,9 por 100.000 3,1 por 100.000
Brancos americanos 6,3 por 100.000 3,3 por 100.000
Negros americanos 4,2 por 100.000 2,0 por 100.000
Asiáticos e ilhas do Pacífico 1,4 por 100.000 0,7 por 100.000 Índios americanos e nativos do
Alasca 2,2 por 100.000
Dado não apresentado (menos que 16 casos no
intervalo de tempo)
Hispânicos 2,6 por 100.000 1,6 por 100,000
Dados apresentados com base nos casos diagnosticados no território norte-americano durante o período de 2006 à 2010.
Fonte: Adaptado de (HOWLADER N, 2013).
A LLC é considerada essencialmente uma doença de idosos. A incidência aumenta progressivamente com a idade (Figura 2), com mediana de 71 anos ao diagnóstico, raramente afetando indivíduos com idade inferior a 40 anos. Como a taxa de incidência aumenta com a idade, a prevalência e a mortalidade da LLC tendem a aumentar ainda mais devido às mudanças demográficas na sociedade previstas paras próximas décadas (envelhecimento populacional). Além disso, provavelmente devido ao maior acesso a realização de exames laboratoriais rotineiros, a proporção de pacientes mais jovens com LBM ou LLC em fase precoce também deve aumentar (MAURO et al., 1999). O número de casos novos diagnosticados por ano chega as impressionantes marcas de 15.680 nos EUA e 11.019 na Europa (SANT et al., 2010; SIEGEL; NAISHADHAM; JEMAL, 2013; SMITH et al., 2011).
Figura 2: Incidência de leucemia linfóide crônica e outras neoplasias de células B por faixa etária.
A incidência das neoplasias de células B maduras na população aumenta progressivamente com a idade, especialmente à partir da sexta década de vida.
Fonte: modificado à partir de (SANT et al., 2010).
Ainda que alguns estudos preliminares tenham indicado uma maior prevalência de LLC entre agricultores, manofaturistas da borracha, pessoas com exposição a benzeno ou com episódios múltiplos de infecção pulmonar, até o presente momento nenhum fator de risco ambiental ou ocupacional pode ser claramente associado com maior predisposição para o desenvolvimento de LLC (BRANDT, 1985; GOLDIN; SLAGER, 2007).
Existem fortes evidências epidemiológicas de que, pelo menos em parte, a ocorrência de LLC deva-se a fatores ligados às características genéticas da população ou do indivíduo. Em termos populacionais, a influência da constituição étnica pode ser apreciada em países asiáticos, como a China e o Japão, onde a incidência de LLC é extremamente baixa, com uma freqüência estimada de aproximadamente 10% daquela observada em países do ocidente (KOBAYASHI et al., 1990; YANG; ZHANG, 1991). Como pode ser visto na Tabela 2, na população norte-americana, a taxa de incidência para cada
100.000 habitantes por ano entre brancos americanos (6,3 para homes e 3,3 para mulheres) é significativamente maior do que a observada entre os negros americanos (4,2 para homens e 2,0 para mulheres) e os asiáticos (1,4 para homens e 0,7 para mulheres) (HOWLADER N, 2013).
Em relação a constituição genética do indivíduo, vários estudos indicam que em familiares de primeiro grau de pacientes com diagnóstico de LLC a ocorrência de LBM e LLC é maior do que a esperada, quando comparada com a população geral (GOLDIN et al., 2010; MOWERY; LANASA, 2012; RAWSTRON et al., 2008; ROSSI et al., 2009). Em um estudo empregando a técnica de citometria de fluxo, os autores demonstraram a presença de LBM em até 17% dos familiares de primeiro grau de pacientes portadores de LLC (GOLDIN et al., 2010). A existência de genes de susceptibilidade para LLC familiar nas chamadas “regiões cromossômicas candidatas” está atualmente sob investigação (BERNDT et al., 2013; FULLER et al., 2008; NG et al., 2006; NG et al., 2007).
Na maioria das vezes a LLC se manifesta como uma doença de aparecimento esporádico. Todavia, estudos epidemiológicos de base populacional indicam que em até 9% dos casos são encontradas evidências de acúmulo de casos de LLC entre os membros de uma mesma família (GOLDIN et al., 2010). Os mesmos estudos demonstraram que parentes de primeiro grau de pacientes com diagnóstico de LLC estão expostos a um risco de desenvolver a mesma doença até 5,7 vezes maior do que a população geral (HOULSTON et al., 2003). Em outro estudo que empregou a mesma metodologia em uma base de dados da população sueca, os pesquisadores encontraram que, quando comparado com os parentes do grupo controle, parentes de primeiro grau de pacientes com LLC têm um risco relativo 8,5 vezes maior de desenvolver a doença (GOLDIN et al., 2009).
A LLC familiar pode ser arbitrariamente definida como o encontro de um paciente com diagnóstico de LLC com pelo menos um parente consangüíneo com a mesma doença, sem limitação pelo grau de parentesco (Figura 3). Embora as características gerais (estadiamento clínico, achados laboratoriais, fatores prognósticos) sejam semelhantes, a mediana de idade ao diagnóstico na LLC familiar é pelo menos dez anos menor do que a observada na forma esporádica da doença (57 versus 71 anos, respectivamente) (SLAGER; KAY,
2009). Em estudos com múltiplas gerações de casos de LLC familiar observou-se que a idade média para o início da doença nos filhos (51 anos) era significativamente mais precoce quando comparada aos pais (72 anos), sugerindo um fenômeno que os autores denominaram de “antecipação genética” (AG) (GOLDIN; CAPORASO, 2007; GOLDIN et al., 2010).
