Determinação da viabilidade celular utilizando MTT

A medição da actividade das células vivas através das desidrogenases mitocondriais foi testada após 24 horas de tratamento na presença dos compostos. O ensaio com MTT é um ensaio colorimétrico para a medição da actividade de enzimas celulares que reduzem o corante de tetrazólio, MTT, a formazan, originando assim uma cor púrpura acastanhada. Quanto mais forte a cor, maior a quantidade de formazan. Os compostos usados foram o fitol, o geraniol e o mirtenol, e o DMSO foi usado como controlo.

Figura 26- Medição da actividade das células HepG2 através das desidrogenases mitocondriais expostas

durante 24 horas a várias concentrações (25, 50, 100 e 250µM) dos compostos testados (fitol, geraniol e mirtenol).

Os dados são apresentados como as médias ± SEM (n=7) e em percentagem de controlo. A medição das desidrogenases foi feita recorrendo ao Perkin-Elmer VICTOR 3 como descrito no Capítulo II – Matériais e Métodos. Os ensaios ocorreram a uma temperatura de 37ºC. Valores estatisticamente significativos: & p <0,05 comparado com o grupo 250 µM e * p <0,05 comparado com o grupo controlo.

Relativamente ao fitol (Figura 26), apenas o valor obtido na concentração 25 µM quando comparada com o valor da 250 µM é estatisticamente diferente. Isto poderá significar que concentrações mais elevadas do fitol poderão apresentar toxicidade, diminuindo assim a actividade das desidrogenases mitocondriais e consequentemente a viabilidade e o crescimento celular.

Quanto ao geraniol e ao mirtenol (Figura 26), todos os valores obtidos são estatisticamente diferentes quando comparados com o controlo. Nestas concentrações testadas, estes compostos apresentam toxicidade para a cultura celular, diminuindo assim a actividade das desidrogenases mitocondriais e consequentemente a viabilidade e o crescimento celular.

3.2.3 Ensaios de determinação de espécies reactivas de oxigénio (ROS)

Com a finalidade de se poder medir a produção de ROS procedeu-se a uma incubação da cultura celular com um composto durante 24 horas. Duas horas antes de se medir ROS induziu-se stresse oxidativo com H2O2 100 µM. O objectivo desta indução

de stresse oxidativo era verificar se os compostos teriam ou não uma função antioxidante quando as células estão expostas a condições de stresse. Os compostos usados foram o fitol, geraniol e mirtenol e como controlo foi usado o DMSO.

Figura 27- Efeitos do fitol na produção de ROS pela cultura celular HepG2 em condições de stresse

oxidativo. Os dados são apresentados como as médias ± SEM (n=7) e em percentagem de controlo. A determinação dos níveis de ROS foi realizada recorrendo ao Perkin-Elmer VICTOR 3 como descrito no Capítulo II – Matériais e Métodos. A sonda usada foi H2DCF-DA durante trinta minutos. Os ensaios

ocorreram a uma temperatura de 37ºC em meio DMEM sem FBS. A indução do stresse oxidativo foi realizada recorrendo a uma incubação das células num meio contendo H2O2 100 µM durante uma hora. O

ensaio controlo (ausência dos compostos testados) foi realizado à mesma temperatura e na presença da mesma concentração do indutor de stresse oxidativo (H2O2). Valores estatisticamente significativos: * p

<0,05 comparado com o grupo controlo.

Relativamente à produção de ROS, no caso do fitol (Figura 27), os valores obtidos em todas as concentrações não são estatisticamente diferentes.

No caso do geraniol (Figura 27), os valores obtidos são todos estatisticamente diferentes quando comparados com o controlo. Nas três concentrações usadas há um aumento na produção de ROS quando comparado com o ensaio controlo pela cultura celular e quando exposta a condições de stresse oxidativo. Estes valores indicam-nos que nestas concentrações o geraniol não possui actividade antioxidante.

