Potencial transmembranar mitocondrial - Avaliação da função mitocondrial como consequência da e

3.1 Mitocôndrias

3.1.1 Potencial transmembranar mitocondrial

Após a energização das mitocôndrias com succinato, procedeu-se a uma incubação durante três minutos com o composto. No final, obteve-se um registo semelhante (sendo este meramente exemplificativo) do potencial transmembranar (Figura 12), que foi determinado recorrendo a um eléctrodo de TPP+ (Capitulo 2- Materiais e métodos).

Figura 12- Registo tipo de um potencial transmembranar mitocondrial.

Com a finalidade de estudar as alterações no metabolismo energético mitocondrial foram analisadas as flutuações do ΔΨ associadas à respiração e ao ciclo fosforilativo em mitocôndrias isoladas do fígado de rato,na presença de concentrações definidas dos compostos a testar. Os compostos usados foram o fitol, geraniol e

mirtenol e como controlo foi usado o DMSO, solvente este utilizado para preparar as soluções de trabalho dos três álcoois.

Tabela 6- Potencial transmembranar das mitocôndrias incubadas na presença de diferentes concentrações

de fitol. DMSO 25 µM 50 µM 100 µM 250 µM Potencial Inicial 100 99,3 ±0,5 99,4 ± 0,5 99,2 ± 0,4 99,7 ± 0,5 Despolarização 100 100,6 ± 1,9 103,8 ± 3,7 99,8 ± 4,6 96,0 ± 6,0 Repolarização 100 98,7 ± 0,6 98,1 ± 0,6 97,9 ± 0,5 99,3 ± 0,4 Lag Phase 100 108,5 ± 5,1 107,9 ± 5,2 104,8 ± 4,6 103,9 ± 7,5 Nota: Os dados são apresentados como as médias ± SEM (n=9) e em percentagem de controlo. O controlo corresponde a uma média de 208,6 mV no potencial inicial, a 23,4 mV na despolarização, a 207,8 mV na repolarização e a 117,6 segundos na lag phase. Considere-se o potencial inicial após a energização das mitocôndrias com succinato e depois da incubação com o composto durante 3 minutos. O potencial transmembranar foi determinado recorrendo a um eléctrodo de TPP+_{, como}

descrito no Capítulo II – Matériais e Métodos. Os ensaios foram realizados a 25°C em 1,4 mL de meio contendo sacarose 130 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, KH2PO4 5 mM, EDTA 50 μM e HEPES 5 mM, pH 7,4, suplementado com 3 μM TPP+ e

rotenona 3 μM. As mitocôndrias (1 mg) foram energizadas com succinato 5 mM e a fosforilação induzida com a adição de100 nmol de ADP. Valores estatisticamente não significativos.

No caso do fitol (Tabela 6), os resultados demonstram que as variações no potencial inicial, na despolarização, na repolarização e na lag phase desenvolvidos para as quatro concentrações testadas não são significativas. Mesmo sem significado estatístico, é de salientar o ligeiro aumento da lag phase, tempo necessário para a recuperação do potencial inicial depois da adição do ADP, em todas as concentrações usadas quando comparadas com o controlo.

Tabela 7- Potencial transmembranar das mitocôndrias incubadas na presença de diferentes concentrações

de geraniol. DMSO 25 µM 50 µM 100 µM Potencial Inicial 100 99,4 ± 0,4 98,3 ± 0,2* 98,2 ± 0,1* Despolarização 100 94,9 ± 2,8 94,6 ± 4,2 96,8 ± 3,9 Repolarização 100 99,4 ± 0,5 97,8 ± 0,2* 97,8 ± 0,4* Lag Phase 100 98,5 ± 4,6 95,5 ± 5,1 92,9 ± 2,8

o composto durante 3 minutos. O potencial transmembranar foi determinado recorrendo a um eléctrodo de TPP+_{, como}

rotenona 3 μM. As mitocôndrias (1 mg) foram energizadas com succinato 5 mM e a fosforilação induzida com 100 nmol de ADP. Valores estatisticamente significativos: * p<0,05 comparado com o grupo controlo.