Figura 3: Heredograma demonstrando o agrupamento de casos de leucemia linfóide crônica em uma família.
ou indicam indivíduo afetado (masculino e feminino, respectivamente) por leucemia linfóide crônica (LCC).
Fonte: adaptado à partir de (SLAGER; KAY, 2009).
1.1.3 Quadro clínico
Conquanto os portadores de LLC possam apresentar uma ampla gama de sintomas físicos e alterações laboratoriais no momento do diagnóstico, em cerca de 25% dos casos os pacientes são completamente assintomáticos e a suspeição da doença é feita tão somente pela achado de linfocitose em um hemograma realizado como exame rotina.
A principal razão que motiva o paciente a buscar assistência médica é a presença de adenomegalias, geralmente indolores, que predominam nas cadeias cervicais, mas que podem surgir em diversas regiões linfonodais. Em até 10% dos casos podemos identificar os chamados “sintomas B”, que se
caracterizam pela presença de pelo menos um dos seguintes: episódios de febre sem evidências de infecção, sudorese noturna e perda de peso maior ou igual a 10% do peso corporal nos últimos seis meses (obrigatoriamente não relacionada a adoção de dieta hipocalórica).
Ocasionalmente os indivíduos sintomáticos podem também apresentar características de fenômenos auto-imunes, tais quais anemia hemolítica (palidez cutâneo-mucosa, astenia, icterícia, colúria) ou ainda púrpura trombocitopênica (sangramentos cutâneo-mucosos, tais como petéquias, equimoses ou hematomas) (HALLEK et al., 2008).
Para o conjunto de pacientes com doença sintomática (cerca de 75% do total), as principais alterações identificadas ao exame físico são aquelas relacionadas à infiltração dos órgãos pelas células B clonais - especialmente aqueles relacionados de maneira direta ou indireta com o sistema linfohematopoético - e podem ser descritas como se segue (BINET et al., 1981; RAI et al., 1975):
• Linfoadenomegalias: o aumento de volume dos linfonodos representa a alteração mais comum, presente em até 90% dos casos. As regiões mais freqüentemente afetadas são a cervical, supra-clavicular e axilar, onde as adenomegalias podem surgir de maneira isolada ou agrupada. Em geral a linfonodomegalia é indolor, isolada, móvel e de consistência elástica, mas também pode aparecer na forma de massas tumorais confluentes.
• Esplenomegalia: o baço é o segundo órgão linfóide mais comumente atingido, sendo identificado por meio de palpação do abdome (região do hipocôndrio esquerdo) em 25 a 55% dos pacientes. Caracteristicamente o aumento de volume do baço apresenta-se de maneira indolor, com superfície lisa e consistência elástica.
• Hepatomegalia: na LLC o aumento de volume do fígado é uma ocorrência muito menos freqüente do que a linfonodomegalia e a esplenomegalia, sendo descrito em não mais que 25% dos casos ao diagnóstico. Identificada quando da palpação abdominal na região do hipocôndrio direito, a hepatomegalia costuma ser também indolor, com superfície lisa e de consistência elástica.
• Outros órgãos: embora as células tumorais da LLC possam invadir qualquer órgão ou tecido linfóide, a exemplo das tonsilas que compõe o Anel de Waldeyer, o acometimento do “tecido linfóide relacionado a mucosa gastro-intestinal” é raramente descrito. Quanto ao envolvimento de órgãos não-linfáticos, a pele merece o maior destaque. A infiltração cutânea, descrita como “leucemia cutis”, pode manifestar-se sob a forma de máculas, pápulas, placas, nódulos, úlceras ou bolhas envolvendo mais freqüentemente a face, e constitui uma manifestação ocasional da doença (menos que 5% dos pacientes) (AGNEW et al., 2004).
1.1.4 Alterações laboratoriais
Como mencionado anteriormente, a alteração laboratorial mais importante da LLC é a linfocitose. Embora o limiar absoluto de linfócitos de sangue periférico para o diagnóstico de LLC seja obrigatoriamente maior que 5.000/mm3, uma proporção significativa dos pacientes (aproximadamente 30%) podem apresentar contagem de linfócitos tão elevada quanto 100.000/mm3 (KEATING et al., 1998).
Anemia, neutropenia e plaquetopenia (redução da concentração de hemoglobina (Hb), da contagem de neutrófilos e plaquetas, respectivamente) também podem ser observados no momento do diagnóstico inicial. Estes achados laboratoriais podem resultar do comprometimento da hematopoese (insuficiência medular), secundária à maciça infiltração da MO pelas células B monoclonais, ou podem estar relacionados com fenômenos auto-imunes (anemia hemolítica auto-imune, trombocitopenia auto-imune, aplasia pura de série vermelha e agranulocitose), secundários a desregulação do sistema imune e a produção de anticorpos auto-reativos que acomete uma parte considerável dos pacientes com LLC (DIEHL; KETCHUM, 1998):
• Anemia hemolítica auto-imune: caracterizada laboratorialmente por positividade no teste de “Coombs direto” (anti-globulina direta) e por elevação na contagem de reticulócitos, acompanha o diagnóstico de LLC em cerca de 11% dos pacientes;
trombocitopênica imune”, suspeitada quando a redução da plaquetometria está associada a uma contagem normal de megacariócitos na avaliação da MO, acomete de 2 a 3% dos pacientes com LLC e sua manifestação clínica (sangramentos cutâneo-mucosos) pode ser a razão primária pela qual o paciente busca assistência médica;
• Aplasia pura de série vermelha: evento raro (0,5% dos casos), suspeitado quando a anemia está associada a uma baixa contagem de reticulócitos no sangue periférico e a uma redução da quantidade de precursores eritróides no aspirado medular;
• Agranulocitose: evento raro (0,5% dos casos), caracterizado por intensa redução da contagem de neutrófilos em sangue periférico, associada a parada de maturação e redução da contagem de precursores da série granulocítica no aspirado medular.
