Determinação estrutural

Espectros de RMN de saponinas triterpênicas

As saponinas que encontramos nas espécies de Ilex estudadas provém de agliconas triterpênicas derivadas dos ácidos oleanólico, ursólico e 19_α-hidroxiursólico, estando de acordo com outras saponinas encontradas nos gênero Ilex até então descritas na literatura (Schenkel et al. 1995). Assim, é possível apresentar algumas características principais dos espectros de RMN 1H para cada tipo de esqueleto.

Na região entre _δ 1,4 e 0,7, observam-se os sinais das metilas. Para as substâncias de esqueleto oleanano, observam-se 7 singletos. Os derivados de esqueleto ursano apresentam 5 singletos e 2 dubletos, estes últimos atribuídos às Me-29 e Me-30. As substâncias derivadas do esqueleto 19α-hidroxiursano, mostram 6 sinais singletos correspondendo a metila e um dubleto referente a Me-30.

No espectro RMN 1H, podemos observar sinais da aglicona na região entre δ 1,1 e 3,4 importantes para a elucidação estrutural. Quando a aglicona é um derivado de esqueleto oleanano, observa-se o sinal de H-18 em ~ δ 2,8, como um duplo dubleto com J = 4 e 12 Hz (muitas vezes observado como um dubleto largo), pois existe um acoplamento axial-axial e um acoplamento axial- equatorial entre os hidrogênios H-18, H-19a e H-19b (Rastrelli et al. 1996). Um sinal com essa feição

espectral evidentemente indica que a posição 19 está livre de substituintes.

Quando o esqueleto é ursano, o sinal de H-18 é observado como um dubleto entre δ 2,1-2,5. Estando H-18 na configuração α (axial), o sinal será um dubleto de J = 12 Hz; Caso H-18 esteja em β (equatorial), o dubleto será de J = 5 Hz (Sylverstein et al., 1991). Para os esqueletos 19_α-hidroxiursanos, H-18 absorve em aproximadamente _δ 2,6 como um singleto (Romussi et al. 1994).

Os deslocamentos químicos de H-3 podem indicar se a configuração na posição 3 é α ou β. Quando a hidroxila está na posição equatorial, H-3 absorve em δ 3,2 como um duplo dubleto de J = 5 e 11 Hz. No caso da hidroxila em axial, o sinal de H-3 absorve em ~ δ 3,4, também como um duplo dubleto, mas de J = 2,0 e 2,0 Hz (Rastrelli et al. 1996). Algumas vezes o sinal de H-3 fica sobreposto aos sinais dos açúcares, sendo difícil a distinção de sua multiplicidade e medida das constantes de acoplamento.

Nos espectros dos derivados com os esqueletos oleanano e ursano isolados, pode-se observar o sinal de H-12 olefínico em ~ δ 5.3 (Taketa et al. 2000).

Entre δ 3,0 e 4,2 absorvem os sinais do hidrogênios hidroximetínicos e hidroximetilênicos dos açúcares (Agrawal, 1992).

Os sinais dos hidrogênios anoméricos de unidades de açúcar ligados à posição 3 da aglicona aparecem entre δ 4,0 e 4,7, enquanto que os sinais dos hidrogênios anoméricos dos açúcares ligados à posição 28-COOH da aglicona absorvem entre δ 5,2 e 5,5 (Rastrelli et al. 1996). Os hidrogênios anoméricos com dubletos de constante de acoplamento variando entre 1-4 Hz podem ser atribuídos a hidrogênios α anoméricos, enquanto aqueles com constante de acoplamento entre 6-8 Hz a hidrogênios anoméricos de configuração β (Agrawal, 1992).

Esses aspectos gerais observados nos espectros RMN 1H direcionaram a determinação estrutural de cada umas das substâncias encontradas nos extratos estudados, conforme relatamos a seguir.

Como a variação nos espectros é muito pequena, para exemplificar o procedimento de identificação estrutural,vamos apresentar apenas os espectros de Ia1.

Ilex amara

Ia1

Pelo espectro de RMN 1H (Fig. 6.3) verificamos que se trata de uma saponina derivada do esqueleto ursano. Observamos H-18 em δ 2.26 (d, J = 9,5 Hz). Os sinais dos hidrogênios das metilas 29 e 30 absorvem em δ 0,92 (d, J = 6,6 Hz) e δ 1,00 (d, J = 10,0 Hz). Em δ 2,09 observa- se um singleto intenso, indicativo de uma metila de um grupo acetílico. O sinal de H-3 aparece como um duplo dubleto (J = 4,8 e 12 Hz) em δ 3,15, indicando configuração β da hidroxila.