Os resultados demonstram que o potencial inicial desenvolvido é significativamente menor quando as mitocôndrias são incubadas com 50 µM e 100 µM de geraniol. A recuperação do valor inicial do potencial inicial (repolarização) ocorre quando o ciclo fosforilativo é completado e está afectado aquando a adição de geraniol 50 µM e 100 µM (Tabela 7).

Tabela 8 - Potencial transmembranar das mitocôndrias incubadas na presença de diferentes

concentrações de mirtenol. DMSO 25 µM 50 µM 100 µM Potencial Inicial 100 99,3 ± 0,5 98,2 ± 0,6 99,3 ± 1,3 Despolarização 100 98,4 ± 2,9 97,5 ± 4,4 93,9 ± 2,9 Repolarização 100 98,5 ± 0,5 97,0 ± 0,7* 97,9 ± 0,8 Lag Phase 100 96,7 ± 4,0 96,2 ± 4,7 95,9 ± 3,2 Nota: Os dados são apresentados como as médias ± SEM (n=7) e em percentagem de controlo. O controlo corresponde a uma média de 205,4 mV no potencial inicial, a 24,7 mV na despolarização, a 204,8 mV na repolarização e a 122,6 segundos na lag phase. Considere-se o potencial inicial após a energização das mitocôndrias com succinato e depois da incubação com o composto durante 3 minutos. O potencial transmembranar foi determinado recorrendo a um eléctrodo de TPP+_{, como}

No caso do mirtenol (Tabela 8), a concentração de 50 µM induz uma diminuição na repolarização relativamente ao controlo sendo esta diferença estatisticamente significativa. Podemos dizer que nesta concentração o mirtenol tem efeitos sob a repolarização mitocondrial.

3.1.2 Medição do consumo de oxigénio pelas mitocôndrias

As possíveis alterações causadas pela acção dos compostos na cadeia respiratória e no sistema fosforilativo foram avaliadas determinando a respiração

mitocondrial no estado 3 e no estado 4, o ICR e o acoplamento da fosforilação oxidativa (ADP/O). Foi também avaliada a respiração mitocondrial em condições não fosforilativas, isto é, na presença de oligomicina, um inibidor específico da ATPsintase e recorreu-se ao desacoplador FCCP como estimulador da respiração mitocondrial em condições não fosforilativas. Esta capacidade respiratória foi avaliada na presença do succinato como substrato respiratório. Os compostos usados foram o fitol, geraniol e mirtenol e como controlo foi usado o DMSO.

Tabela 9- Efeito do fitol nos vários parâmetros respiratórios mitocondriais.

DMSO 25 µM 50 µM 100 µM 250 µM Estado 3 100 89,8 ±6,1 99,8 ± 5,6 99,6 ± 5,6 104,6 ± 6,6 Estado 4 100 113,2 ± 9,4 119,7 ± 7,1 131,5 ± 5,9 * 126,8 ± 13,1 V Oligomicina 100 84,4 ± 9,8 101,6 ± 9,0 118,9 ± 5,2 _# 105,1 ± 9,01 V FCCP ₁₀₀ _{96,5 ± 3,9} _{99,2 ± 3,6} _{97,7 ± 3,2} _{101,9 ± 7,5} ICR 4,1 ± 0,3 3,3 ± 0,3 3,4 ± 0,3 3,0 ± 0,3 3,6 ± 0,7 ADP/O 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,1 1,2 ± 0,1 1,3 ± 0,1 0,9 ± 0,1

Nota: Os dados são apresentados como as médias ± SEM (n=9) e em percentagem de controlo (Estado 3 e 4, V oligomicina e V FCCP) para mitocôndrias hepáticas isoladas de rato incubadas durante 3 minutos na presença de diferentes concentrações do

fitol e respectivos controlos.Os valores de percentagem de controlo correspondem a uma média de 135,6 mV no estado 3, a 34,1 mV no estado 4, 25,8 mV na V oligomicina e a 252,1 mV na V FCCP.O consumo de oxigénio foi determinado

polarograficamente como descrito no Capítulo II – Matériais e Métodos. Os ensaios foram realizados a 25°C em 1,4 mL de meio contendo sacarose 130 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, KH2PO4 5 mM, EDTA 50 μM e HEPES 5 mM, pH 7,4,

suplementado com rotenona 3 μM. As mitocôndrias (1 mg) foram energizadas com succinato 5 mM. O estado 3 respiratório foi induzido com 200 nmol de ADP. Valores estatisticamente significativos: * p<0,05 comparado com o grupo controlo e # p<0,05 comparado com o grupo 25 µM.

