Gideão W.W.F. Costa1, Marcelo de B. Cioffi2, Luiz A. C. Bertollo 2, 3, Wagner F. Molina1* 1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil 2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP, Brasil 3 Professor Sênior na Universidade Federal de São Carlos Resumo
Lutjanidae é uma família de peixes carnívoros, principalmente marinhos, distribuídos no Atlântico, Índico e Pacífico. São descrito para o litoral brasileiro 12 espécies sendo nove pertencentes ao gênero Lutjanus e uma ao gênero Ocyurus. As relações filogenéticas das espécies do Atlântico Ocidental paulatinamente vem sendo melhor estabelecidas. Apesar da sua importância econômica e ecológica, os aspectos citogenéticos dos Lutjanidae, que poderiam contribuir para estudos filogenéticos e biotecnológicos são incipientes, sobretudo no que diz respeito ao mapeamento físico de DNAs repetitivos. Tendo em vista que os Elementos Transponíveis representam uma classe de sequências repetitivas com intensa participação nos processos de dinâmica cariotípica envolvendo regiões heterocromáticas. O presente estudo teve como objetivo realizar mapeamento cromossômico de elementos retrotransponíveis Rex1 e Rex3 em cinco espécies da subfamília Lutjaninae (L. analis, L. jocu,
L. alexandrei, L. synagris e Ocyurus chrysurus), com o intuito de evidenciar a distribuição e
possível associação dessas sequências com as regiões heterocromáticas. Os retrotransposons Rex1 e Rex3 localizaram‐se dispersos nos cromossomos tanto em regiões totalmente eucromáticas, como em algumas regiões heterocromáticas que representam um refúgio para sequências repetitivas. A distribuição moderadamente compartimentalizada dos elementos retrotransponíveis Rex é compatível com o conservadorismo na macroestrutura cariotípica da família Lutjanidae não demonstrando particular associação com a distribuição explosiva de sequências DNAhis H3 no cariótipo de O. chrysurus.
Palavras chave: Lutjanus, Ocyurus, sequência repetitiva, retrotransposons, composição heterocromática.
Introdução
Nos últimos anos, estudos genômicos e citogenéticos, vêm utilizando análises de sequências, microarranjos (microarrays) e mapas genéticos, na identificação de genes envolvidos na resistência, crescimento, reprodução, estudos evolutivos, identificação de cromossomos sexuais e rearranjos cromossômicos em muitas espécies de peixes com importância ecológica e econômica (Ferreira & Martins, 2008; Oleksiak, 2010; Costa et al., 2013). Adicionalmente, o mapeamento cromossômico de sequência de DNA repetitivo nos cromossomos podem auxiliar de forma complementar em mapas de ligação genética em peixes (Martins et al., 2004; Freeman et al., 2007; Ghigliotti et al., 2012).
Amplamente distribuídas nos genomas dos eucariotos as sequências de DNAs repetitivos são geralmente classificadas em sequências repetitivas em tandem, arranjadas em sucessivas repetições como DNA satélites, minissatélites e microssatélites, e sequências dispersas pelo genoma, como transposons e retrotransposons (Jurka et al., 2005; Kuhn et al., 2012).
Apesar de não possuir informações suficientes para compreender plenamente a função dos DNAs repetidos, acumulam‐se evidências do envolvimento dessas sequências no processo de organização estrutural e funcional do genoma (Liu et al., 2001; Li et al., 2002; Parise‐Maltempi et al., 2007), bem como em rearranjos cromossômicos, responsáveis por significativas variações cariotípicas são observadas em muitos grupos (Kidwell, 2002).
A presença constante de DNAs repetitivos nos cromossomos de peixes, que têm papel ativo na dinâmica evolutiva do cariótipo (Molina, 2007) vêm reforçando a ideia de que o isolamento, a caracterização, a organização genômica e o mapeamento cromossômico dessas sequências poderão responder questões quanto a origem e evolução dos cromossomos.
Os peixes representam o grupo mais diversificado de vertebrados, cujos genomas possuem uma elevada diversidade de classes de elementos transponíveis (Volff et al., 2003). Entretanto, a identificação de elementos transponíveis e retrotransponíveis neste grupo ainda são escassos. Comparado com a grande diversidade de espécies, quantitativamente poucas dispõem de sequenciamento genômico (Woods et al., 2000; Aparicio et al., 2002;
Jaillon et al., 2004; Kasahara et al., 2007), e da mesma forma dados de mapeamento físico, estão disponíveis para apenas 32 espécies (Ferreira et al., 2011).
