Detecção de heterocromatina constitutiva

4.2.2.1. Detecção de heterocromatina constitutiva   

A  análise  das  regiões  heterocromáticas  foi  realizada  através  do  bandamento‐C,  segundo  Sumner  (1972).  Foram  utilizadas  lâminas  com  material  envelhecido  em  estufa  a  37°C  por  no  mínimo  3  dias,  após  esse  período  a  lâmina  foi  imersa  em  HCl  0,2  N  por  14  minutos  em  temperatura  ambiente,  sendo  lavada  com  água  destilada  e  seca.  Posteriormente a lâmina foi mergulhada em uma solução a 5% de Ba(OH)2.8H2O à 42°C por  cerca de 1 minuto e 45 segundos sendo rapidamente lavadas em HCl 0,1N e posteriormente  água destilada. Após secar ao ar, a lâmina foi então imersa em solução salina 2xSSC à 60°C  em estufa por 40 minutos. Para análise o material foi corado com Giemsa 5% por 8 minutos.    4.2.2.2. Fluorocromos GC ‐ e AT‐ específicos (MM e DAPI)   

Fluorocromos  base‐específicos  foram  utilizados  para  detectar  regiões  ricas  em  pares de bases, como a mitramicina (MM) para pares de bases GC e DAPI para regiões ricas  em pares de bases AT, de acordo com Schweizer (1976). As lâminas com suspensão celular  foram  coradas  com  30μl  de  MM  0,5  mg/ml  cobertas  com  lamínulas  e  depositadas  em  câmara úmida, no escuro, sendo lavadas com água destilada após 30 a 60 minutos, coradas  com  30  μl  de  DAPI  0,3µg/ml,  cobertas  por  lamínulas  e  colocada  em  câmara  úmida,  no  escuro,  por  15  minutos.  Posteriormente  as  lâminas  foram  lavadas  com  água  destilada  e  montadas  com  tampão  glicerol‐Mcllvaine  pH  7,0  (1:1)  coberto  com  lamínula  e  selado  com  esmalte  incolor.  As  lâminas  foram  então  guardadas  à  4  ˚C  em  câmara  escura  e  analisadas  após  3  dias  com  fotomicroscópio  de  epifluorescência  (OlympusTM  BX51)  com  filtros  apropriados, em aumento de 1.000x. As preparações foram capturadas pelo sistema digital  Olympus DP73 com uso do software CellSens Standard 1.7 Full (Olympus Optical Co. Ltd.).    4.2.2.3. Obtenção das sondas de DNA para FISH por PCR    Sondas de DNAr 5S e DNAr 18S foram obtidas por PCR a partir do DNA nuclear de R.  canadum e Ocyurus chrysurus, utilizando os primers A 5’‐TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC‐3’ 

e B 5’‐CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC‐3’ (Pendás et al., 1994), NS1 5’‐GTA GTC ATA TGC  TTG  TCT  C‐3’  e  NS8  5’‐TCC  GCA  GGT  TCA  CCT  ACG  GA‐3’  (White  et  al.,  1990),  respectivamente. A primeira sonda continha uma cópia de DNAr 5S de 200pb e a segunda de  DNAr 18S de 1400pb. A sonda de DNAr 5S foi marcada com biotina‐14‐dATP e a sonda de  DNAr  18S  com  digoxigenina‐11‐dUTP,  ambas  por  nick  translation,  seguindo  as  recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). 

As  sondas  teloméricas  foram  obtidas  utilizando  o  primer  (TTAGGG)n,  amplificado  segundo  Ijdo  et  al.  (1991)  e  marcadas  usando  DIG‐Nick  Translation  Mix  seguindo  a  recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). 

Sondas do DNA transponível (Tol2) foi obtido por PCR a partir do DNA nuclear de R. 

canadum, utilizando os primers Tol2 4 F 5’‐ ATA GCT GAA GCT GCT CTG ATC ‐ 3’ e Tol2 4 R 5’‐ 

CTC AAT ATG CTT CCT TAG G ‐ 3’, Tol2 5 F 5’‐ CTG CTC TGA TCA TGA AAC AG ‐ 3’ e Tol2 5 5’‐  CTT CCT TAG GTT TGA TGG CG ‐3’ (Kawakami & Shima 1999). Ambas as sondas continham  cópia  de  DNA  Tol2  de  200pb.  A  sonda  amplifica  com  os  primes  Tol2  4  foi  marcada  com  biotina‐14‐dATP  e  a  sonda  com  Tol2  5  com  digoxigenina‐11‐dUTP,  ambas  por  nick 

translation, seguindo as recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). 

