Os processos de morte celular podem ser classificados de acordo com suas características morfológicas e bioquímicas em apoptose, autofagia, necrose, e senescência (Grivicich et al., 2007).
A necrose ocorre com a lise da membrana plasmática e provoca uma resposta inflamatória afectando as restantes células circulantes, enquanto que a apoptose ou morte celular programada está associada a uma série de alterações morfológicas no citoplasma e no núcleo, levando à inactivação e fragmentação da célula, sem que haja libertação do conteúdo tóxico para o meio extracelular e sem causar dano tecidual. Os
fragmentos celulares resultantes deste processo são fagocitados por macrófagos sem risco de dano ou toxicidade para as restantes células do tecido. A disfunção mitocondrial pode estar envolvida em ambas as vias (Figura 6) (Nicholls and Fergunson, 2002).
Figura 6- Esquema representativo da mitocôndria na regulação do processo de morte celular.
Pode ocorrer por necrose ou através da activação da via apoptótica intrínseca, com a libertação do citocromo c. A indução da MPT provoca a libertação de factores apoptóticos como o citocromo c. A libertação do citocromo c pode também ocorrer através de canais formados pela Bax, uma proteína pró- apoptótica da família Bcl-2. A depleção de ATP pode bloquear a activação das caspases, desviando-se o processo de morte celular de apoptose para necrose (Varela et al., 2011).
Autofagia ocorre em resposta a um stresse metabólico que resulta na degradação de componentes celulares. Durante este processo, porções do citoplasma são encapsuladas, originando autofagossomas, que depois de se fundirem com lisossomas serão degradados pelas hidrolases lisossomais. A senescência é um processo metabólico activo essencial para o envelhecimento. Ocorre através de uma programação genética que envolve deterioração dos telómeros e activação de genes supressores tumorais. As células que entram em senescência perdem a capacidade proliferativa após um determinado número de divisões celulares (Grivicich et al., 2007).
1.2.12 Necrose
A necrose é na maioria das vezes a consequência da perturbação metabólica aguda com depleção de ATP. A fase inicial da morte celular por necrose é caracterizada pela perda da integridade da membrana plasmática, que é normalmente antecipada pela despolarização mitocondrial, desagregação lisossomal e edema celular. A necrose é um tipo de morte celular morfológica e bioquimicamente distinta da apoptose, em que a injúria à célula provoca aumento de volume, agregação de cromatina, desorganização do citoplasma e perda da integridade da membrana plasmática com ruptura celular e consequente presença de actividade inflamatória. Com o extravasamento do conteúdo citoplasmático, ocorre danificação das células vizinhas e reacção inflamatória local (Ferreira et al., 2010; Grivicich et al., 2007).
1.2.13 Apoptose
Uma das principais funções da mitocôndria, tal como já foi dito, é modular a morte celular programada/apoptose (Monteiro et al., 2003). A mitocôndria é a reguladora central das vias apoptóticas (Câmara and Guerra, 2008; Scheffler, 2008).A apoptose é um mecanismo necessário ao longo da vida celular, com a finalidade de suprimir células inactivas ou danificadas (Ferreira et al., 2010; Monteiro et al., 2003; Zimmermann et al., 2001), com o intuito de manter a homeostasia celular (Scheffler, 2008; Zimmermann et al., 2001). É essencial na proliferação e na diferenciação, bem como na sobrevivência de células em processos de organogénese, hematopoiese, reposição tecidual, atrofia de órgãos e metamorfose, resposta inflamatória, eliminação de células após dano por agentes genotóxicos (Ferreira et al., 2010) ou apenas pelo simples envelhecimento (Scheffler, 2008).
A apoptose é antecedida por alterações nas membranas mitocondriais, levando à perda do normal gradiente electroquímico, desenvolvimento do fenómeno de transição de permeabilidade mitocondrial, produção de ROS e libertação de factores apoptóticos (como o citocromo c e o factor de indução da apoptose – AIF) para o citosol (Monteiro et al., 2003).