Para a determinação dos açúcares, os hidrogênios anoméricos (δ 4,40, 4,45 e 5,38) foram irradiados em experimentos TOCSY-1D. No espectro obtido após a irradiação do hidrogênio anomérico em δ 4,40 (Fig.6.4a) observamos todos os sinais de uma unidade de glicose, podendo-se ver, inclusive, os sinais dos H-6a e H-6b. A constante de acoplamento J = 7,8 Hz do H-1(glu) indica

multipleto em δ 5,19 (H-2(ara)), um duplo dubleto em δ 3,83 (J = 10,2 e 3,6; H-3(ara)) e um singleto largo em δ 4,08 (H-4(ara)). A irradiação do sinal em δ 5,19 (Fig. 6.4c) mostra o mesmo conjunto de sinais observados anteriormente, caracterizando o mesmo sistema de spins. Irradiação do sinal em δ 4,08 (Fig. 6.4d) mostra, além dos sinais observados anteriormente, os sinais em δ 3,88 (d, J = 12,0 Hz) e δ 3,61 (d, J = 13,2 Hz) referentes a Ha-5(ara) e Hb-5(ara), respectivamente. Esses dados

observados são compatíveis com uma unidade de arabinose acetilada na posição 2. A configuração α da arabinose pôde ser deduzida a partir da constante de acoplamento J = 7,8 Hz de H-1(ara) (Agrawal, 1992).

Irradiação do hidrogênio anomérico em δ 5,37 (Fig. 6.4e) mostra os sinais de uma segunda unidade de β-D-glicose, desta vez esterificando a carboxila C-28.

O espectro COSY 1H-1H (Fig. 6.5) apresentou correlações que possibilitaram a confirmação das identidades dos açúcares. Além disso, análise do espectro confirmou que o sinal em δ 5,19 corresponde ao hidrogênio H-2 da unidade de arabinose, que deve estar acetilada, tendo em vista seu deslocamento para região diamagnética quando comparada com uma unidade normal de arabinose (Agrawal, 1992).

O espectros HMQC (Fig. 6.6) e espectro HMBC (Fig. 6.7) e suas ampliações forneceram os deslocamentos químicos de RMN 1H e RMN 13C. Pelo espectro HMBC observou-se importantes correlações para determinação das posições de ligação dos açúcares entre si e na aglicona. Observaram-se as correlações C-1(ara)-H-3 (δ 104,2-3,15), C-3(ara)-H-1(glu) (δ 81,2- 4,40), C-3-H-1(ara) (90,5-4,45) e C-28-H-1’(glu) (176,9-5,36), determinando-se assim que uma das unidades de glicose estava ligada à posição 28, que a unidade de arabinose estava ligada à aglicona e que a segunda unidade de glicose encontrava-se ligada à posição 3 da unidade de arabinose.

Pelo espectro HMBC não foi possível determinar o ponto de ligação do grupo acetílico observado no espectro RMN 1_{H. No entanto, conforme mencionado anteriormente,}

observou-se no conjunto de espectros de RMN 1_{H, no TOCSY-1D e no COSY} 1_H-1_{H que o sinal de}

H-2(ara) estava muito desprotegido com relação ao seu deslocamento químico usual - em torno de δ 3,90 (Agrawal, 1992), o que seria apenas explicado com a substituição do OH-2 pelo grupo acetílico.

O espectro ES-MS (100 V, modo negativo) indicou o pico do aduto com acetonitrila de m/z 994 [M-H+MeCN]- _{(20) e o pico do íon pseudo molecular de m/z 953 [M-H]- (2). Perda de}

uma unidade de glicose gerou o pico m/z 791 [M-H-glu]- (55) e, na seqüência, a perda de um grupo acetato m/z 749 [M-H-glu-OAc]- (100). Perda de outra unidade de glicose gerou o fragmento de m/z 587 [M-H-2glu-Ac]- (15). A perda de uma unidade de arabinose deveria produzir o íon de m/z 455

[M-H-2glu-Ac-ara]- _{= [A-H]-, mas este não foi observado no modo negativo. No modo positivo (100}

V) pôde-se observar no espectro os sinais do aduto com sódio de m/z 977 [M+Na]+ (30), a perda de uma unidade de glicose a partir do aduto com sódio, m/z 815 [M+Na-glu]+ (70) e a posterior perda do grupo acetato, m/z 773 [M+Na-glu-Ac]+ (10). O sinal em m/z 439 indica a massa da aglicona desidratada, [A+H-H2O]+ (50).