Um desses grupos de peixes cujo mapeamento físico de DNAs repetitivos é incipiente é a família Lutjanidae, um grupo composto por 17 gêneros e 120 espécies, principalmente marinhas associados a recifes, que constituem recursos importantes para a pesca comercial em algumas regiões do Atlântico (Gold et al., 2011). Estão distribuídos pelo Atlântico, Índico e Pacífico, mares tropicais e subtropicais do mundo, com poucas espécies de ambientes estuarinos (Nelson, 2006).
No Brasil, são descritos quatro gêneros pertencentes a duas subfamílias (Etelinae e
Lutjaninae), oito espécies do gênero Lutjanus e os gêneros monotípicos Ocyurus, Rhomboplites e Etelis, difundidos ao longo de todo o litoral brasileiro (Floeter et al., 2003;
Moura & Lindeman, 2007). As espécies desse grupo possuem um grande valor comercial, assim como, um importante recurso para a comunidades ribeirinhas que praticam a pesca de subsistência (Resende et al., 2003). Devido a esse cenário, algumas espécies de Lutjanidae vem sofrendo sobrepesca, e projetos relacionados a aquicultura marinha dessas espécies vem sendo desenvolvidos (Lorenzen et al., 2010; Saillant et al., 2013).
Apesar das aproximadamente 120 espécies conhecidas de Lutjanidae e de sua importância ecológica e econômica, análises citogenéticas ainda são incipientes. Poucas espécies foram cariotipadas, como por exemplo, L. argentimaculatus (Raghunath & Prasad, 1980), L. russelli (Ueno & Ojima, 1992), L. analis, L. alexandrei, L. synagris, L. jocu, L.
cyanopterus, L. griseus e O. chrysurus (Nirchio et al., 2008; Rocha & Molina, 2008) e Rhomboplites aurorubens (Nirchio et al., 2009).
Estudos citogenéticos prévios com algumas espécie de Lutjanidae forneceram informações sobre a estrutura cariotípica e o mapeamento físico de sequências ribossomais (Nirchio et al., 2008; Rocha & Molina, 2008; Nirchio et al., 2009). Contudo, a composição das porções heterocromáticas do genoma e a possível presença de genes associados a estas regiões eram até então desconhecidos.
Nesse contexto, foi realizado o mapeamento de sequências de DNAs repetitivos no genoma de cinco espécie de Lutjanidae. As sequências utilizadas são derivadas de elementos transponíveis do tipo SINE e LINE (Oliveira & Wright, 1998; Oliveira et al., 1999). Retrotransposons non‐LTR da família Rex, retroelementos caracterizados pela primeira vez
no genoma do peixe Xiphophorus (Rex1, Rex3 e Rex6), estão presentes no genoma de diferentes espécies de peixes teleósteos (Volff et al., 1999; Volff et al., 2000), na maioria dos casos revelam fortes marcações em regiões heterocromáticas como em Erythrinus erythrinus (Cioffi et al., 2010) e alguns ciclídeos (Valente et al., 2011). O presente estudo tem como objetivo averiguar a composição heterocromática e sua possível associação com sequências repetitivas de DNA retrotransponíveis (Rex1 e Rex3) nos cromossomos de Lutjanus analis, L. synagris, L. jocu, L. alexandrei e Ocyurus chrysurus, demonstrando a distribuição dessas sequências no cariótipo dessas espécie Material e Métodos Espécimes e preparações cromossômicas Espécimes imaturos de sexo indeterminado de Lutjanus analis (n=8), Lutjanus synagris (n=8), Lutjanus jocu (n=8), coletados no estuário do Rio Potengi, em Natal (5°45'37.08"S; 35°12'19.61"O) e Lutjanus alexandrei (n=8) e Ocyurus chrysurus (n=8), coletados na Praia de Carnaubinha (5°12'49.53"S; 35°26'2.58"O) no estado do Rio Grande do Norte, Nordeste do Brasil, foram utilizados para as análises citogenéticas. Os espécimes foram previamente submetidos à estimulação mitótica in vivo, pela aplicação intramuscular de antígenos compostos atenuados, por um período de 24hs (Molina, 2001; Molina et al., 2010). Após este período os animais foram anestesiados com óleo de cravo (Eugenol) e sacrificados para remoção do tecido renal. Cromossomos metafásicos foram obtidos a partir de suspensões celulares, através da interrupção in vitro do ciclo mitótico, conforme a metodologia de Gold et al. (1990). Um volume de 80µl da suspensão celular foi gotejado em uma lâmina coberta com uma película de água destilada aquecida à 60°C. Os cromossomos foram corados com uma solução de Giemsa 5%, diluída em tampão fosfato (pH 6.8), por 8 minutos. Sondas da hibridização cromossômica A amplificação do DNA retrotransponível (Rex1 e Rex3), a partir do DNA genômico de O. chrysurus, foi realizada utilizando os primers Rex1 F 5’‐ TTC TTC AGT GCC TTC AAC ACC ‐ 3’