Existem diversas alterações morfológicas e bioquímicas que caracterizam a apoptose, tais como a redução do volume da célula sem vazamento do conteúdo celular
(Nicholls and Fergunson, 2002; Zimmermann et al., 2001), condensação da cromatina e fragmentação nuclear. A fragmentação da célula em corpos apoptóticos e respectiva fagocitose é uma característica da apoptose que visa a protecção das células circundantes (Scheffler, 2008; Ferreira et al., 2010; Zimmermann et al., 2001). A maquinaria da apoptose é composta por caspases (proteases que executam a morte celular), proteínas adaptadoras, proteínas da família Bcl-2 e inibidores de apoptose (IAPs).
A apoptose pode ser desencadeada por vários estímulos intra e/ou extracelulares. Os estímulos intracelulares (tais como, danos no ADN, elevados níveis de cálcio, proteínas intracelulares, ROS, privação de factores de crescimento e nutrientes) (Ferreira et al., 2010) resultam normalmente na permeabilização da membrana exterior mitocondrial e libertação de factores pró-apoptóticos (como o citocromo c, activador das caspases, a proteína SMAC/DIABLO, que agem em coordenação e se ligam directamente à IAP, e o AIF) a partir do espaço intermembranar para o citosol. Esta via intrínseca (ou mitocondrial) da apoptose, é iniciada pela activação das proteínas Bcl-2 pró-apoptóticas (Bid, Bim, Bad, PUMA, Noxa, Bax e Bak), e antagonizada pelos membros anti-apoptóticos da mesma família (Bcl-2, BclxL, Mcl-1). A proteína Bcl-2 regula a apoptose, localiza-se na mitocôndria, onde reduz tanto a morte celular por apoptose como por necrose causada por vários factores de stresse (Scheffler, 2008). Além de reduzir a libertação do citocromo c, reduz a taxa de consumo de ATP mitocondrial quando a hidrólise do ATP é estimulada (Ferreira et al., 2010).
O equilíbrio entre as proteínas Bcl-2 pro e anti-apoptóticas, é determinante para a resposta a estímulos apoptóticos. A libertação de citocromo c associado com as proteases apoptóticas e a hidrólise de ATP, activam o factor 1 (Apaf-1) para formar o apoptossoma, que converte a procaspase 9 em caspase 9 (Monteiro et al., 2003; Nicholls and Fergunson, 2002; Scheffler, 2008). As caspases (como a caspase -3, -8, -9, -12) são uma família de proteases de cisteína (Zimmermann et al., 2001). As caspases são expressas como pró-caspases quando inactivas e são activadas por uma regulada clivagem proteolítica de sequências inibitórias. A caspase -9 desencadeia a activação da caspase-3 e conduz às fases de execução e de degradação (Monteiro et al., 2003; Nicholls and Fergunson, 2002; Scheffler, 2008), resultando em alterações morfológicas associadas à apoptose (como o colapso nuclear e celular). As mitocôndrias desempenham um papel chave no processo de apoptose (Gross et al., 2004) e como a
apoptose é um processo dependente de energia, só pode ocorrer em células com reservas de ATP suficientes (Monteiro et al., 2003).
Os estímulos extracelulares através da ligação aos “receptores de morte”, tais como o factor de necrose tumoral-α (TNFα) e a proteína Fas, podem induzir apoptose. Isto conduz à activação da procaspase-8, que cliva e activa a procaspase-3 e inicia a cascata da caspases. Além disso, a caspase 8 pode envolver a via mitocondrial por clivagem da proteína Bid que pode provocar uma mudança conformacional na Bax, cujo fragmento se transloca para a membrana mitocondrial externa aumentando a sua permeabilidade (Nicholls and Fergunson, 2002).
A apoptose pode ser inibida através da activação de moléculas anti-apoptóticas, como a Bcl-2 (Monteiro et al., 2003; Ferreira et al., 2010) e a FLIP (Ferreira et al., 2010) as quais sofrem translocação para a membrana externa das mitocôndrias. Também aqui o papel das mitocôndrias volta a ser essencial (Monteiro et al., 2003).
Quando desregulada, a apoptose pode contribuir para o aparecimento de várias doenças neoplásicas, auto-imunes, neurodegenerativas e cardiovasculares (Zimmermann et al., 2001). Assim, a homeostase (equilíbrio estrutural e funcional essencial para sobrevivência de uma população celular) depende do balanço entre a activação de moléculas pró e anti-apoptóticas (Ferreira et al., 2010).