Na avaliação bioquímica do sangue não há marcadores específicos que se correlacionem com a LLC, embora níveis séricos elevados de desidrogenase lática (DHL) e beta2microglobulina possam ser detectados em uma significativa proporção dos pacientes (KEATING et al., 1998). Hipogamaglobulinemia (com redução das concentrações de IgA, IgG e IgM) está presente em 10% dos casos ao diagnóstico e em 30% daqueles com doença em fase avançada. Por outro lado, hipergamaglobulinemia policlonal pode ser encontrada em 15% dos pacientes, enquanto a detecção de uma gamaglobulina monoclonal (usualmente da mesma classe de imunoglobulinas expressa na superfície de membrana da célula B clonal) é observada em até 5% dos casos. Hipogamaglobulinemia e neutropenia são fatores que contribuem de maneira significativa para a maior susceptibilidade dos pacientes portadores de LLC para infecções bacterianas graves, especialmente por germes encapsulados (MAURER et al., 2011; TSAI et al., 2009).
1.1.5 Alterações citogenéticas
A utilização de técnicas de alta sensibilidade permite a identificação de anormalidades cromossômicas nas células clonais da LLC na maioria dos casos. Em dois estudos que empregaram a hibridização fluorescente in situ
(FISH), os autores foram capazes de detectar alterações citogenéticas em 69 a 82% dos pacientes (DOHNER et al., 2000; REDDY, 2006). Por outro lado, utilizando uma técnica aprimorada de cultivo celular baseada na imunoestimulação com oligonucleotídeos e Interleucina-2, em 2007 Haferlach e colaboradores estudaram um conjunto de 506 pacientes com LLC e conseguiram demonstrar a presença de aberrações cromossômicas em 83% das amostras avaliadas por citogenética clássica (análise por bandeamento dos cromossomos), e em 78,4% das amostras analisadas por FISH (HAFERLACH et al., 2007). Neste estudo, a técnica de FISH mostrou-se mais eficaz quando o número de anormalidades cromossômicas presentes era restrito a 1, enquanto a citogenética clássica foi o melhor método para detectar alterações presentes em maior número (Figura 4).
Figura 4: Detecção de alterações cromossômicas em 500 pacientes com leucemia linfóide crônica pelas técnicas de citogenética convencional e hibridização fluorescente in situ.
Demonstração gráfica do percentual de casos com 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais alterações cromossômicas detectadas por citogenética convencional (CC, em vermelho) ou hibridização fluorescente in situ (FISH, em azul).
Como veremos mais adiante, diversas alterações citogenéticas correlacionam-se com o prognóstico, enquanto outras nos permitem compreender, mesmo que de modo parcial ou incompleto, a fisiopatogênese da LLC. Também não há dúvidas de que a progressão da doença (evolução clonal) está diretamente relacionada às alterações citogenéticas e de que os cromossomos 11, 12 e 13 são os mais comumente envolvidos (KIEFER et al., 2012; WANG, S. S. et al., 2007) (Figuras 5 e 6). Diferente de outras neoplasias oncohematológicas, a descrição de translocações cromossômicas é extremamente rara na LLC.
Figura 5: Cariótipo de um caso de leucemia linfóide crônica determinado como 46,XX,del(11)(q21),del(13)(q14).
Citogenética convencional demonstrando a presença de deleção do braço longo dos cromossomos 11 (seta azul) e 13 (seta vermelha).
Figura 6: Cariótipo de um caso de leucemia linfóide crônica determinado como 46,XY,+12.
Citogenética convencional demonstrando a presença de trissomia do cromossomo 12 (seta vermelha).
Fonte: modificado de (KIEFER et al., 2012).
As principais alterações citogenéticas relacionadas a LLC são:
• del(13q14): a deleção do braço longo do cromossomo 13, envolvendo especificamente a região 13q14, representa a alteração citogenética mais freqüente na LLC, ocorrendo em aproximadamente 55% de todos os casos e está associada a uma doença de curso benigno e prognóstico favorável. Esta alteração não é uma exclusividade da LLC: é detectada com a mesma freqüência em LBM e está também descrita em mieloma múltiplo e linfomas de células T maduras. Esta região contém as seqüências codificantes dos transcritos DLEU1 e DLEU2. Os microRNAs miR-15a e miR-16-1 são processados à partir dos transcritos primários do intron 4 de DLEU2 e parecem interagir com vias de regulação da apoptose da célula B (KIEFER et al., 2012). Estes microRNAs exercem sua função através da inibição dos genes com função antiapoptótica BCL2 e MCL1, além de regular a atividade do gene TP53 que está envolvido com os mecanismos de controle do ciclo celular, reparo do DNA e da apoptose (CALIN; PEKARSKY; CROCE, 2007; FABBRI et al.,
2011). Por estarem envolvidos na manutenção do equilíbrio entre proliferação e morte celular, há fortes indícios de que os microRNAs miR-15a/16-1 exerçam uma função patogênica na LLC.