No caso do mirtenol (Figura 27), o único valor obtido que é estatisticamente diferente corresponde á concentração de 50 µM, quando comparado com o valor obtido no controlo. Porém, em todas as concentrações há um aparente aumento da produção de ROS, indicando-nos assim que nas concentrações usadas o mirtenol não possui actividade antioxidante.

A integridade da função mitocondrial é sem dúvida alguma essencial à célula (Gupta et al., 2009). A mitocôndria desempenha um papel chave na bioenergética celular, sendo o principal local de síntese de ATP (Koolman and Roehm, 2005). Participa também na regulação de vários aspectos biológicos das células, na morte celular (Schapira, 2012), no estado redox, na promoção da homeostase do cálcio, no desenvolvimento de precondicionamento isquémico e não isquémico e na apoptose (Monteiro et al., 2003). Pode funcionar como um reservatório de cálcio intracelular e desempenha também um papel importante na morte celular programada, que está directamente relacionada com a acumulação de cálcio mitocondrial (Koolman & Roehm, 2005). A disfunção mitocondrial tem um papel central em varias patologias, como por exemplo, no cancro, na diabetes, na obesidade, na isquemia/reperfusão e em doenças neurodegenerativas (Gupta et al., 2009).

Cada vez mais se recorre a substâncias naturais com o intuito de se encontrarem novos princípios activos com fins medicinais. Os terpenóides são amplamente encontrados na natureza. Os monoterpenóides, como o geraniol e o mirtenol, são hidrofóbicos e actuam na membrana dos organismos, podendo provocar lise celular (Turina et al., 2006), inibição do desenvolvimento e do crescimento celular (Abdelgaleil et al., 2009). Os diterpenóides, como o fitol, tem sido descritos como tendo actividade antioxidante, anti carcinogénica, anti-inflamatória (Castro et al., 2001) e anti bactericida (Santos et al., 2008). É de extrema importância o estudo de novos compostos e do seu mecanismo de acção.

Devido à importância que a mitocôndria tem na célula, ao usarmos mitocôndrias hepáticas isoladas, qualquer alteração na função mitocondrial induzida pelos compostos, vai reflectir-se na função celular e consequentemente na função hepática. É de salientar o uso de mitocôndrias hepáticas devido a ser no fígado onde ocorre a metabolização de substâncias exógenas, como por exemplo medicamentos.

4.1 Fitol

A manutenção do potencial transmembranar é essencial para que a mitocôndria mantenha a sua funcionalidade básica, a produção de ATP através da fosforilação

oxidativa. (Chipuk et al., 2006). Os resultados da medição do potencial transmembranar demonstram que as variações no potencial inicial, na despolarização, na repolarização e na lag phase desenvolvidos nas 4 concentrações usadas não são significativos. Porém, a lag phase (isto é, o tempo necessário para fosforilar uma concentração de ADP adicionado) revelou-se ligeiramente aumentada em todas as concentrações quando comparada com o controlo, o que poderá indicar uma menor eficiência do sistema fosforilativo com uma consequente repolarização mais lenta.

Quanto á respiração mitocondrial, o estado 3 respiratório não apresentou valores estatisticamente significativos. O estado 4 aparece sempre aumentado em relação ao controlo, sendo que apenas é estatisticamente significativo na concentração de 100 µM. O estado 4 dá-nos a taxa de consumo de oxigénio após a conversão total do ADP adicionado em ATP, logo estamos em condições não fosforilativas. Ao estar aumentado, poderá ser devido ao aumento da permeabilização da membrana com um consequente aumento do leak de protões. O acoplamento entre a utilização de oxigénio pela cadeia respiratória ao nível do citocromo c oxidase e o ADP fosforilado pela ATPsintase, foi determinado calculando o quociente ADP/O. Apesar de nenhuma das concentrações induzirem alterações estatisticamente significativas no valor do ADP/O, apenas a concentração mais elevada apresenta valores diminuídos quando comparado com os valores do controlo. Isto poderá significar que a mitocôndria manteve a sua capacidade fosforilativa, isto é, não necessitou de mais oxigénio para fosforilar o ADP adicionado. Sob condições não fosforilativas, isto é, na presença de oligomicina, os valores obtidos não são estatisticamente significativos quando comparados com o controlo. A oligomicina actua como inibidor do complexo ATPsintase. A respiração mitocondrial não fosforilativa encontra-se ligeiramente aumentada apenas na concentração 100 µM (mesmo não sendo estatisticamente significativa quando comparada com o controlo). Este aumento, juntamente com o aumento no estado 4 sugerem um aumento na permeabilidade passiva da membrana mitocondrial interna a protões (leak de protões), que poderá estar relacionado com o tipo de acção do composto na membrana interna. Quando se procedeu á estimulação da respiração mitocondrial em condições não fosforilativas com o desacoplador FCCP não se obteve resultados estatisticamente significativos.