1.2.14 Necroapoptose
A necroapoptose é uma teoria proposta por Lemasters e refere-se a um processo que se inicia com o mesmo sinal de morte e termina em necrose ou apoptose, dependendo das condições celulares (declínio dos níveis de ATP celular ou o conteúdo lipídico). Foi proposto que um aumento abrupto da MPT causa a depleção do ATP, o bloqueio da activação das caspases e a ruptura da membrana plasmática, desviando a morte celular de apoptose para a necrose (Lemasters, 1999).
1.3 Compostos semi-sintéticos
A utilização de plantas medicinais remonta aos primórdios da civilização humana. Na pré-história o homem procurava aliviar as suas dores ou tratar as suas
óleos) e de forma empírica ou intuitiva com descobertas feitas completamente ao acaso ( (Lameira and Pinto, 2008).
Desde a Idade Média que os óleos essenciais têm sido amplamente utilizados na medicina, como bactericidas, viricidas, parasiticidas, insecticidas, mas também a nível cosmético. Actualmente continuam a ser usados nas indústrias farmacêutica, higiene, cosmética, agrícola e alimentar, devido à actividade dos compostos que constituem o óleo essencial (Bakkali et al., 2008; Chowdhury and Ghosh, 2012). São misturas de monoterpenos, sesquiterpenos, alcalóides, flavonóides, isoflavonas e saponinas, mais conhecidos por fitoquímicos. São produzidos pelas plantas com o intuito de as protegerem contra doenças, infestações e de serem usadas por predadores (Chowdhury and Ghosh, 2012; Tiwari and Kakkar, 2009). São também misturas complexas de substâncias voláteis, lipofilicas, instáveis á temperatura ambiente e à luz, geralmente odoríferas e encontradas no estado liquido (Simões et al., 2001).
Em ensaios in vitro a maioria deles são caracterizados como antioxidantes. No entanto, trabalhos recentes mostram que, em células eucarióticas, os óleos essenciais podem actuar como pro-oxidantes afectando a membrana celular interna e organelos celulares como as mitocôndrias. Dependendo do tipo e da concentração, eles exibem efeitos citotóxicos em células vivas, mas geralmente não são genotóxicos. Estes resultados sugerem que, pelo menos em parte, os efeitos benéficos dos óleos essenciais encontrados são devido aos efeitos pró-oxidantes nas células (Bakkali et al., 2008; Chowdhury and Ghosh, 2012). Podem exercer actividade citotóxica nas células tumorais, tornando-os compostos quimioterapêuticos ou quimiopreventivos úteis (Chowdhury and Ghosh, 2012).
Os terpenóides são amplamente encontrados na natureza e constituem uma grande variedade de substâncias vegetais. São classificados de acordo com o número de carbonos, em que o geraniol e o mirtenol são monoterpenóides (a sua cadeia é constituída por 10 carbonos) e o fitol é um diterpenóide (a sua cadeia é constituída por 20 carbonos). Diferem dos terpenos por terem elementos adicionais (Bakkali et al., 2008), dado que podem ser descritos como terpenos modificados onde os grupos metilo são rearranjados ou removidos e onde são adicionado átomos de oxigénio oxidados (Sadtler, 1918). Os terpenos são considerados substâncias biodegradáveis, pois podem ser usados como substratos por microorganismos (via aeróbica ou anaeróbica), que os utilizam para produzir energia através da respiração celular (Harborne, 1996). São
usados no tratamento de várias doenças, como por exemplo na asma, no eczema, na artrite reumatóide e na fadiga crónica (Singh et al., 2012).
Os monoterpenos podem ser divididos em dois grandes grupos, os monoterpenos hidrocarbonados, constituído por os alifáticos acíclicos, os alifáticos monocíclicos e os alifáticos bicíclicos, e os monoterpenos oxigenados, constituído por monoterpenóides acíclicos, monoterpenóides bicíclicos e os monoterpenóides monocíclicos (Abdelgaleil et al., 2009). Dentro do último grupo, eles são ainda divididos em álcoois, aldeídos, cetonas e esteres (Mann, 1987; Abdelgaleil et al., 2009).