• del(11q): a deleção do braço longo do cromossomo 11 pode ser observada em até 25% dos casos, sendo a segunda alteração citogenética mais frequentemente descrita na LLC. Clinicamente a del(11q) está associada com uma doença com manifestação tumoral (linfoadenomegalias volumosas), de comportamento mais agressivo e sobrevida mais curta. Na maioria das vezes a deleção inclui a região 11q23 e resulta na perda do gene ATM, que exerce importante papel na sinalização de dano ao DNA com conseqüente ativação da p53, a qual por sua vez é capaz de iniciar o processo de apoptose celular. A região 11q23 também contém os segmentos codificantes dos microRNAs miR-34b/c, que atuam como potentes mediadores da atividade anti-tumoral da p53 (bloqueio do ciclo celular e indução da apoptose). Assim sendo, a del(11q) pode resultar em instabilidade genômica e contribuir com o mecanismo de doença na LLC (HALLEK, 2013; HERMEKING, 2010).
• +(12): apesar de ser encontrada em 10 a 20% dos casos, a contribuição da trissomia do cromossomo 12 para o prognóstico adverso na LLC é modesta e seu papel o desenvolvimento da doença permanece mal compreendido (KIEFER et al., 2012). Embora algumas vias oncogenéticas tenham sido apontadas,uma das hipóteses fisiopatogênicas mais aceitas envolve o MDM2. Este gene está localizado na região 12q15 e codifica uma ubiquitina-ligase nuclear (Mdm2) responsável pela degradação proteossômica de várias proteínas, entre elas a p53. O número de cópias aumentado deste gene na +(12) pode resultar em maior degradação da p53 e por conseguinte comprometer a regulação da apoptose celular das células B clonais na LLC (WANG, C.; WANG, 2013).
• del(17p): presente em 5 a 8% dos pacientes ao diagnóstico, a deleção do braço curto do cromossomo 17, mais particularmente da região 17p13, representa um dos piores fatores prognósticos na LLC. Nesta região cromossômica está localizado o TP53, um dos mais importantes genes supressores tumorais. Mutações no
TP53 resultam em uma patologia agressiva e extremamente
resistente às modalidades terapêuticas convencionas (imuno-quimioterapia) (HALLEK, 2013).
1.1.6 Diagnóstico
A avaliação diagnóstica de um paciente com suspeita de LLC deve incluir obrigatoriamente hemograma completo com diferencial, o exame citológico do esfregaço de sangue periférico e uma análise imunofenotípica dos linfócitos circulantes. Aspirado (mielograma) e biópsia de MO não são necessários para o diagnóstico.
Na LLC, as células leucêmicas são tipicamente constituídas por linfócitos pequenos e maduros, com citoplasma escasso, exibindo núcleo com cromatina condensada e sem nucléolo visível. Manchas de Gumprecht, que representam os restos nucleares de linfócitos lisados durante a realização do esfregaço de sangue periférico, são encontradas com freqüência na LLC (Figura 7).
Figura 7: Citologia em sangue periférico de paciente com leucemia linfóide crônica.
Microscopia óptica, aumento de 1000x, coloração Giemsa. Linfócitos clonais com morfologia semelhante a célula B madura (setas vermelhas), mancha de Gumprecht (seta verde), hemácias (setas azuis).
Fonte: modificado à partir da imagem cedida por Daniel, M T - Laboratório de Hematologia do Hospital Saint-Louis, Paris, França.
De acordo com as recomendações da Classificação da OMS e dos principais guias de conduta reconhecidos pela comunidade médica e científica (HALLEK et al., 2008; JAFFE, 2009; VARDIMAN et al., 2009), para o diagnóstico preciso de LLC é necessário atender os dois critérios seguintes:
1) Contagem absoluta de linfócitos no sangue periférico maior que 5.000/mm3, com uma população predominante de pequenos linfócitos morfologicamente maduros.
2) Demonstração de clonalidade dos linfócitos B circulantes por meio de citometria de fluxo (Figura 8), com expressão dos marcadores imunofenotípicos seguintes:
• Antígenos associados a célula B (CD19, CD20, CD23);
• Co-expressão de antígeno de células T (CD5);
• Imunoglobulina de membrana de superfície (SmIg);
• Apenas uma única cadeia leve de imunoglobulina (kappa ou
lambda).
Figura 8: Citometria de fluxo em um caso de leucemia linfóide crônica.
Imunofenotipagem por citometria de fluxo evidenciando a presença de linfócitos B com co-expressão de CD5 e CD20 (marcação em vermelho) em um caso de leucemia linfóide crônica, correspondente a 42% das células analisadas. As células B normais, com expressão apenas de CD20, representam 6% do total (marcação em verde).
Os níveis de expressão de CD20 e de SmIg na célula clonal da LLC são caracteristicamente baixos, quando comparados com o linfócito B normal . Adicionalmente, as células clonais da LLC geralmente não expressam (reação negativa) ciclina D1, CD10, FMC7, CD22, CD79b.