A susceptibilidade de mitocôndrias hepáticas à indução da MPT foi avaliada determinando o intumescimento mitocondrial induzido pela acumulação de cálcio nas

capacidade finita para acumularem cálcio antes de ocorrer a indução do poro de permeabilidade transitória. A pré-incubação com CyA, um inibidor específico da MPT, capacitou essas mitocôndrias para acumular e reter o cálcio adicionado, indicando que o intumescimento mitocondrial seria o resultado da indução da MPT. O tratamento com fitol, independentemente da concentração usada, foi capaz de prevenir a indução da MPT, tal como seria de esperar o conteúdo de citocromo c está ligeiramente aumentado nas mitocôndrias incubadas com fitol, havendo assim menor libertação de citocromo c na presença deste composto.

O fitol não apresenta qualquer efeito relativamente á produção de ROS em mitocôndrias isoladas, os valores obtidos não são estatisticamente significativos.

Tendo em conta que o período de replicação da linha celular usada é de 30 horas (Aston et al., 2000), tratamentos de 24h não serão indicadores de menor proliferação mas sim de morte celular. Os valores obtidos na SFR B, apenas há um aumento na morte celular na concentração 250 µM, apesar de não ter significado estatístico. Assim, concentrações mais elevadas de fitol poderão apresentar actividade citotóxica.

Quanto ao MTT,concentrações mais elevadas apresentam actividade citotóxica e afectam de alguma forma o metabolismo celular mitocondrial. Porém, é de frisar que na célula não há apenas desidrogenases na mitocôndria, logo este ensaio só por si só não pode ser usado como conclusivo.

Os valores obtidos em todas as concentrações não são estatisticamente significativos relativamente á produção de ROS, tal como aconteceu em mitocôndrias isoladas.

4.2 Geraniol

Quanto ao potencial transmembranar os resultados demonstram que apenas os valores das concentrações 50 µM e 100 µM são estatisticamente significativas quando comparados com o controlo no potencial inicial e na repolarização. Isto significa que o geraniol actua tanto no potencial inicial, que nos dá a capacidade fosforilativa quando carregado energeticamente pelo succinato (substrato do complexo II) como na repolarização, tempo necessário para que haja uma recuperação do potencial inicial após uma despolarização com ADP. Porém, é notório que que apesar de ser estatisticamente significativo, apenas há uma ligeira diminuição em ambos. A diminuição no potencial inicial induzido pela adição de ADP corresponde à energia utilizada pela ATPsintase

para a fosforilação do ADP adicionado. A recuperação do valor inicial do potencial inicial (repolarização) ocorre quando o ciclo fosforilativo é completado e poderá encontrar-se ligeiramente afectado nas duas concentrações acima referidas. A despolarização mitocondrial e a perda de potencial electroquímico estão directamente associados à apoptose (Matsuyama and Reed, 2000), seguidas pela libertação do citocromo c (Gupta et al., 2009). Estudos anteriormente feitos sugerem que o geraniol leva a uma despolarização da membrana mitocondrial, um evento precoce para a sinalização da apoptose intrínseca (Kim et al., 2011).