Os monoterpenos e os sesquiterpenos são os principais componentes dos óleos essenciais, enquanto os outros terpenos são componentes de bálsamos, resinas, ceras e borrachas (Harborne, 1996). Os monoterpenos são altamente hidrofóbicos e os seus efeitos biológicos estão relacionados com interacções a nível da membrana dos organismos, podendo provocar alterações na membrana e até mesmo lise celular (Turina et al., 2006). Inibem o desenvolvimento e o crescimento celular (Abdelgaleil et al., 2009). Outra das funções dos monoterpenos e dos seus derivados é o seu efeito sedativo, já comprovado nos animais. São também usados em aromoterapia (Sousa et al., 2007). São muito importantes na indústria alimentar, química e farmacêutica. Possuem propriedades insecticidas e herbicidas e estudos sugerem que poderão ser úteis como potenciais agentes no controlo de pragas. Estas actividades biológicas são devidas às suas propriedades físico-químicas, como por exemplo, lipofílicidade e baixa toxicidade para os mamíferos (Abdelgaleil et al., 2009).
Os diterpenos possuem actividades biológicas e ecológicas características e constituem protótipos na síntese de substâncias bioactivas (Santos et al., 2008). Têm sido descritos como tendo actividade antioxidante, anti carcinogénica, anti-inflamatória (Castro et al., 2001) e anti bactericida (Santos et al., 2008). Estimulam a formação de agentes desintoxicantes in vivo e podem apresentar actividade mutagénica (Nilssen and Forde, 1994), tal como efeitos quimioprotectores, principalmente na carcinogénese (Ferreira et al., 2009). Podem ser usados na indústria alimentar como aromatizantes, porém actuam como hipercolesterolémicos no seu estado puro (Hamel et al., 1979), tal como provocam um aumento dos níveis de triglicéridos (Roos et al., 2001). São utilizados na indústria de cosméticos, tanto pelo aroma como pelos benefícios que trazem para a pele (Alvarez and Rodriguez, 2000). Possuem capacidade de absorção da radiação solar (Grollier and Plessis, 1988), aumento da camada bilipídica da stratus
corneun, camada mais externa da pele, pelo aumento da diferenciação celular e da síntese de lípidos (Pelle, 1999).
A popularidade da medicina tradicional está em crescimento, tal como os medicamentos naturais que geralmente tem como base extractos de plantas. Um dos principais problemas destes medicamentos é a sua variada constituição, algumas vezes originária de uma mistura de centenas de compostos, que aumentam o nível de dificuldade na identificação do agente causador da toxicidade e do seu respectivo mecanismo de lesão (Casarett and Doul's, 2008).
O desenvolvimento e a introdução de novas substâncias mais seguras e eficazes é essencial para melhorar o tratamento em determinadas doenças que não respondem muito bem aos medicamentos convencionais. A busca por alternativas menos tóxicas e agressivas resultou na diminuição do uso de combinações de plantas medicinais, e os seus derivados, e levou á introdução de substâncias sintéticas, sintetizadas em laboratório com base nas naturais (Costa et al., 2012).
Actualmente, mais do que medicamentos para combater várias doenças, como o cancro, procuram-se substâncias que actuem na base da quimioprevenção. Esta é uma estratégia nova e atraente, que lida com a inibição, a reversão ou a supressão da carcinogénese através da utilização de substâncias naturais ou sintéticas, principalmente com poder antioxidante (Manoharan and Selvan, 2012).
1.3.1 Fitol
O fitol (Figura 7) é um diterpeno acíclico, quimicamente definido como 3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-en-1-ol, C20H40O (Costa et al., 2012; Brink et al., 2004;
Gloerich et al., 2007), com o seguinte peso molecular: 296.54 g/mol (McGinty et al., 2010). É um álcool insaturado com cadeia longa e ramificada (Costa et al., 2012). Está presente tanto na vitamina E como na vitamina K (Chowdhury and Ghosh, 2012).
É um composto aromático, com um cheiro característico, usado em muitas fragrâncias (Costa et al., 2012), e pode ser amplamente encontrado em peças decorativas perfumadas, cosméticos, perfumes, shampoo, géis de banho e cremes (McGinty et al., 2010).