Como mencionado anteriormente, a classificação da OMS considera que a LLC e o LLPC correspondam a manifestações diferentes (leucêmica e tumoral, respectivamente) da mesma doença (mesma célula de origem). Para efeito de estudos clínicos, o diagnóstico de LLPC requer a presença de linfoadenopatia e a ausência de citopenias secundárias a infiltração da medula óssea por células clonais. Além disso, o número de linfócitos B no sangue periférico não pode exceder 5000/mm3. O diagnóstico de LLPC deve ser confirmado por exame histopatológico e imunofenotípico de uma biópsia do linfonodo (HALLEK, 2013).
1.1.7 Avaliação clínica do prognóstico (estadiamento)
A história natural da LLC é extremamente variável, com extremos de manifestação que vão desde pacientes com vida próxima do normal e que apresentam uma enfermidade extremamente indolente, até aqueles que sofrem morte precoce devido a uma doença rapidamente progressiva. A expectativa de sobrevida média pode ser estimada entre dois e 20 anos. Considerando os achados clínicos e laboratoriais ao diagnóstico, em aproximadamente 30% dos casos a qualidade e a expectativa de vida não serão afetadas, enquanto os demais morrerão em conseqüência da evolução da doença, especialmente devido a falência medular. Na maior parte das vezes a LLC tem um curso inicial benigno, com duração de cinco a dez anos, onde os indivíduos são capazes de manter suas atividades habituais, seguido de uma fase tardia, com duração de um a dois anos, na qual o performance status (PS) dos pacientes é extremamente comprometido pelas manifestações da doença ou por complicações relacionadas ao tratamento. As causas mais freqüentes de morte são infecções sistêmicas graves (sepse), hemorragias e caquexia.
A capacidade de distinguir os pacientes com uma patologia de comportamento benigno daqueles com uma doença rapidamente progressiva
permaneceu obscura durante muitos anos, forçando os médicos a tomar decisões quanto ao benefício e a necessidade de intervenção terapêutica de maneira praticamente empírica ou sem grandes evidências científicas. O desenvolvimento de sistemas de avaliação prognóstica fundamentados em critérios confiáveis de estratificação, baseados na perspectiva de sobrevida dos pacientes, permitiu o planejamento de estudos clínicos desenhados para testar diferentes estratégias de tratamento em diferentes fases da doença.
Os sistemas de estadiamento mais amplamente aceitos e recomendados pelos principais guias de conduta são o sistema Rai e o sistema de Binet (Tabelas 2 e 3) (BINET et al., 1981; HALLEK et al., 2008; RAI et al., 1975). Estes sistemas de estadiamento da LLC não são mutuamente exclusivos e se destacam pela praticidade e pelo baixo custo, uma vez que utilizam apenas informações do exame físico e de exames laboratoriais simples, dispensando a realização de estudos de imagem mais elaborados, tais como tomografia computadorizada, ressonância nuclear magnética ou tomografia de emissão de pósitrons (CHEN et al.), comumente empregados em outras doenças linfoproliferativas (linfomas) (HALLEK, 2013). Em ambos os sistemas a descrição de “anemia” e de “plaquetopenia” referem-se aos sinais de insuficiência medular por infiltração da MO, devendo-se sempre excluir a possibilidade de fenômenos auto-imunes.
Tabela 2: Sistema de estadiamento de Rai para leucemia linfóide crônica. Classificação
de Risco Estadiamento Descrição
Sobrevida (meses)
Baixo 0 Linfocitose no sangue periférico ou MO 150
I Linfocitose + adenomegalias 101
Intermediário
II
Linfocitose + esplenomegalia e/ou hepatomegalia (com ou sem
adenomegalia)
71
III
Linfocitose + anemia com ou sem adenomegalia, esplenomegalia ou
hepatomegalia
19 Alto
VI
Linfocitose + plaquetopenia com ou sem adenomegalia, esplenomegalia ou
hepatomegalia
19
Anemia definida como concentração de hemoglobina < 11 g/dL, plaquetopenia definida como contagem <100.000/mm3.
Tabela 3: Sistema de estadiamento de Binet para leucemia linfóide crônica. Classificação
de Risco Estadiamento Descrição
Sobrevida (meses)
Baixo A Regiões linfonodais acometidas
(adenomegalia) ≤ 2
Igual ao controle
Intermediário B Regiões linfonodais acometidas
(adenomegalia) ≥ 3 84
Alto C Presença de anemiae/ou
plaquetopenia 24
Anemia definida como concentração de hemoglobina < 10 g/dL, plaquetopenia definida como contagem <100.00/mm3. Regiões linfonodais consideradas: cervical, axilar, inguinal, baço e fígado.
Fonte: adaptado de (BINET et al., 1981).
1.1.8 Avaliação laboratorial do prognóstico
Muito embora os sistemas de estadiamento clínico para LLC sejam capazes de estratificar os pacientes em diferentes grupos de risco que guardam boa correlação com as curvas de sobrevida, algumas vezes nos deparamos com a situação de um determinado caso apresentar uma doença rapidamente progressiva mesmo tendo sido inicialmente classificado como “baixo risco”. Este fato motivou a investigação de outros fatores com influência no prognóstico, alguns dos quais já tiveram seu valor confirmado em ensaios clínicos bem elaborados e de grande impacto científico. Dentre eles destacam-se o “tempo de duplicação linfocitária” (TDL) e as “alterações citogenéticas e moleculares” da célula clonal, que já são utilizados na prática clínica diária como marcadores capazes de orientar decisões terapêuticas, enquanto a real importância dos demais ainda é matéria de discussão (FOA et al., 2013; HALLEK et al., 2008; ROSSI; FANGAZIO; GAIDANO, 2012). Os principais fatores prognósticos laboratoriais são apresentados na Tabela 4.