A amplificação do DNA retrotransponível (Rex1 e Rex3), a partir do DNA genômico  de  R.  canadum  e  O.  chrysurus,  foi  realizada  utilizando  os  primers  Rex1  F  5’‐    TTC  TTC  AGT  GCC  TTC  AAC  ACC  ‐  3’  e  Rex1  R  5’‐  TCC  CTC  AGC  AGA  AAG  AGT  CTG  CTC  ‐  3’,  desenhados  para amplificar segmentos Rex1 correspondentes aos domínios de codificação 3‐7 do gene  da transcriptase reversa (RT), e os primers Rex3 F 5’‐ CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG ‐ 3’ e  Rex3  R  5’‐  TGG  CAG  ACN  GGG  GTG  GTG  GT  ‐  3’,  para  Rex3,  utilizados  para  amplificar  os  domínios de codificação 1, 2, 2A, A e B do gene da RT, ambos desenhados a partir dos genes  de Xiphophorus (Volff et al., 1999; Volff et al., 2000) e amplificados segundo Valente et al.,  (2011).  As  sondas  de  retrotransposons  foram  marcadas  utilizando  nick  translation,  com  biotina‐14‐dATP  para  Rex1  e  digoxigenina‐11‐dUTP  para  Rex3,  seguindo  a  recomendações  do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). 

A amplificação dos genes das histonas, a partir do DNA genômico de R. canadum e 

O. chrysurus  foi realizada utilizando os primers H2BAF 5’‐CCC GAG ATG TGA TGG TAG A‐3’ e 

H2BAR 5’‐AGT ACA GCC TGG ATG TTT GGT AA, para H2A‐H2B, e os primers H3F 5’‐ATG GCT  CGT  ACC  AAG  CAG  ACV  GC‐3’  e  H3R  5’‐ATA  TCC  TTR  GGC  ATR  ATR  GTG  AC‐3’,  para  H3, 

ambos  desenhados  a  partir  dos  genes  de  histonas  do  molusco  Mytilus  edulis  (Albig  et  al.,  2003)  e  amplificados  segundo  Giribert  &  Distel  (2003).  As  sondas  de  histonas  foram  marcadas utilizando nick translation, com biotina‐14‐dATP para H2A‐H2B e digoxigenina‐11‐ dUTP para H3, seguindo a recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). 

4.2.2.4. Obtenção de DNA Cot‐1   

DNA  genômico  de  R.  canadum  foi  extraído  utilizando  o  procedimento  de  fenol‐ clorofórmio  descrito  por  Sambrook  e  Russel  (2001).  O  Cot‐1,  DNA  enriquecido  com  sequências  altamente  e  moderadamente  repetitiva,  foi  isolado  empregando  a  enzima  S1  nuclease  adotando  o  procedimento  descrito  por  Zwick  et  al.,  (1997),  modificado  para  Actinopterygii  por  Ferreira  e  Martins  (2008).  A  fração  do  DNA  Cot‐1  foi  marcada  por  nick 

translation  com  digoxigenina‐11‐dUTP  (Roche,  Mannheim,  Alemanha)  ,  e  utilizado  como 

sonda para a análise de FISH.   

4.2.2.5. Oligonucleotídeos enriquecidos com microssatélites   

Os  seguintes  oligonucleotídeos  enriquecidos  com  sequências  microssatélites  foram  utilizados  como  sondas:  d(GA)15,  d(CA)15,  d(CAC)10,  d(GC)15,  d(CAA)10,  d(CAG)10,  d(CAT)10,  d(CAA)10  e  d(GAA)10.  Essas  sequências  foram  marcadas  diretamente  com  Cy3  na  extremidade  5'  durante  a  síntese,  por  VBC‐Biotech  (Viena,  Áustria),  segundo  Kubat  et  al.  (2008), com pequenas modificações. 

4.2.2.6. Hibridação fluorescente in situ (FISH)   

A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com a metodologia  descrita  por  Pinkel  et  al.,  (1986)  com  modificações.  As  sondas  foram  marcadas  por  nick  translation (DIG‐Nick Translation Mix e Biotin – Nick Translation Mix, Roche) de acordo com  as instruções do fabricante. A solução de hibridação consistiu de 240 μl de formamida 50%,  96  μl  de  sulfato  dextrano  50%,  48  μl  de  20xSSC  e  água  ultra  pura,  perfazendo  um  volume  total  de  480  μl,  sendo  adicionado  1,5  μg  de  sonda  (DNA  marcado  com  biotina  ou