O fitol é encontrado em grande escala na natureza por ser um constituinte da clorofila (Gloerich et al., 2007; Goto et al., 2005). Vários estudos mostraram que quantidades consideráveis de ácido fitânico, um ácido gordo que é metabolizado através do fitol, acumulado no fígado, rins, músculo e na urina são característicos de pacientes com a doença de Refsun, doença peroxisomal (Brink et al., 2004; Costa et al., 2012) e em outras doenças metabólicas (Gloerich et al., 2007; Brink and Wanders, 2006).
O fitol está presente em alguns alimentos que participam na nossa dieta alimentar diária (Gloerich et al., 2007). Há pouca informação sobre os níveis de fitol na carne e nos produtos lácteos provenientes de animais ruminantes, existem também alguns relatos de que também está presente em óleos vegetais e nozes (Brink et al., 2004; Mackie et al., 2009).
Tal como já foi referido anteriormente, o ácido fitânico é sintetizado apartir do fitol. O ácido fitânico está directamente ligado á activação dos receptores activados por proliferadores do peroxisoma γ (PPARγ) e o receptor retinóide X (RXR), que são estimulados a diferenciarem-se em adipócitos castanhos e brancos. Outra das funções do ácido fitânico é estimular o PPARα a activar o metabolismo lipídico em algumas células. Assim, o fitol poderá estar directamente ligado à regulação dos PPARs e consequentemente aos adipócitos e hepatócitos, devido principalmente á sua presença no fígado (Goto et al., 2005).
É um composto lipofílico e interage com as membranas celulares, tal como com outras substâncias ou metabolitos lipofílicos. Isto é uma vantagem que fez com que o fitol fosse usado com um adjuvante imunológico (substâncias que aumentam, estimulam, activam, potenciam ou modulam a resposta imunitária a nível celular ou humoral). Tal como a sua estrutura simples, o seu baixo custo e pelo facto de fazer parte da dieta alimentar. Porém, o fitol ao ser usado como adjuvante provocou uma serie de efeitos secundários nos ratos, tal como esplenomegalia e hepatotoxicidade. Substâncias sintetizadas directamente do fitol, como o fitanol-1 que foi obtido através de uma hidrogenação, provaram ser mais eficientes e menos tóxicas (Chowdhury and Ghosh,
O fitol pode ter um efeito calmante em caso de prurido na pele. Num estudo, após injecção intradermal de histamina nos ratos, levou ao desenvolvimento de uma resposta inflamatória com aumento da permeabilidade vascular e consequente desenvolvimento de prurido. O fitol actuou como anti histamina diminuindo a permeabilidade vascular. Inibiu também a expressão de TNF-α e IL-4 tal como a activação dos factores de transcrição NK-κB e c-jun, estimulados pelas histaminas (Ryu
et al., 2010a).
No entanto, os efeitos deste diterpeno ao nível do sistema nervoso central não foram ainda praticamente estudados (Costa et al., 2012).
Estudos demonstraram que o fitol actua como anticonvulsivo em estados epilépticos. A pré-administração de fitol levou a uma protecção dependente da dose administrada contra as convulsões induzidas por pilocarpina e estado epiléptico, levando assim a uma redução na taxa de mortalidade induzida pela pilocarpina. Este estudo demonstrou que o fitol poderá exercer um efeito neuro protector. Os derivados do fitol podem activar receptores hormonais nucleares que podem influenciar a expressão génica e a diferenciação celular. Estes efeitos farmacológicos atribuídos a fitol podem ser responsáveis por controlar a função neuronal, influenciando os sistemas de neurotransmissores e a modulação da libertação e/ou síntese de neurotransmissores inibitórios relacionados com o processo convulsivo. O fitol poderá interagir no mecanismo de acção de forma directa ou indirecta de neurotransmissores noradrenérgicos e glutamatérgicos. Surpreendentemente, os resultados demonstram que o fitol inibiu a acção da pilocarpina e protegeu os camundongos contra a morte induzida por crises convulsivas. Estas descobertas fazem do fitol um bom candidato a medicamento como neuro protector em crises convulsivas (Costa et al., 2012).
1.3.2 Geraniol
O geraniol (Figura 8) é um álcool monoterpeno acíclico quimicamente definido como 3, 7-dimetilocta-trans-2, 6-dien-1-ol, C10H18O (Menezes et al., 2012;
Vinothkumar et al., 2012). Não é solúvel em água e o seu peso molecular é 154.25 g/mol (Lapczynski et al., 2008).