A análise do conjunto de dados (Tabelas 6.3-6.4) e os dados dos espectos de massas permitiram identificar a substância com fórmula molecular C49H78O18 - ácido 3β-O-β-D-

glucopiranosil-(1→3)-α-L-2-O-acetilarabinopiranosil-urs-12-en-28-oico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Fig. 6.8). O levantamento bibliográfico indicou que esta substância foi encontrada em I. paraguariensis (Schenkel, 1995), no entanto, não encontramos a publicação que apresenta os dados espectrométricos.

Fig. 6.4: Espectro TOCSY-1D de Ia1 (ppm, 600 MHz, CD3OD, TMS)

(A) Irradiado em δ 4.40; (B) irradiado em δ 4,45; (C) irradiado em δ 5,19;

(D) irradiado em δ 4,08; (E) irradiado em δ 5,38 . (A)

(B)

(C)

(D)

Fig. 6.5: Espectro COSY 1H- 1_{H Ia1 (ppm, 600 MHz, CD}

Ia2

Esta molécula difere de Ia1 apenas na aglicona. Ia2 é um derivado do ácido oleanólico: no espectro de RMN 1_{H pôde-se notar a presença de H-18 em δ 2,9 (dd, J = 12,0 e 5,4}

Hz) e 7 singletos de metilas na região diamagnética. Os demais sinais têm pequena variação nos deslocamentos químicos com relação àqueles de Ia1. Através dos dados apresentados na Tabela 6.3, observamos que as mudanças dos deslocamentos químicos de RMN de 13C estão principalmente no anel E, devido à mudança da posição das metilas 29 e 30 (Mahato et al.1994).

Pelos dados apresentados (Tabela 6.3-6.4), Ia2 foi determinado como sendo o ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-(1→3)-α-L-2-O-acetilarabinopiranosil-olean-12-en-28-óico 28-O-β-D- glucopiranosil éster. Os dados de ES/MS de Ia1 confirmaram a estrutura proposta. Observa-se o aduto com acetonitrila em m/z 994 [M-H+MeCN]- _{(33), o pico pseudo molelular em m/z 953 [M-H]-}

(5), e as demais quebras indicando as perdas dos açúcares, m/z 791 [M-H-glu]- (51) perda de uma glicose, m/z 749 [M-H-glu-Ac]- (100) a perda do grupo acetato, resultando da perda de outra unidade de açúcar o pico m/z 587 [M-H-2glu-Ac]- (29). No modo negativo não foi possível observar a perda da arabinose gerando o pico m/z 455 [M-H-2glu-Ac-ara]- _{= [A-H]- da aglicona. No modo positivo}

(100 V) observamos os seguintes sinais: m/z 977 [M+Na]+ (25), m/z 815 [M+Na-glu]+ (60), m/z 773 [M+Na-glu-Ac]+ _{(13), m/z 439 [A+H-H}

2O]+ (45) confirmando as fragmentações observadas no

Ia1 Ia2 Ia3 Ia4 1 39,5 39,7 39,6 39,2 2 26,6 26,8 26,7 26,5 3 90,5 90,0 89,9 88,8 4 40,0 40,2 40,0 40,0 5 56,8 56,9 56,7 56,9 6 18,7 19,3 18,9 18,9 7 32,2 32,6 32,1 32,0 8 39,3 40,7 39,0 39,4 9 48,8 48,0 48,9 48,9 10 38,8 37,8 38,5 37,2 11 24,0 24,5 24,2 23,9 12 127,5 123,8 122,5 128,1 13 138,6 144,7 144,5 139,9 14 42,1 42,8 42,0 42,2 15 28,0 28,9 28,1 29,6 16 24,0 24,2 24,6 26,2 17 48,1 47,1 47,1 48,4 18 54,0 42,6 42,4 53,4 19 39,1 47,2 47,3 72,7 20 39,5 31,5 31,2 41,8 21 30,1 34,9 34,7 26,7 22 37,2 33,2 32,8 36,9 23 27,9 28,0 27,9 27,8 24 16,0 15,6 16,3 15,9 25 14,9 16,4 14,3 14,5 26 17,1 17,1 17,0 17,0 27 23,6 25,2 23,5 23,8 28 176,9 178,1 182,0 182,0 29 17,1 33,3 33,3 29,9 30 20,9 23,8 21,0 16,7

Tabela 6.4: Deslocamentos químicos de 13_{C e} 1_{H dos açúcares das substâncias Ia1 - Ia4 (CD}

3OD, 600 MHz, δ). Multiplicidades e constante de

acoplamento (Hz) entre parênteses.