Relativamente ao fitol (Tabela 9), o estado 3 respiratório não apresentou valores estatisticamente significativos. O estado 4 aparece sempre aumentado em relação ao controlo, sendo que este aumento apenas é estatisticamente significativo na concentração de 100 µM. Assim, os valores do ICR foram inferiores em todas as concentrações quando comparados com o controlo, mesmo não sendo estatisticamente significativos. O acoplamento entre a utilização de oxigénio pela cadeia respiratória, ao nível da citocromo c oxidase, e o ADP fosforilado pela ATPsintase, foi determinado calculando o quociente ADP/O. Nenhuma das concentrações induziu alterações

estatisticamente significativas no valor do ADP/O. Porém, apenas a concentração mais elevada apresenta valores diminuídos quando comparado com os valores do controlo.

Foi também avaliada a respiração mitocondrial em condições não fosforilativas, isto é, na presença de oligomicina. Os valores obtidos não são estatisticamente significativos, sendo apenas de frisar que na concentração de 100 µM se encontram ligeiramente aumentados. Quando se procedeu à estimulação da respiração mitocondrial em condições não fosforilativa, com o desacoplador FCCP, não se observaram diferenças estatisticamente significativas nas mitocôndrias incubadas com os compostos quando comparadas com o grupo controlo. O FCCP é um protonóforo que permeabiliza a membrana mitocondrial a protões, estimulando desta forma a cadeia respiratória a taxas máximas de consumo de oxigénio.

Tabela 10- Efeito do Geraniol nos vários parâmetros respiratórios mitocondriais.

Ct (DMSO) 25 µM 50 µM 100 µM Estado 3 100 109,3 ± 4,9 112,6 ± 8,7 107,8 ± 5,7 Estado 4 100 109,4 ± 4,9 124,8 ± 14,1 137,8 ± 8,4 V Oligomicina ₁₀₀ _{111,9 ± 7,1} _{146,1 ± 17,8} _{128,8 ± 8,8} V FCCP 100 97,6 ± 2,8 97,4 ± 4,9 101,2 ± 5,6 ICR 3,8 ± 0,3 3,5 ± 0,4 3,6 ± 0,4 3,2 ± 0,2 ADP/O 1,2 ± 0,2 1,0 ± 0,1 1,1 ± 0,1 1,1 ± 0,1 Nota: Os dados são apresentados como as médias ± SEM (n=6) e em percentagem de controlo (Estado 3 e 4, V oligomicina e V FCCP) para mitocôndrias hepáticas isoladas de rato incubadas durante três minutos na presença de diferentes concentrações

do geraniol e respectivos controlos.Os valores de percentagem do controlo correspondem a uma média de 146,9 mV no estado 3, a 38,4 mV no estado 4, 28,9 mV na V oligomicina e a 272,6 mV na V FCCP. O consumo de oxigénio foi determinado polarograficamente como descrito no Capítulo II – Matériais e Métodos. Os ensaios foram realizados a 25°C em 1,4 mL de meio contendo sacarose 130 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, KH2PO4 5 mM, EDTA 50 μM e HEPES 5 mM,

pH 7,4, suplementado com rotenona 3 μM. As mitocôndrias (1 mg) foram energizadas com succinato 5 mM. O estado 3 respiratório foi induzido com 200 nmol de ADP. Valores estatisticamente não significativos.

No caso do geraniol (Tabela10), nenhum dos estados respiratórios mitocondriais apresenta valores estatisticamente significativos, tal como o ICR e o ADP/O. Porém é de salientar que o estado 4 se encontra aumentado em todas as concentrações quando comparado com o controlo.