Níveis elevados de expressão de CD38 e ZAP-70 (proteína cinase 70 associada a cadeia Zeta) pelas células tumorais da LLC, determinados por imunofenotipagem, guardam correlação com o estado não-mutado do gene
IGVH, o qual está associado a uma patologia com expectativa de sobrevida
mais curta e recidiva precoce após o tratamento (CHEN et al., 2007; ZENZ et al., 2010) (Figura 9). Nestes casos as células clonais provavelmente se
originam das células B “inocentes” que não foram expostas aos processos de transformação que ocorrem no centro germinativo (CHIORAZZI; RAI; FERRARINI, 2005).
Tabela 4: Principais fatores prognósticos laboratoriais na leucemia linfóide crônica. Prognóstico favorável Prognóstico desfavorável Padrão de infiltração da MO intersticial ou
nodular Padrão de infiltração da MO difuso
TDL > 12 meses TDL < 12 meses
CD38 negativo CD38 positivo
IGVH mutado IGVH não-mutado
ZAP-70 negativo
(baixo nível de expressão)
ZAP-70 positivo
(alto nível de expressão)
del 13q14 del 11q23
del 17p
p53 com expressão reduzida ou disfuncional Níveis elevados de DHL e
Beta2microglobulina
Padrão de infiltração da medula óssea (MO) avaliado pela histologia, expressão de CD38 e ZAP-70 avaliados por imunofenotipagem, estado mutacional do IGVH e expressão de p53 avaliados por PCR, del 13q14, del 11q23 e del 17p detectados por FISH, níveis de DHL e Beta2microglobulina medidos por bioquímica convencional.
Fonte: adaptado de (HALLEK, 2013; HALLEK et al., 2008; SHANAFELT et al., 2006).
Figura 9: Sobrevida global na leucemia linfóide crônica de acordo com o status mutacional do gene IGVH.
Representação gráfica demonstrando que a leucemia linfóide crônica com IGVH não-mutado (que expressa altos níveis de CD38 e ZAP-70) apresenta SG significativamente menor (p<0,001), quando comparada a doença com IGVH mutado em um estudo envolvendo 365 pacientes (n).
Recentemente foi publicado um novo sistema de avaliação do prognóstico que integra as informações de alterações citogenéticas e moleculares, obtidas a partir de um banco de amostras de pacientes com diagnóstico de LLC em fase precoce da doença (ainda não expostos a tratamento) (ROSSI et al., 2013). Neste sistema os pacientes foram agrupados em quatro categorias de risco distintas (Tabela 5), com taxas de sobrevida global (SG) avaliadas em cinco e dez anos significativamente diferentes (p<0,0001). As curvas de SG podem ser apreciadas na Figura 10.
Tabela 5: Sistema de avaliação prognóstica citogenética e molecular da LLC.
Sobrevida Global (%) Risco Pacientes (%) Fatores relacionados
5 anos 10 anos
Alto 27 Mutações de TP53 e/ou BIRC3 51 29
Intermediário 39 Mutações de NOTCH1 e/ou
SF3B1 e/ou del 11q22-q23 66 37
Baixo 17 Citogenética normal ou +12 78 57
Muito baixo 17 del 13q14 87 69
A sobrevida global relatada para os pacientes do grupo de risco "muito baixo" não difere significativamente do grupo controle normal (p=0,1455).
Fonte: adaptado de (ROSSI et al., 2013).
1.1.9 Fisiopatologia
Os mecanismos geradores de doença na LLC resultam de um complexo processo constituído de etapas múltiplas, tendo como resultado a proliferação de um clone maligno de linfócitos B com capacidade de replicação. Não obstante algumas vias fisiopatogênicas estejam praticamente elucidadas, muitas etapas deste processo ainda permanecem desconhecidas.
Tendo em conta o conhecimento atual, acredita-se que todos os casos de LLC sejam antecedidos por uma fase de LBM inicial; muito embora saibamos que apenas uma minoria daqueles com LBM efetivamente evoluirão para LLC (Figura 1). Deste modo, a patogênese da LLC pode ser compreendida como um incidente constituído por dois passos seqüenciais (GHIA; CALIGARIS-CAPPIO, 2012):
• Estabelecimento da LBM: apesar do evento inicial permanecer incógnito, as células B memória clonais com fenótipo de LLC parecem resultar de alterações citogenéticas que surgem como conseqüência de uma resposta anormal ao fenômeno de estimulação antigênica.
Figura 10: Curvas de sobrevida global de acordo com os grupos de risco determinados pelas alterações citogenéticas e moleculares na leucemia linfóide crônica.
Curvas de Kaplan-Meier demonstrando a significativa diferença de probabilidade cumulativa percentual de sobrevida global ao longo do tempo para pacientes com leucemia linfóide crônica, de acordo com o grupo de risco avaliado pelas alterações citogenéticas e moleculares (p<0,0001): alto (vermelho), intermediário (amarelo), baixo (verde) e muito baixo (azul). A sobrevida global do grupo de risco “muito baixo” não é estatisticamente diferente da população geral pareada, representada em preto (p=0,1455).