Ia1 Ia 2 Ia3 Ia4

13_C 1_H 13_C 1_H 13_C 1_H 13_C 1_H 3-ara 1 104,9 4,45 d (7,8) 104,9 4,45 d (7,9) 104,5 4,52 d (7,6) 2 72,5 5,20 dd (7,8; 8,4) 72,5 5,20 dd (7,9; 8,4) 74,9 3,90 dd (7,6; 8,4) 3 52,1 3,84 dd (3,6; 8,4) 81,2 3,85 dd (3,6; 8,4) 72,6 3,85 dd (3,6; 8,4) 4 69,7 4,08 m 69,7 4,08 m 68,5 4,04 m 5 66,5 3,62 dd (12,0; 3,0) 3,90 dd (12,0; 2,4) 66,5 3,62 dd (12,0; 3,0) 3,90 dd (12,0; 2,4) 64,5 3,52 dd (12,5; 3,0) 3,81 dd (12,5; 2,0) CH3CO 21,3 2,09 s 21,0 2,07 s CH3CO 171,0 171,1

glu (3→1) glu (3→1) glu (2→1) rha

1 106,0 4,41 d (7,8) 106,0 4,41 d (7,8) 101,5 5,23 s 2 74,5 3,22 dd (9,6; 7,8) 74,5 3,22 dd (9,6; 7,8) 71,7 3,92 dd (1,5; 3,5) 3 77,9 3,42 t (9,6) 77,9 3,42 t (9,6) 71,3 3,73 dd (3,5; 10,0) 4 71,7 3,38 t (9,6) 71,7 3,38 t (9,6) 73,4 3,41 t (9,5) 5 77,9 3,34 m 77,9 3,34 m 72,0 3,92 m 6 61,8 3,67 dd (11,5; 6,0) 3,80 dd (11,5; 2,0) 61,8 3,67 dd (11,5; 6,0) 3,80 dd (11,5; 2,0) 12,4 1,25 d (6,0) (3→1) glu 3-gal 1 104,8 4,52 d (7,8) 106,0 4,43 d (7,6) 2 75,0 3,31dd (9,6; 7,8) 81,6 3,72 dd (7,6; 9,0) 3 78,0 3,40 t (9,6) 74,7 3,69 dd (4,0; 9,6) 4 71,4 3,35 t (9,6) 69,8 3,87 dd (2,5; 4,0) 5 78,0 3,32 m 75,7 3,50 m 6 62,0 3,87 dd (11,5; 6,0) 3,71 dd (11,5; 2,0) 62,2 3,75 dd (12,0; 4,5) 3,79 dd (12,0; 2,5)

28-glu 28-glu (2→1) ara

1 95,5 5,37 d (8,0) 95,5 5,41 d (8,0) 106,8 4,50 d (7,8) 2 73,6 3,34 dd (9,5; 8,0) 73,6 3,34 dd (9,5; 8,0) 73,4 3,68 t (8,0) 3 78,3 3,38 t (9,5) 78,2 3,36 t (9,5) 73,8 3,58 dd (3,6; 9,0) 4 71,9 3,32 t (9,5) 71,9 3,32 t (9,5) 69,1 3,80 m 5 78,2 3,35 m 77,5 3,29 m 66,8 3,55 dd (8,0; 2,0) 3,90 dd (8,0; 3,0) 6 61,8 3,67 dd (12,6; 5,9) 3,80 dd (12,6; 2,0) 61,8 3,71 dd (12,6; 5,9) 3,85 dd (12,6; 2,0)

O espectro de RMN 1_{H é bastante complexo apresentando sinais importantes}

sobrepostos. No entanto, é possível reconhecer que se trata de um derivado triterpênico de esqueleto oleanano. Observou-se os sinais de H-18 em δ 2,93 como um aparente dubleto largo (J = 14,7 Hz), além de 7 singletos de grupos metilas.

Na região dos prótons anoméricos, observou-se um conjunto de sinais centrados em δ 4,5, correspondentes a 2 unidades de açúcares. Devido à sobreposição de sinais não é possível realizar o experimento TOCSY-1D a partir dos hidrogênios anoméricos. Contudo, observação atenta do espectro revela um sinal alargado em δ 4.04, semelhante ao H-4 da arabinose (sinal também observado em Ia1 e Ia2). Irradiação sobre o sinal em δ 4.04 mostrou sinais em δ 4,53 (H-1), δ 4,04 (H-4), δ 3,89 (H-2, H-3, Ha-5) e δ 3,51 (Hb-5). Os sinais de H-2, H-3 e Ha-5 da arabinose que

apareceram sobrepostos no experimento TOCSY-1D puderam ser claramente observados no espectro HSQC.