Os valores do ICR são ligeiramente inferiores em todas as concentrações quando comparados com o controlo, principalmente na concentração mais elevada utilizada, mesmo não sendo estatisticamente significativos. O acoplamento entre a utilização de

oxigénio pela cadeia respiratória ao nível da citocromo c oxidase e o ADP fosforilado pela ATPsintase, foi determinado calculando o quociente ADP/O. Nenhuma das concentrações induziu alterações estatisticamente significativas no valor do ADP/O. Na presença da oligomicina note-se que todos os valores se encontram aumentados quando comparados com o controlo, principalmente na concentração 50 µM. Quando se procedeu à estimulação da respiração mitocondrial em condições não fosforilativas com o desacoplador FCCP não se observaram diferenças estatisticamente significativas nas mitocôndrias incubadas com os compostos quando comparadas com o grupo controlo.

Tabela 11- Efeito do mirtenol nos vários parâmetros respiratórios mitocondriais.

Ct (DMSO) 25 µM 50 µM 100 µM Estado 3 100 121,9 ± 5,6 115,0 ± 7,5 123,6 ± 7,3 Estado 4 100 115,8 ± 12,0 140,1 ± 10,1 * 146,2 ± 3,2 * V Oligomicina ₁₀₀ _{137,9 ± 13,2} _{152,5 ± 15,0} _{159,1 ± 6,3 *} V FCCP 100 98,2 ± 2,6 94,9 ± 4,8 103,3 ± 5,1 ICR 4,0 ± 0,3 4,3 ± 0,4 3,5 ± 0,4 3,3 ± 0,2 ADP/O 1,3 ± 0,1 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1 Nota: Os dados são apresentados como as médias ± SEM (n=6) e em percentagem de controlo (Estado 3 e 4, V oligomicina e V FCCP) para mitocôndrias hepáticas isoladas de rato incubadas durante três minutos na presença de diferentes concentrações

do mirtenol e respectivos controlos. Os valores da percentagem do controlo correspondem a uma média de 118,6 mV no estado 3, a 31,9 mV no estado 4, 26,6 mV na V oligomicina e a 237,1 mV na V FCCP. O consumo de oxigénio foi determinado

Relativamente ao mirtenol (Tabela 11), o estado 3 respiratório não apresentou valores estatisticamente significativos. Porém este revelou-se ligeiramente aumentado quando comparado com o controlo. O estado 4 aparece sempre aumentado em relação ao controlo, sendo que este aumento apenas é estatisticamente significativo nas concentrações de 50 e 100 µM.

O ICR apresenta-se ligeiramente inferior em todas nas concentrações mais elevadas (50 e 100 µM) quando comparados com o controlo, mesmo não sendo estatisticamente significativos. O acoplamento entre a utilização de oxigénio pela cadeia

determinado calculando o quociente ADP/O. Nenhuma das concentrações induziu alterações estatisticamente significativas no valor do ADP/O, porém é de notar que todas as concentrações quando comparadas com o controlo apresentam valores menores.

Sob condições não fosforilativas, isto é, na presença de oligomicina, o único valor estatisticamente diferente ocorre na concentração mais elevada, porém em todos os valores a respiração mitocondrial não fosforilativa encontra-se visivelmente aumentada. Quando se procedeu à estimulação da respiração mitocondrial em condições não fosforilativas, com o desacoplador FCCP, não se observaram diferenças estatisticamente significativas nas mitocôndrias incubadas com os compostos quando comparadas com o grupo controlo.

3.1.3 Detecção da indução da permeabilidade transitória mitocondrial (MPT)

A susceptibilidade de mitocôndrias hepáticas à indução da MPT foi avaliada determinando o intumescimento mitocondrial induzido pela acumulação de cálcio nas mitocôndrias. As mitocôndrias possuem uma capacidade finita para acumularem cálcio antes de ocorrer a indução do poro de permeabilidade transitória (MPTP). A pré- incubação com CyA, um inibidor específico do MPTP, capacitou essas mitocôndrias para acumular e reter o cálcio adicionado, indicando que o intumescimento mitocondrial era o resultado da indução de MPT (esta incubação foi feita nos três ensaios realizados com cada um dos diferente compostos, fitol, geraniol e mirtenol).

Figura 13- Susceptibilidade à indução da MPT nas mitocôndrias incubadas, durante três minutos, com as

diferentes concentrações de fitol, com DMSO e com CyA.