Na respiração mitocondrial, nenhum dos estados apresenta valores estatisticamente significativos, tal como os índices ICR e ADP/O. Porém é de salientar que o estado 4 apresenta valores mais elevados em todas as concentrações quando comparados com o controlo. Tal como já foi referido no fitol, o estado 4 dá-nos a taxa de consumo de oxigénio após a conversão do ADP adicionado em ATP, logo estamos em condições não fosforilativas. Ao estar aumentado, poderá ser devido ao aumento da permeabilização da membrana com um consequente aumento do leak de protões. Os valores do ICR são ligeiramente inferiores em todas as concentrações quando comparados com o controlo, principalmente na concentração mais elevada usada, mesmo não sendo estatisticamente significativos. O acoplamento entre a utilização de oxigénio pela cadeia respiratória ao nível do citocromo c oxidase e o ADP fosforilado pela ATPsintase, foi determinado calculando o quociente ADP/O. Nenhuma das concentrações induziram alterações estatisticamente significativas no valor do ADP/O. Na presença da oligomicina, inibidor do complexo ATP sintase, note-se que todos os valores se encontram aumentados quando comparados com o controlo, principalmente a concentração 50 µM. Este aumento, juntamente com o aumento no estado 4 sugerem um aumento na permeabilidade passiva da membrana mitocondrial interna a protões (leak a protões), que poderá estar relacionado com o tipo de acção do composto, devido à sua lipofílicidade, na membrana interna. Quando se procedeu á estimulação da respiração mitocondrial em condições não fosforilativas com o desacoplador FCCP não se observaram diferenças estatisticamente significativas nas mitocôndrias incubadas com os compostos quando comparadas com o grupo controlo.

O geraniol, tal como já se referiu anteriormente, é um monoterpeno. E um das características dos monoterpenos é o seu modo de acção nas membranas. Como são altamente hidrofóbicos, os seus efeitos biológicos estão relacionados com interacções a

mesmo lise celular (Turina et al., 2006; Abdelgaleil et al., 2009). Estas alterações provocadas na membrana mitocondrial podem estar relacionadas com o aumento da permeabilidade da membrana interna.

A susceptibilidade de mitocôndrias hepáticas à indução da MPT foi avaliada determinando o intumescimento mitocondrial induzido pela acumulação de cálcio nas mitocôndrias. O geraniol teve uma função indutora na MPT na concentração 100µM. Isto poderá querer dizer, tal como outros estudos (Kim et al., 2011) já referiram que o geraniol poderá ser um indutor da apoptose. Como induz a abertura do poro mitocondrial, irá haver libertação de citocromo c, que funciona como factor pro- apoptótico e que consequentemente poderia activar a via apoptótica intrínseca.

A capacidade mitocondrial para acumular Ca2+ na matriz mitocondrial é um processo dependente de energia. Tanto através do ATP (através da actividade reversa da ATPase) ou da cadeia respiratória (através do bombeamento de H+), ambos contribuem para a captação de Ca2+ mitocondrial, porque ambos podem gerar um potencial de membrana (negativo no interior). Isto ocorre através da membrana mitocondrial interna que conduz o influxo de Ca2+ contra gradiente electroquímico (Drago et al., 2007).

A membrana interna poderá exercer algum controlo sob a permeabilidade da membrana externa. A abertura do poro da MPT permite um influxo de iões e outras moléculas para a matriz mitocondrial e iria causar swelling desta, induzindo assim a ruptura da membrana externa mitocondrial e consequentemente a sua permeabilização. A abertura do poro da MPT poderá estar directamente relacionada com o aumento da produção de ROS (Chipuk et al., 2006), que por sua vez poderão estar associados á acumulação de Ca2+ na matriz mitocondrial. O Ca2+ interage com os constituintes da MPT, induzindo assim a sua abertura (Gupta et al., 2009; Brookes et al., 2004). Para que haja a libertação do citocromo c tem de ocorrer a permeabilização da membrana externa mitocondrial e consequentemente libertação de conteúdo citosólico que antes estaria compreendido entre ambas as membranas mitocondriais, externa e interna (Chipuk et al., 2006). Quando isto acontece é sinal de que a via apoptótica foi activada e não há como retroceder este efeito na célula (Chipuk et al., 2006; Gupta et al., 2009). Estudos anteriormente feitos sugerem que o geraniol activa as vias da apoptose intrínseca (Kim et al., 2011), estando isto de acordo com a sugestão feita para a forma de actuação do geraniol na concentração 100 µM.