Em δ 5,23 observou-se um sinal intenso, cuja irradiação mostrou um único sinal adicional que absorve como um singleto largo em δ 3,92, coerente com H-2 de uma unidade de rhamnose. A irradiação sobre o dubleto em δ 1,25 (H-6(rha)) conduziu à observação dos hidrogênios H-5(rha) e H-2(rha) (δ 3.89, sobrepostos), H-4(rha) (δ 3,40) e H-3(rha) (δ 3,73). A análise do espectro HMQC indica que o sinal δ 5,23 também tem correlção com C-12 (δ 122,5), indicando a coalescência dos sinais de H-12, olefínico, com os sinais de H-1(rha).

No espectro HMQC foi possível observar os valores dos deslocamentos químicos de RMN 13C que permitiram confirmar a identificação tanto da aglicona quanto dos açúcares. Correlações significativas puderam ser observadas para os sinais em δ 101,5-5,23 (C-1(rha)-H- 1(rha)), δ 104,5-4,52 (C-1(ara)-H-1(ara)) e δ 104,8-4,53 (C-1(glu)-H-1(glu)).

Pelo espectro HMBC constatou-se que a unidade de arabinose está ligada ao C-3 através da correlação δ 89,9-4,53 (C-3-H-1(ara)). Embora o espectro HMBC não apresente correlações que permitam estabelecer todas as ligações interglicosídicas, comparação com os dados da literatura nos levou a concluir que a substância é o ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1→2)]-[β- D-glucopiranosil-(1_→3)]-_α-L-arabinopiranosil-olean-12-en-28-óico (Fig. 6.8). Os dados de ES/MS reforçam a atribuição a Ia3. No modo negativo (100 V): observa-se o pico do aduto com acetonitrila com m/z 936 [M-H+MeCN]- (22), o pico m/z 895 [M-H]- (3) indica o íon pseudo-molecular, com a perda de uma glicose tem-se o sinal m/z 733 [M-H-glu]- (45), com aperda da rhamnose foi observado

o pico m/z 587 [M-H-glu-rha]- (30).Não foi possível observar a perda da arabinose que produziria o pico da aglicona m/z 455 [M-H-glu-rha-ara]- _{= [A-H]-. No modo positivo (100 V), verificamos o}

aduto com sódio m/z 919 [M+Na]+ (27).

Ia4

No espectro RMN 1H foi possível observar que a substância analisada é um derivado triterpênico de esqueleto 19α-hidroxiursano, principalmente pelo sinal do H-18 em δ 2,59(s). Nesse espectro também se observa a presença de dois hidrogênios anoméricos em δ 4,50 (d, 6,6 Hz) e em δ 4,43 (d, 7,2 Hz), atribuídos respectivamente a uma unidade de arabinose e outra de galactose, identificados pelos experimentos TOCSY-1D.

Irradiação do hidrogênio anomérico em δ 4,50 mostrou 3 grupos de sinais de mesmo sistema de spins atribuídos a uma unidade de arabinose: H-2(ara) (δ 3,68, t, J = 8 Hz), H-3(ara) (δ 3,58, dd, J = 9,0 Hz e 3,6 Hz) e H-4(ara) (δ 3,80, m). Irradiação do sinal em δ 3,80 (H-4(ara)) mostrou os sinais de H-1(ara) (δ 4.50, d, J =6,6),Ha-5(ara) (δ 3.90, dd, J = 8,0 e 3,0 Hz), H-2(ara) (δ 3,68, dd, J = 7,6 e 8,4), H-3(ara) (δ 3,58, dd, J = 9,0 e 3,6 Hz) e em δ 3,55 (Hb-5(ara), dd, J = 8,0 e 2,0 Hz).

O experimento TOCSY-1D partindo do sinal em δ 4,42 mostrou outros 3 grupos de sinais: um tripleto aparente em δ 3,72 (J = 7,6, H-2(gal)), um duplo dubleto em δ 3,67 (J = 9,6 e 3,0 Hz, H-3(gal)) e um singleto largo em δ 3,87 atribuído a H-4(gal). A identificação do açúcar como sendo galactose proveio da análise do conjunto dos experimentos TOCSY-1D e HMQC.

