Desenho de primers de iPLEX MassARRAY

A preparação de um ensaio tem início com o desenho automático dos primers de amplificação e de extensão para as mutações causativas de MH, através do software

MassArray Assay Design 3.1 da Sequenom®. Este software permite desenhar os primers de

amplificação e de extensão para cada mutação em estudo, a partir de um fragmento que engloba a mutação flanqueada para cada lado, cerca de 50 a 100 nucleótidos, como se pode observar na Tabela 3.1 (Sequenom®, 2007).

Tabela 3.1 – Exemplo de sequência utilizada pelo software MASSARRAY Assay Design 3.1. (Sequenom®₎

para o desenho dos primers de amplificação e de extensão para a mutação CM56 no gene MYBPC3. O

código CM56 refere-se a uma mutação missense no gene MYBPC3, no exão 6 (HGMD®

http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php cedido a 31 de Janeiro de 2012). Entre parêntesis demarca-se a variante alélica a identificar. Mutação (gene_códigoHGMD®₎ Sequência MYBPC3_CM56 GTCTATCTGTTCGAGCTGCACATCACCGATGCCCAGCCTGCC TTCACTGGC[A/G]GCTACCGCTGTGAGGTGTCCACCAAGGAC AAATTTGACTGCTCCAACTTCAATCTCACTGTCCACG

Para a identificação de cada mutação em estudo, são necessários dois primers de amplificação (que flanqueiam a região a amplificar, como exemplificado na tabela 3.1) e um

primer de extensão (dirigido especificamente para a mutação). O software permite a

organização dos primers e em consequência das mutações a estudar, em plexes, em que cada um dos plexes é composto por um conjunto de no máximo de 40 conjuntos de primers, correspondendo cada plex a um poço da placa de 384 poços e respectivamente a um poço do

Figura 3.2 – Spectrochip (Sequenom®_{, 2007).}

Devido à relação inversa entre a intensidade dos picos e a massa do analíto, é recomendado que num ensaio de iPLEX a extensão dos primers seja ajustada. O primer com massa mais elevada, cerca de 8500 Da, possui um pico com uma intensidade inferior a 25% que a média da massa dos primers mais baixos. Devido a este facto, a relação entre a razão do SNR (signal to noise) e a massa do analíto pode representar um desafio significativo para o

software de atribuição dos calls, podendo ocorrer variações inesperadas na altura dos picos.

Neste contexto as reacções de genotipagem bem como a análise dos picos podem ser influenciadas, conduzindo a erros na genotipagem (Sequenom®, 2007).

Estas variações podem ser causadas pela inconsistência da qualidade dos primers e / ou ao mau funcionamento da parte de desorpção/ionização do MALDI. As medidas de densidade óptica para avaliar a qualidade dos primers não são suficientes, uma vez que os fragmentos provenientes da síntese parcial e outros contaminantes absorvidos, contribuem para uma sobre estimativa da concentração dos primers (Sequenom®, 2007).

Esta estimativa da concentração dos primers pode resultar numa baixa intensidade do sinal nos espectros e problemas consequentes na atribuição de calls. Para superar esta situação, é recomendado efectuar um teste prévio da mistura dos primers antes de se utilizar o MALDI-TOF MS para genotipagem; sendo que a mistura dos primers contém cada um dos

primers à mesma concentração, sendo analisados pela plataforma de MassARRAY

(Sequenom®, 2007).

O Software de análise TYPER Analyzer cria um relatório, designado Primer

Adjustment Report que identifica a sequência inicial de cada um dos primers, de modo a

ajustá-los dentro dos plexes, recomendando um rácio de ajuste. Dado que existe uma relação inversa entre a massa e o rácio do SNR do analíto, este relatório especifica a massa de cada

primer a ser ajustado. Em casos extremos, o sinal pode-se tornar indistinguível do barulho,

A primeira opção consiste no agrupamento dos primers em dois grupos, de menor massa e de maior massa, duplicando-lhes a concentração, como se verifica na Figura 3.3. Esta opção 1, constitui o método mais acessível e fácil de se utilizar, mas pode conduzir a uma percentagem de calls relativamente baixa (Sequenom®, 2007).

Figura 3.3 – Método de ajuste dos primers de extensão, opção 1. Esta opção consiste numa divisão dos

primers em dois grupos (primers com massa baixa e elevada), duplicando-lhes a concentração da massa

respectiva (Adaptado de Sequenom®_{, 2007).}

A segunda opção consiste na distribuição dos primers por quatro grupos, duplicando-lhes a concentração e dividindo-os tendo em conta a sua massa (variando de

primers com menor massa a primers com massa mais elevada), como se observa na Figura

3.4. O primeiro grupo de primers com massa mais baixa tem uma concentração de 625 nM, o segundo grupo de 830 nM, o terceiro grupo de 1,04 µM e por fim o grupo de primers com a massa mais elevada a 1,25 µM (Sequenom®, 2007). Todos os primers utilizados neste ensaio foram ajustados tendo em conta esta opção de ajuste.

Figura 3.4 – Método de ajuste dos primers de extensão, opção 2. Esta opção compreende a divisão dos

primers em quatro grupos, duplicando a concentração destes, sendo divididos pela respectiva massa (Adaptado

de Sequenom®_{, 2007).}

Por fim a última opção baseia-se no método de regressão, em que cada primer é misturado a uma concentração específica de acordo com a sua massa, como se pode observar

na Figura 3.6B. Conhecendo a massa, é possível equilibrar cada primer no espectro utilizando as suas concentrações específicas. Esta relação pode ser derivada a partir da equação:

Esta relação não considera a pureza dos oligonucleótidos e as variações das sequências durante a dessorção/ionização, contudo ainda é utilizada como um bom ponto de começo. Por exemplo para o cálculo da concentração dos oligonucleótidos diluídos, pode-se partir da seguinte fórmula:

Figura 3.5 – Comparação da concentração não ajustada dos primers com a concentração ajustada dos

primers pelo Método da Regressão, opção 3. Permite ver os efeitos de um bom ajuste de primers durante um

ensaio de iPLEX (Adaptado de Sequenom®, 2007).

Para se obter uma bom ensaio e uma percentagem de calls elevada, as opções 2 (divisão dos primers em quatro grupos tendo em conta a sua massa) e 3 (método de regressão, tendo em conta a concentração especifica de cada primer) são mais recomendadas pela Sequenom®.