É aceite como um composto seguro pelo FDA (US Food and Administration) (Menezes et al., 2012; Kim et al., 2011) e bastante usado como fragrância (Hagvall et
al., 2007). Pode ser obtido sinteticamente através de monoterpenos como o β-pineno e linalool.
Figura 8- Representação da estrutura química do geraniol (Hagvall et al., 2012).
Geralmente está presente em grandes quantidades e em várias plantas, como por exemplo, na rosa, na citronela e na palmarosa (Hagvall et al., 2007). É encontrado em bastantes óleos essenciais, como no óleo de gengibre, limão, lima, noz-moscada, lavanda, laranja, rosa, palmarosa, citronela, entre muitos (Vinothkumar et al., 2012), sendo o principal componente do óleo-de-rosa e do óleo de palmarosa (Tiwari and Kakkar, 2009; Hagvall et al., 2012).
Para ser usado com aromatizante foi avaliado pela “Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives” e dado como seguro nos níveis atuais de consumo. Nos EUA estima-se a ingestão diária seja de 5,2 µg/kg de peso corporal/dia, enquanto na Europa, estima-se a sua ingestão diária seja de 11µ/kg de peso corporal/dia (Tiwari and Kakkar, 2009).
É bastante importante como fragrância (Hagvall et al., 2007) e é muito usado em perfumes devido ao seu aroma floral e citral (Tiwari and Kakkar, 2009; Manoharan and Selvan, 2012).O seu sabor foi descrito como doce rosa floral, frutado, cítrico e com nuances de cera. E perceptível acima de 10 ppm (Chen and Viljoen, 2010).
Foi detectado em 76% dos desodorizantes investigados no mercado europeu e em 41% de produtos para o lar e uso doméstico. Está também presente em 33% dos produtos cosméticos à base de ingredientes naturais (Hagvall et al., 2007; Hagvall et al., 2012), como cremes, géis de banho e shampoo (Lapczynski et al., 2008).
É considerado um alergénico fraco e tal como os seus análogos (por exemplo o linolool), quando puro, pode auto oxidar-se quando exposto durante algum tempo à temperatura ambiente. Como principal consequência, poderá formar espécies reactivas
que por sua vez poderão causar dermatites e alergias. São necessários mais estudos para descobrir as espécies formadas e a forma como actuam (Hagvall et al., 2007).
Devido às suas propriedades bioquímicas e farmacológicas, é um possível composto a ser usado em vários medicamentos (Kim et al., 2011). Possui actividade antimicrobiana, anticancerígena (Menezes et al., 2012), antioxidante, anti peroxidação lipídica e anti-inflamatórias (Vinothkumar et al., 2012).
Tanto in vitro como in vivo, possui actividade anti tumoral contra a leucemia murina, hepatoma, melanoma (Menezes et al., 2012; Manoharan and Selvan, 2012), cancro da próstata (Kim et al., 2011), hapatocarcinogénese, cancro do colon, cancro oral (Vinothkumar et al., 2012) cancro mamário e previne o crescimento de adenocarcinomas pancreáticos (Cardozo et al., 2011; Ahmad et al., 2011).
Estudos demonstraram que o geraniol é um repelente de origem vegetal bastante eficaz (Menezes et al., 2012; Chen and Viljoen, 2010). Já está disponível para ser usado no controlo de pragas (Fulltec ®, Zug, Suíça), onde os resultados têm sido positivos. Mostrou ser eficaz contra as carraças (George et al., 2009), é usado também para proteger os seres humanos de picadas de mosquitos e da mosca de areia, seja em creme ou vela (Chen and Viljoen, 2010). Contra o verme Dermanyssus gallinae, o geraniol provou ser 100% eficaz na sua mortalidade em todas as doses usadas (foi usado nas concentrações de 0.5, 1 e 2 % durante 24 horas) (George et al., 2009).
Estudos realizados demonstraram que o geraniol poderá ter um potencial quimiopreventivo e apresentar um efeito protector sobre a integridade celular durante a indução de cancro bucal em hamsters com 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (DMBA), substância carcinogénica especifica e com propriedades imunossupressoras. Quando usado em doses de 250 mg/kg preveniu completamente a formação de tumores na mucosa da boca tratada com DMBA. A sua função anti tumoral baseia-se nas suas