O espectro HMQC permitiu obter os valores de deslocamentos químicos de RMN 1H e RMN 13C, além de confirmar as identidades dos açúcares feitas através dos experimentos TOCSY- 1D (Tabelas 6.3 e 6.4)

O experimento HMBC exibiu as correlações entre os sinais C-1(gal)-H-3 (δ 105,9- 3,15) e C-3-H-1(gal) (δ 90,5-4,43), mostrando que a unidade de galactose está ligada à posição 3 da aglicona. Por sua vez, a correlação entre os sinais C-2(gal)-H-1(ara) (δ 81,8-4,50) mostra que a unidade de arabinose está ligada à posição 2 da galactose. Os dados de ES/MS ajudaram na elucidação estrutura. No modo negativo (100 V) observamos o sinal do aduto com acetonitrila m/z 806 [M-H+MeCN]- _{(19) e o pseudo molecular m/z 765 [M-H]- (3); a perda de uma arabinose produz}

com a perda da arabinose temos o sinal m/z 657 [M+Na-ara]+ (68). No modo positivo também foi possível observar o pico da aglicona desidratada m/z 455 [A+H-H2O]+ (40).

A análise dos dados obtidos e a comparação com dados da literatura possibilitaram que Ia4 fosse identificado como o ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-α-L-galactopiranosil- 19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico (Fig. 6.8).

Ia5

No espectro RMN 1H observou-se sinais que indicam que Ia5 é uma saponina derivada de triterpeno com esqueleto ursano, pois observa-se o dubleto de H-18 em δ 2,25 (J = 5,0 Hz). Três hidrogênios anoméricos foram observados em δ 5,37 (H-1(glu), d, J = 7,8 Hz), 4,58 (H-1

(glu), d, J = 7,8 Hz) e 4,32 (H-1(ara), d, J = 7,2 Hz). Os açúcares foram identificados por experimentos TOCSY-1D semelhantes aos descritos anteriormente.

O espectro HMQC permitiu obter os valores de deslocamentos químicos de RMN 1_H

e de 13C, além de confirmar as identidades dos açúcares feitas através dos experimentos TOCSY-1D. O espectro ES/MS forneceu dados que auxiliaram na determinação estrutural. No modo negativo (100 V) observamos um aduto com acetonitrila,o pico pseudo molecular e as perdas sucessivas de duas unidades de glicose e uma de arabinose: m/z 952 [M-H+MeCN]- _{(21), m/z 911}

[M-H]- (5), m/z 749 [M-H-glu]- (51), m/z 587 [M-H-2glu]- (29), m/z 455 [M-H-2glu-ara]- _{= [A-H]-}

(5). No modo positivo (100 V) verificamos o aduto de sódio e as perdas sucessivas dos açúcares: m/z 935 [M+Na]+ (25), m/z 773 [M+Na-glu]+ (60), m/z 611 [M+Na-2glu]+ (13), m/z 479 [M+Na-2glu- ara]+ = [A+Na]+ (10), m/z 457 [A+H]+ (3) e a aglicona desidratada, [A+H-H2O]+ (35) com pico m/z

439.

Por comparação com dados da literatura (Miyase et al.,1996) concluiu-se que Ia5 é o ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-(1-3)-α-L-arabinopiranosil-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D- glucopiranosil éster (Fig. 6.8).

Ia6

Pelo espectro RMN 1_{H observou-se que a substância Ia6 é derivada de triterpeno com}

esqueleto 19α-hidroxiursano, como se pode deduzir pela presença do singleto largo em δ 2,54. Observam-se dois sinais de hidrogênios anoméricos, um em δ 4,36 (d, J = 7,8 Hz) e outro em δ 5,35 (d, J = 8,4 Hz).

O experimento TOCSY-1D irradiando o sinal em δ 5,35 forneceu o perfil de uma unidade de glicose, com um conjunto de sinais entre 3,32 e 3,43 e os sinais de H-6a(glu) e H-6b(glu),

visíveis em δ 3,81 e δ 3,71.

Através da irradiação do hidrogênio anomérico em δ 4,35 observaram-se os duplo dubletos de H-2(glcA) (_δ 3,41), H-3(glcA) (_δ 3,60), H-4(glcA) (_δ 3,25) e H-5(glcA) (_δ 3,46). Portanto, deduz-se que o açúcar é o ácido glucurônico, tendo em vista que o H-5 acopla unicamente com H-4 e que não se observam os sinais de H-6a e H-6b.

Pela análise dos dados espectroscópicos, Ia6 foi identificada como o ácido 3β-O-β-D- glucuronopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Fig. 6.8) (Lavaud et al., 1996).

Ia7

O espectro RMN 1H é semelhante ao de Ia3. A observação dos sinais das metilas e do H-18 mostram que é um triterpeno derivado de esqueleto oleanano. Os sinais dos prótons anoméricos também aparecem em regiões semelhantes àqueles de Ia3. A principal diferença é que em δ 5,40 observa-se o dubleto (J = 7,8 Hz) de um hidrogênio anomérico adicional. Experimento TOCSY-1D mostrou que esta é uma unidade de glicose.