e Rex1 R 5’‐ TCC CTC AGC AGA AAG AGT CTG CTC ‐ 3’, desenhados para amplificar segmentos Rex1 correspondentes aos domínios de codificação 3‐7 do gene da transcriptase reversa (RT), e os primers Rex3 F 5’‐ CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG ‐ 3’ e Rex3 R 5’‐ TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT ‐ 3’, para Rex3, utilizados para amplificar os domínios de codificação 1, 2, 2A, A e B do gene da RT, ambos desenhados a partir dos genes de Xiphophorus (Volff et al., 1999; Volff et al., 2000) e amplificados segundo Valente et al. (2011). As sondas de retrotransposons foram marcadas utilizando nick translation, com biotina‐14‐dATP para Rex1 e digoxigenina‐11‐dUTP para Rex3, seguindo a recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha).
Hibridização in situ fluorescente
A hibridização in situ por fluorescência (FISH), foi realizada seguindo o procedimento descrito por Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados com RNAse (20µg/ml em 2×SSC) por 1 hora a 37°C e com pepsina (0,005% em HCl 10mM) a 37°C por 10 minutos, fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos e em seguida desidratados em um série alcoólica (70%/80%/100%) de 5 minutos cada. As lâminas com os cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2×SSC a 72°C, por 5 minutos. A solução de hibridização, consistindo de 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato de dextran e a sonda desnaturada (5 ng/µl), em um volume final de 30µl, foi depositada sobre a lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós‐hibridização foram efetuadas em 15% formamida/0.2×SSC a 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens em 0,1×SSC a 60°C por 15 minutos e em Tween 20 0,5%/4×SSC por 5 minutos à temperatura ambiente. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti‐digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para Rex3 e streptavidina‐FITC conjugado (Vector) para as sondas Rex1. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Vector).
Analises cariotípicas e idiogramas
Os tipos cromossômicos foram definidos de acordo com a posição do centrômero (Levan et
cromossômicos) os cromossomos acrocêntricos foram considerados portadores de um único braço. Os cromossomos foram ordenados em ordem decrescente de tamanho.
Resultados
Os padrões cariotípicos das cinco espécies de Lutjanidae analisadas foram concordantes com aqueles previamente definidos por Rocha & Molina (2008).
Os retrotransposons Rex1 e Rex3 mostraram‐se preferencialmente dispersos pelos cromossomos das espécies analisadas (Figura 1). Alguns poucos sítios mais evidentes, principalmente do elemento Rex3, foram observados em alguns cromossomos de L analis, L.
alexadrei, O. chrysurus e L. synagris (Figura 1), os quais são coincidentes com regiões
Figura 1. Dual color FISH em cromossomos mitóticos metafásicos de espécies de lutjanídeos hibridizados com sondas Rex1 (verde) e Rex3 (vermelho). Cromossomos foram contracorados com DAPI (azul). Barra = 5µm.
Discussão Presentes nos genomas de todos os seres vivos em quantidade distintas, os elementos transponíveis (TEs) representam uma grande parcela do genoma eucariótico. Tais elementos são considerados como um reservatório dinâmico de sequências responsáveis pela evolução estrutural e funcional de muitos genes, atuando na regulação epigenética, recrutamento de fatores de remodelamento da cromatina, e na estrutura dos cromossomos (Aparicio et al., 2002; Volff et al., 2003; Böhne et al., 2008).