Tratamentos com concentrações 25 µM e 50 µM de geraniol, mantem o conteúdo citocromo c mitocondrial. A concentração de 100 µM induz a abertura da

MPT, sendo concordante com o ligeiro decréscimo da quantidade de citocromo c comparativamente com a condição controlo.

A mitocôndria é a responsável pela maior parte da produção endógena de ROS (Câmara and Guerra, 2008), o que poderá ser resultado de uma disfunção na cadeia respiratória mitocondrial e consequente fosforilação oxidativa (Distelmaier et al., 2011). Quanto á produção de ROS no caso do geraniol, os valores obtidos são estatisticamente significativos após a adição da 0,5 µM AA na concentração 25µM quando comparada com a concentração 100 µM, e esta ultima quando comparada com o controlo. No primeiro gráfico, os valores aumentam directamente com a concentração, sendo que apenas a concentração mais elevada possui um valor mais elevado quando comparado com o controlo. Após a adição de AA, é notório que a produção de ROS aumentou com a concentração do composto, isto poderá estar relacionado com o modo de acção do composto na membrana. Como possui lipofílicidade, pode actuar como permeabilizante na membrana interna e assim aumentar o leak de protões, aumentando assim a produção de ROS.

Quanto a SFR todos os valores obtidos são estatisticamente significativos quando comparados com o controlo. Há uma visível diminuição dos valores com o aumento da concentração usada, o que se traduz numa diminuição da viabilidade celular, tal como da sua proliferação. A SFR possui dois grupos sulfónicos capazes de se ligar aos aminoácidos das proteínas das células viáveis fixadas na placa pelo TCA. Como a SFR é usada como um indicador quantitativo do conteúdo proteico da cultura celular, podemos dizer que quando comparados com o controlo todas as concentrações usadas do geraniol promoveram uma diminuição do número de células que resultou numa diminuição colorimétrica visível. Esta diminuição da coloração foi proporcional á quantidade de corante incorporado pela cultura celular. Assim, podemos sugerir que nas concentrações usadas o geraniol apresentou actividade citotóxica, podendo ter provocado morte celular, dado o ciclo reprodutivo da cultura usada ser de 30 horas (Aston et al., 2000) e os tratamentos efectuados de 24 horas, sendo esta maior quanto mais elevada a concentração usada.

Tal como já se tinha referido anteriormente, o geraniol possui actividade antimicrobiana, anticancerígena (Menezes et al., 2012), antioxidante, anti peroxidação lipídica e anti-inflamatórias (Vinothkumar et al., 2012). Possui também, tanto in vitro como in vivo, actividade anti tumoral contra vários tipos de cancro (Vinothkumar et al.,

actuando na fase G0/G1 do ciclo celular em células de adenocarcinoma do pâncreas humano (Wiseman et al., 2007), que inibiu a proliferação celular anormal na indução de carcinogénese cutânea (Manoharan and Selvan, 2012) e que actua como indutor da apoptose (Cardozo et al., 2011). Na cultura celular PC-3 o geraniol inibiu a sua proliferação celular, sendo que quanto maior a concentração usada, maior a inibição (Kim et al., 2011). Assim, com base nos resultados e estudos apresentados, e sem esquecer o modo de acção dos monoterpenos na membrana celular, que podem provocar lise celular (Abdelgaleil et al., 2009; Turina et al., 2006), podemos sugerir que o geraniol poderá actuar como um agente inibidor da proliferação celular, porém, como os tratamento efectuados só foram de 24 horas, neste caso o geraniol poderá ter provocado morte celular.