A indução da MPT foi avaliada espectrofotometricamente por monitorização do intumescimento mitocondrial. Os ensaios foram realizados a 25°C em 2 mL de meio contendo sacarose 200 mM, KH2PO4

1 mM, EGTA 10 μM e Tris-MOPS 10 mM, pH 7,4, suplementado com rotenona 2 μM, succinato 5 mM e 1 mg de proteína mitocondrial. Após um período inicial de monitorização do ensaio, foram adicionadas 20 nmoles de Ca2+ a todas as cuvetes, com excepção da que foi incubada com DMSO apenas. No ensaio com CyA, as mitocôndrias foram incubadas com CyA (1 μM) antes da adição de cálcio.

Quando incubadas com o fitol (Figura 13) (a diferentes concentrações e durante 3 minutos), e depois da adição de 20 nmoles de Ca2+, as mitocôndrias isoladas do fígado de rato revelaram ter uma maior resistência à indução de MPT, relativamente às mitocôndrias que foram incubadas com DMSO (que funciona como controlo). Os resultados mostram ainda que quanto mais elevada a concentração de fitol usada, maior é o efeito protector, tal como se pode observar nas concentrações 100µM e 250µM.

Figura 14- Susceptibilidade à indução da MPT nas mitocôndrias incubadas, durante 3 minutos, com as

diferentes concentrações de geraniol, com DMSO e com CyA.

A indução da MPT foi avaliada espectrofotometricamente por monitorização do intumescimento mitocondrial. Os ensaios foram realizados a 25°C em 2 mL de meio contendo sacarose 200 mM, KH2PO4

1 mM, EGTA 10 μM e Tris-MOPS 10 mM, pH 7,4, suplementado com rotenona 2 μM, succinato 5 mM e 1 mg de proteína mitocondrial. Após um período inicial de monitorização do ensaio, foram adicionadas 20 nmols de Ca2+ a todas as cuvetes, com excepção da que foi incubada com DMSO apenas. No ensaio com CyA, as mitocôndrias foram incubadas com CyA (1 μM) antes da adição de cálcio.

Quando incubadas com o geraniol (Figura 14) (a diferentes concentrações e durante três minutos) e depois da adição de 20 nmoles de Ca2+, as mitocôndrias isoladas do fígado de rato revelaram que este poderá actuar como indutor da MPT, sendo este efeito mais evidente na concentração de 100 µM. Porém, quando comparadas com o controlo (DMSO), podemos sugerir que a concentração 25 µM poderá exercer um efeito protector na MPT, enquanto que a concentração 50 µM se assemelha ao controlo.

Figura 15- Susceptibilidade à indução da MPT nas mitocôndrias incubadas, durante 3 minutos, com as

diferentes concentrações de mirtenol, com DMSO e com CyA.

A indução da MPT foi avaliada espectrofotometricamente por monitorização do intumescimento mitocondrial. Os ensaios foram realizados a 25°C em 2 mL de meio contendo sacarose 200 mM, KH2PO4

1 mM, EGTA 10 μM e Tris-MOPS 10 mM, pH 7,4, suplementado com rotenona 2 μM, succinato 5 mM e 1 mg de proteína mitocondrial. Após um período inicial de monitorização do ensaio, foram adicionadas 20 nmols de Ca2+ a todas as cuvetes, com excepção da que foi incubada com DMSO apenas. No ensaio com CyA, as mitocôndrias foram incubadas com CyA (1 μM) antes da adição de cálcio.

Quando incubadas com o mirtenol (Figura 15) (a diferentes concentrações e durante 3 minutos) e depois da adição de 20 nmoles de Ca2+, as mitocôndrias isoladas do fígado de rato revelaram que este poderá actuar como indutor da MPT, sendo este efeito mais evidente na concentração de 100 µM, quando comparado com o controlo. Quando comparamos as concentrações usadas com o controlo (DMSO), podemos ver que, excluindo a concentração mais elevada (que induz a MPT), as outras duas têm um efeito semelhante ao do DMSO.

3.1.4 Determinação de fluxos mitocondriais de Ca2+ utilizando a sonda de

No documento Avaliação da função mitocondrial como consequência da exposição a compostos naturais com potencial terapêutico (páginas 79-88)