Comparação com os dados obtidos anteriormente e com aqueles da literatura possibilitou que identificássemos Ia7 como o ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-2)]-[β-D- glucopiranosil-(1-3)]-α-L-arabinopiranosil-olean-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Fig.

6.8).

Pode-se notar também sinais menos intensos referentes a H-18 em δ 2,35 - referente ao respectivo derivado ursânico - e o próton anomérico em δ 5,28. Dessa forma, pode-se concluir que nessa fração existe também o ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-2)]-[β-D-glucopiranosil-(1-3)]-α- L-arabinopiranosil-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster.

O perfil dos espectros de RMN 1_{H indica que existe uma mistura de substâncias com}

agliconas derivadas de ursano e de 19α-hidroxiursano.

O sinal de H- em δ 3,27, observado como um dubleto de J = 9 Hz, indica que H-3 ocupa a posição equatorial, portanto, a configuração α.

O espectro apresenta dois hidrogênios anoméricos, em δ 4,69 (d, 7,8 Hz) e δ 4,42 (d, 7,8 Hz). Irradiação do hidrogênio anomérico em δ 4,69 mostrou grupos de sinais de mesmo sistema de spins atribuídos a uma unidade de glicose: H-1(glu) (δ 4,69, d , J = 6,0 ), H-2(glu) a H-5(glu) (δ 3,20 - 3-40), H-6a(glu) (δ 3,85, m) e H-6b(glu) (δ 3,63, m). Irradiação do sinal em δ 4,42 (H-1(gal))

mostrou os sinais de H-2(gal) (δ 3,90, dd, J =8,0 e 10,0), H-3(gal) (δ 3.68, dd, J =3,5 e 10,0 Hz), H- 4(gal) (_δ 3,84, d, J = 3,5 Hz). A identificação dos acúcares proveio da análise do conjunto dos experimentos TOCSY-1D e HMQC.

A partir dos espectros HOHAHA e COSY 1H-1H foi possível atribuir os sinais dos hidrogênios dos dois açúcares. O espectro HOHAHA mostra que outros 6 sinais correlacionam com o anomérico em _δ 4,43, estando de acordo com o sistema de spins de uma unidade de glicose. Para o hidrogênio anomérico em δ 4,68 observam-se outros três sinais correlacionados num mesmo sistema de spin, referentes a uma unidade de galactose.

Pelos dados apresentados, deduzimos que Ia8 é uma mistura dos ácidos 3α-O-β-D- glucopiranosil-(1-2)-α-L-galactopiranosil-urs-12-en-28-óico e ácidos 3α-O-β-D-glucopiranosil-(1- 2)-α-L-galactopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico (Fig. 6.8)

Ia9

Pelo espectro RMN 1_{H, observou-se que Ia9 é uma mistura de saponinas derivadas de}

triterpenos com esqueletos ursano e oleanano, tendo-se em vista os sinais em δ 2,90 dd (H-18- oleanano) e em δ 2,30 d (H-18-ursano).

Observam-se dois sinais de hidrogênios anoméricos em δ 4,55 (d, J = 7,2 Hz) e δ 4.31 (d, J = 7,2 Hz). O espectro TOCSY-1D com irradiação de δ 4,55, resultou nos sinais característicos de uma unidade de glicose podendo-se observar com facilidade os sinais de H-6a(glu) (δ 3,85) e H-

Pela irradiação do sinal em δ 4,31, indicou os sinais de uma unidade de arabinose: H- 2(ara) (δ 3,73, dd, J = 8,5 e 8,5 Hz), H-3(ara) (δ 3,65, dd, J = 9,0 e 3,6 Hz) e H-4(ara) (δ 4,04, singleto aparente). A irradiação do sinal em δ 4,04 permitiu a visualização de Ha-5(ara) e Hb-5(ara).

Comparando-se os dados obtidos com os espectros analisados anteriormente e com os da literatura as substâncias presentes em Ia9 foram identificadas como sendo o ácido 3β-O-β-D- glucopiranosil-(1→2)-α-L-arabinopiranosil-urs-12-en-28-óico e o ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil- (1→2)-α-L-arabinopiranosil-olean-12-en-28-óico (Fig. 6.8).