Os elementos retrotransponíveis Rex1, Rex3 e Rex6, pertencentes a classe I de elementos móveis, que se movimentam no interior do genoma utilizando a transcriptase reversa, estão presentes no genoma de diferentes espécies de peixes teleósteos, onde participam da evolução do genoma e sofreram dispersão, algumas delas relativamente recentes (Volff et al., 2000; Volff et al., 2001; Fischer et al., 2004; Ozouf‐Costaz et al., 2004).
Em peixes, o mapeamento cromossômico de elementos transponíveis tem evidenciado tanto uma organização associada à heterocromatina, quanto dispersa no genoma (Ferreira
et al., 2011), conforme evidenciado em Tetraodon nigroviridis (Fischer et al., 2004), Cichla kilberia (Teixeira et al., 2009), Erythrinus erythrinus (Cioffi et al., 2010), Rachycentron canadum (Costa et al., 2013) e em peixes antárticos da subordem Notothenioidei (Ozouf‐
Costaz et al., 2004).
Nas espécies de Lutjanidae ora analisadas os elementos retrotransponíveis Rex1 e Rex3 mostraram‐se preferencialmente dispersos ao longo dos cromossomos, mostrando assim uma distribuição mais difusa no genoma destas espécies, apesar de alguns poucos sítios mais conspícuos de Rex3 serem também evidenciados em regiões centroméricas e teloméricas no cariótipo de algumas espécies.
Análises de diversos elementos transponíveis como Dm‐Line, Tc1, Tol2, Rex (Da Silva et
al., 2002; Harvey et al., 2003; Fischer et al., 2004; Ozouf‐Costaz et al., 2004; Costa et al.,
2013) demonstram que esses elementos na sua maioria estão compartimentalizados em
clusters nos centrômeros e em alguns telômeros, o que sugere que a presença de
heterocromatina nos cromossomos constitua um possível reservatório de elementos transponíveis (Da Silva et al., 2002; Fischer et al., 2004) e fonte de diversificação cariotípica.
Estruturalmente podem estar colocalizados com minissatélites ou microssatélites dispersos ou acumulados em regiões heterocromáticas (Fischer et al., 2004; Costa et al., 2015).
A atividade dos retrotransposons no genoma dos peixes pode ocorrer de forma cooperativa no interior do genoma e estar relacionada aos seus aspectos estruturais ou funcionais (Ozouf‐Costaz et al., 2004; Teixeira et al., 2009). Elementos transponíveis têm sido importantes para a evolução do genoma, causando em alguns casos perda e ganho de sequências e rearranjos cromossômicos (Lyttle & Haymer, 1992; Caceres et al., 1999; Zhang & Peterson, 1999; Evgen'ev et al., 2000; Caceres et al., 2001; Biémont & Vieira, 2006).
Apesar do papel dinâmico dos elementos de transposição, foi identificada uma moderada compartimentalização de Rex1 e Rex3 nas cinco espécies de Lutjaninae. Tal condição poderia estar associada a baixa dinâmica evolutiva encontrada neste grupo de peixes. Nos cromossomos de O. chrysurus que apresentam completa dispersão de sequências do DNAhis H3 nas suas regiões heterocromáticas (Costa et al., In press) estas apresentam um padrão anormalmente elevado destes elementos nestes domínios. A aparente ausência de causalidade entre Rex1 e principalmente Rex3, mais compartimentalizado, sugere a participação de outros elementos de transposição ou fatores neste processo.
Elementos transponíveis estão colocalizados com diversas sequências com notável expansão no genoma de peixes (Costa et al., 2015) e dados de seu mapeamento físico poderão contribuir para compreender a dinâmico do cariótipo de algumas espécies de peixes. O mapeamento sistemático em grupos filogeneticamente extensos poderão contribuir na indicação do seu papel disruptivo em cariótipos conservados como os apresentados pelos Lutjanidae e suas implicações na evolução cariotípica destes grupos.
Agradecimentos
O presente trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq ‐ Processo nº 557280/05‐2), CAPES pela bolsa de estudos concedidas a GWWFC e INCT ‐ Ciências do Mar (CNPq).
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