Fonte: modificado à partir de (ROSSI et al., 2013).
• Progressão de LBM para LLC: provavelmente induzida por novas injúrias ao clone de células B na forma de anormalidades citogenéticas adicionais ou alterações no microambiente do tecido linfohematopoiético em questão.
Há evidências de que a propensão para gerar células B clonais é adquirida pelos precursores ainda no estágio de células tronco hematopoiéticas (CTH). Kikushige e colaboradores em 2011 constataram que, quando
comparadas com CTH de controles normais, as CTH coletadas de pacientes com LLC são capazes de gerar um número de células B policlonais proporcionalmente muito maior, provavelmente refletindo uma anormalidade intrínseca de comprometimento com a linhagem linfóide B. Os mesmos autores utilizaram um modelo de transplante xenogênico para demonstrar que CTH purificadas de pacientes com LLC eram capazes de gerar células B clonais em camundongos imunossuprimidos, simulando um quadro de LBM (KIKUSHIGE et al., 2011) (Figura 11). As células B clonais produzidas pelo receptor xenogênico apresentavam rearranjos no gene IGVH diferentes daqueles presentes no clone original do paciente, sugerindo que os processos de desenvolvimento ocorreram de maneira independente.
Figura 11: Representação esquemática do desenvolvimento de células de leucemia linfóide crônica humanas em modelo de transplante xenogênico de células tronco hematopoiéticas provenientes de pacientes portadores de leucemia linfóide crônica.
Quando aplicadas em transplantes xenogênicos, células tronco hematopoiéticas provenientes de pacientes com leucemia linfóide crônica sofrem determinadas alterações citogenéticas (evento primário) que induzem o comprometimento com a linhagem linfóide e produção aumentada de células B policlonais (expansão). Alguns clones de células B são selecionados e expandem-se em resposta a exposição a auto ou xenoantígenos, resultando no desenvolvimento de linfocitose B monoclonal. Anormalidades cromossômicas adicionais podem desempenhar um papel na fisiopatogênese da progressão da linfocitose B monoclonal para leucemia linfóide crônica.
Como mencionado anteriormente, as alterações citogenéticas recorrentes na LLC tem impacto no prognóstico e no comportamento das células clonais, reforçando a idéia de que as vias moleculares afetadas estejam envolvidas na fisiopatogênese da doença (especialmente as relacionadas com os microRNAs miR-15a, miR-16-1 e miR-34b/c). Em experimentos com culturas de linhagens celulares e de linfócitos clonais de pacientes com LLC, Fabbri e colaboradores em 2011 empregaram a técnica de imunoprecipitação de cromatina para estudar as relações funcionais entre os diferentes genes envolvidos nestas mutações (FABBRI et al., 2011). Os autores concluíram que as anormalidades nos cromossomos 11, 12 e 13 participam da construção de um circuito de interação “TP53-microRNA”, onde o geneTP53 desempenha um papel central para os mecanismos geradores de doença. O fato deste circuito ser perturbado em diferentes níveis por alterações gênicas distintas pode servir de modelo para explicar a ocorrência da mesma doença manifestando-se de forma variável do ponto de vista clínico-laboratorial. O circuito de interação “TP53-microRNA” está ilustrado na Figura 12.
Figura 12: Circuito de interação "TP53-microRNA" como modelo fisiopatogênico na leucemia linfóide crônica.
Ilustração das interações entre as principais alterações citogenéticas e as vias moleculares correspondentes, responsáveis pelo desenvolvimento da leucemia linfóide crônica. “Setas” indicam estimulação e “linhas truncadas” indicam inibição. O gene ATM pode exercer sua função reguladora diretamente sobre a p53, ou de maneira indireta por meio da cinase
checkpoint 2 (CHK2)
2 JUSTIFICATIVA
A LLC é a forma de leucemia mais prevalente em países ocidentais. Conquanto os dados epidemiológicos brasileiros ainda não sejam conhecidos de maneira precisa, as taxas de incidência da LLC chegam a atingir a média de 6,4 casos para cada 100.000 habitantes por ano na Inglaterra, sendo esperados mais de 15.500 casos novos anuais nos EUA, o que configura uma patologia de interesse para os órgãos e instituições responsáveis pelo planejamento e pelas ações de saúde pública.
A forma familiar da doença corresponde a pelo menos 5% dos casos e em uma parte considerável (até 17%) dos familiares de pacientes portadores de LLC podemos identificar a presença de LBM, o que para alguns (1 a 2%) pode representar a fase inicial da doença, traduzindo um risco significativamente maior do que o da população geral para o desenvolvimento desta patologia.
Não obstante as alterações citogenéticas recorrentes (detectadas por bandeamento cromossômico e por FISH) e suas vias moleculares correspondentes ofereçam evidências significativas sobre os mecanismos geradores de doença, a fisiopatogenia da LLC ainda é mal compreendida, o que representa um desafio para a ciência.