Relativamente ao MTT, todos os valores obtidos são estatisticamente significativos quando comparados com o controlo. Isto significa que nestas concentrações o geraniol apresenta toxicidade para a cultura celular, diminuindo assim a actividade das desidrogenases mitocondriais e consequentemente a viabilidade celular. É notória a diminuição da actividade das desidrogenases mitocondriais consoante o aumento da concentração usada. Porém, é de frisar que na célula não há apenas desidrogenases na mitocôndria, logo este ensaio só por si só não pode ser usado como conclusivo.

O H2O2 faz parte dos ROS e é o que possui maior tempo de meia vida (t1/2 =

10-5 s), sendo deste modo a espécie mais abundante nas células (Evans and Halliwell, 1999). Como esta espécie não possui carga, é relativamente estável e tem a capacidade de percorrer distâncias consideráveis e de se difundir entre as membranas (Antunes and Cadenas, 2000). A sua eliminação é feita através dos mecanismos de defesa antioxidantes celulares, sendo a catalase e a glutationa peroxidase os principais responsáveis pelo consumo do H2O2 (Evans and Halliwell, 1999). O H2O2 actua

essencialmente nas cisteínas (aminoácidos) das proteínas (Kim et al., 2000). Assim, com o objectivo de verificar o possível efeito antioxidante do geraniol (Singh et al., 2012), as células foram incubadas com H2O2 induzindo stress oxidativo. As três

concentrações de geraniol usadas provocaram um aumento estatisticamente significativo na produção de ROS quando comparadas com o controlo. Estes valores indicam-nos que nestas concentrações o geraniol não possui actividade antioxidante, não conseguindo contrariar a produção de ROS pelo H2O2.

Os resultados obtidos na incubação das mitocôndrias isoladas com o geraniol corroboram com os resultados obtidos na incubação da cultura celular com o mesmo composto, em ambas se viu o aumento da produção de ROS. Isto poderá querer dizer, que o composto actua na permeabilidade da membrana interna mitocondrial, aumentando-a, e assim aumenta também o leak de protões, e como principal consequência aumenta assim a produção de ROS. Isto poderá ser devido á lipofílicidade do composto.

4.3 Mirtenol

Relativamente ao potencial transmembranar os resultados demonstraram que apenas a concentração de 50 µM é estatisticamente significativa quando comparada com o controlo na repolarização, aparecendo ligeiramente diminuída. Isto poderá significar que a fosforilação oxidativa se encontra comprometida. A recuperação do valor inicial do potencial inicial após a despolarização com ADP (repolarização) ocorre quando o ciclo fosforilativo é completado e este está ligeiramente afectado na concentração acima referida. Estudos feitos, associam a despolarização mitocondrial e a perda de potencial electroquímico com a apoptose e a consequente morte celular (Matsuyama and Reed, 2000).

Relativamente á respiração mitocondrial, o estado 3 respiratório não apresentou valores estatisticamente significativos. Porém revelou-se aumentado quando comparado com o controlo. O estado 4 aparece sempre aumentado em relação ao controlo, sendo que apenas é estatisticamente significativo na concentração de 50 e 100 µM. Isto poderá significar que em ambos os estados a velocidade consumida de oxigénio aumentou, tanto na presença de ADP como em condições não fosforilativas. Os valores do ICR são ligeiramente inferiores nas concentrações de 50 µM e 100 µM quando comparados com o controlo, excluindo a concentração 25 µM que se encontra ligeiramente aumentado, mesmo não sendo estatisticamente significativo. O acoplamento entre a utilização de oxigénio pela cadeia respiratória ao nível do citocromo c oxidase e o ADP fosforilado pela ATPsintase, foi determinado calculando o quociente ADP/O. Nenhuma das concentrações induziram alterações estatisticamente significativas no valor do ADP/O, porém é de notar que todas as concentrações quando comparadas com o controlo apresentam valores menores. Sob condições não fosforilativas, isto é, na presença de

oligomicina, inibidor do complexo ATP sintase, o único valor estatisticamente significativo ocorre na concentração mais elevada, porém em todos os valores a