O estudo de anormalidades cromossômicas em nível submicroscópico na LLC familiar constitui um excelente modelo para o melhor entendimento dos possíveis fatores relacionados com a herdabilidade e dos mecanismos envolvidos na fisiopatogênese desta entidade nosológica. A técnica de análise cromossômica por microarranjo (CMA) também pode contribuir para a melhor compreensão dos fenômenos responsáveis pelas diferenças de comportamento do clone leucêmico e de evolução da doença observados em indivíduos afetados de uma mesma família (entre os quais podemos citar o fenômeno de AG).
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar as alterações citogenéticas moleculares relacionadas com a LLC familiar utilizando a técnica de CMA e correlacionar os eventuais achados com os possíveis mecanismos de herança e de desenvolvimento de doença, particularmente em relação ao fenômeno de AG e suas influências sobre a evolução e o prognóstico desta enfermidade.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Descrever as características clínicas, imunofenotípicas e citogenéticas encontradas em três membros de uma mesma família acometidos por LLC e, portanto, caracterizando em conjunto um quadro de LLC familiar.
Investigar, por meio de avaliação clínico-laboratorial e imunofenotipagem de sangue periférico, a presença de LBM ou LLC assintomática nos indivíduos declarados como não-afetados, parentes dos portadores de LLC, membros da mesma família agora em estudo.
Ressaltar as semelhanças e diferenças na apresentação clínico-laboratorial e no comportamento (evolução) da doença de cada indivíduo afetado, em especial as considerações com pertinência para a avaliação do prognóstico e de progressão da doença, bem como a correlação com a AG.
Empregar a técnica de CMA para dissecar as alterações citogenéticas em nível submicroscópico presentes nos clones leucêmicos de cada indivíduo afetado. Correlacionar os achados do CMA com os mecanismos fisiopatogênicos e com o fenômeno de AG da LLC familiar, especialmente aqueles com eventual influência sobre a evolução e o prognóstico na LLC familiar.
Comparar o perfil de CMA encontrado em células mononucleares e parietais dos indivíduos portadores de LLC com o dos indivíduos não-afetados da mesma família, buscando o reconhecimento de possíveis marcadores de relevância fisiopatogênica na LLC familiar que possam ser utilizados na identificação de fatores de risco para o desenvolvimento da doença.
4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 POPULAÇÃO DO ESTUDO
Trata-se de um estudo de caso tendo como população alvo uma família composta por 26 indivíduos, sendo três deles portadores de LLC, cujas relações de parentesco podem ser apreciadas no heredograma retratado pela Figura 13. No heredograma cada um dos indivíduos foi identificado numericamente em ordem crescente, de acordo com a geração a que pertence (A, B e C, respectivamente). Os indivíduos portadores de LLC (afetados) foram identificados com “” conforme a ilustração da Figura 13.
Figura 13: Heredograma de leucemia linfóide crônica familiar com três membros afetados.
Indivíduos marcados com “” possuem informações clínico-laboratoriais completas, indivíduos marcados com “” são portadores de leucemia linfóide crônica.
Informações clínicas completas e resultados de exames laboratoriais pertinentes (hemograma completo e imunofenotipagem de sangue periférico) estão disponíveis para oito dos 26 membros da família (indivíduos B2, B5, B6, C5 a C9, sujeitos da pesquisa, identificados no heredograma com o símbolo “”), incluindo os três indivíduos afetados. Para os demais indivíduos não foi possível a realização de investigação clínico-laboratorial por limitações de
ordem geográfica (residentes em regiões fora da área de influência do Distrito Federal), sendo as informações sobre o estado de saúde e sobre a possibilidade de afecção por patologias onco-hematológicas (inclusive LLC) obtidas unicamente por meio de entrevista por telefone ou fornecidas e confirmadas por pelo menos dois de seus parentes de primeiro grau.
Como informação adicional, o indivíduo C6 (não afetado) tem tipagem HLA classe I e II idêntica a do indivíduo C8 (afetado) sendo, portanto, o potencial doador de células tronco-hematopoiéticas em caso de transplante de medula óssea.
4.1.1 Coleta de amostras e obtenção de dados clínicos
Toda e qualquer coleta de amostra de material biológico, bem como a obtenção de dados e informações clínicas, foram precedidos da assinatura espontânea do “Termo de Consentimento Informado” (TCI) por parte dos indivíduos, sujeitos desta pesquisa. Todos os indivíduos participantes concordaram em fornecer informações de anamnese e serem submetidos a exame físico detalhado, realizado por profissional médico especialista em Hematologia em ambiente adequado. Adicionalmente, todos os sujeitos da pesquisa concordaram em fornecer material biológico, o qual foi coletado por pessoal técnico capacitado (sangue e saliva), seguindo as recomendações dos guias de conduta.
As amostras de material biológico consistiram em alíquotas de sangue periférico coletados por meio de punção venosa superficial em membro superior, preferencialmente na face anterior do antebraço (veia basilar ou cubital) dos indivíduos objeto desta pesquisa, seguindo todos os rigores de assepsia preconizados pelas normas da Vigilância Sanitária. A punção venosa foi realizada por profissional treinado da área de saúde (médico, enfermeiro ou técnico de enfermagem). As amostras de células de mucosa e saliva foram coletadas por profissional capacitado, ou pelo próprio indivíduo objeto da pesquisa devidamente treinado, utilizando o kit da ORagene® contendo solução indicada para conservação do material de DNA.
Os dados clínicos (anamnese, exame físico e avaliação laboratorial) foram obtidos por profissional capacitado (médico ou enfermeiro) à partir das