Ia10

Pelo perfil do espectro de RMN 1H observou-se que a substância é um derivado de esqueleto ursano 19-α-hidroxilado. Os hidrogênios anoméricos apresentam absorção em δ 4,43 (d, 7,8 Hz), 4,51 (d, 6,6 Hz) e 5,35 (d, 7,8 Hz). Comparando-se esse espectro como aquele de Ia4, deduzimos que é o mesmo conjunto de açúcares que está ligado na posição 3 da aglicona, ou seja ara(1→2)gal. No entanto, Ia10 apresenta açúcar também em C-28, conforme indica o dubleto (J = 7 Hz) em δ 5,33. Pela comparação dos espectros e por comparação com dados da literatura concluímos que Ia10 é o ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1-2)-α-L-galactopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28- óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Fig. 6.8)

Ia11

Pelo RMN 1H pôde-se determinar que o esqueleto da substância é um ursano 19α- hidroxilado. O padrão de substituição na posição 3 é idêntico àquele de Ia3 e Ia7. No entanto, em δ 5,35 (d, J = 7,8 Hz) observa-se o sinal do hidrogênio anomérico de uma glicose esterificada em C- 28. Assim, comparando os espectros das três substâncias e os dados da literatura foi possível determinar a estrutura de Ia11 como sendo o ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-2)]-[β-D- glucopiranosil-(1-3)]-α-L-arabinopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Fig. 6.8).

O espectro RMN 1H de Ia12 apresentou sinais na região entre δ 6,0 e 8,1, sinais característicos de anéis aromáticos. Observam-se sinais entre δ 3,0 e 4,0 atribuídos a hidrogênios de unidades de açúcar. Entre δ 4,5 e 5,0 é possível identificar os sinais de dois hidrogênios anoméricos. O perfil do espectro é típico de um flavonóide diglicosilado com o padrão de substituição A2B2 no anel B, indicando que pode ser um derivado do kaempferol. O anel A

apresenta padrão de substituição AB, provavelmente hidroxilado nas posições 5 e 7. Em 6,9 verificamos o dubleto de J = 8,4 Hz atribuído aos hidrogênios H-3'/H-5'do anel B do flavonóide. Em δ 8,1 observa-se o dubleto de J = 8,4 Hz, dos hidrogênios H-2'/H-6'. Os hidrogênios H-6 e H-8, têm sinal absorvendo respectivamente em δ 6,1 e 6.22 como dubletos de J = 2.0 Hz. O hidrogênio anomérico observado em δ 4,5 como um singleto aparente, foi atribuído à rhamnose e, outro sinal de hidrogênio anomérico,em δ 5,0 (d, J = 7,2 Hz), a uma unidade de glicose. No espectro ainda é possível observar o dubleto (J = 6.0 Hz) em δ 1,22 do H-6 da rhamnose. Esses dados foram comparados com dados da literatura (Sharaf et al. 1997), sendo possível a identificação do kaempferol-3-O-rutinosídeo (Fig. 6.8).

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ C H₃ R₁ R₂ C H₃ CH₃ H H H 1 3 28 19

Ia1 R1: O-ara(2OAc)-3-glu

R2: COOglu

Ia5 R1: O-ara-3-glu

R2: COOglu

Ia8 R1: O-gal-2-glu

R2: COOH

Ia9 R1: O-ara-2-glu

R2: COOH CH3 CH3 CH₃ CH3 C H3 R1 R₂ CH3 C H3 H H H

Ia2 R1: O-ara(2OAc)-3-glu

R2: COOglu

Ia3 R1: O-ara-2-rha | 3 glu

R2: COOH

Ia7 R1: O-ara-2-rha | 3 glu R2: COOglu CH3 CH₃ CH3 CH₃ C H3 O H COOH C H3 CH3 O H H H H

Ia4 R1: O-gal-2-ara

R2: COOH

Ia6 R1: O-glcA

R2: COOglu

Ia10 R1: O-gal-2-ara

R2: COOglu

Ia11 R1: O- ara-2-rha | 3 glu R2: COOglu

O

OH

O

HO

OH

O

rha

glc

6 Ia12

Ilex theezans

It1

O perfil do espectro RMN 1H apresentou sinais característicos dos derivados de triterpenos de esqueleto oleanano. Todavia apresenta apenas 6 singletos referentes a sinais de Me. No entanto, em δ 4,13 (d, J = 10,8 Hz) e δ 3,87 (d, J = 11,4) absorvem os sinais de Ha-23 e Hb-23,

indicando que a Me-23 está hidroxilada (Taketa et al., 2000). O espectro TOCSY-1D do H anomérico observado em δ 4,38 (d, J = 7,8 Hz) indicou todos os sinais de uma unidade de glicose. Assim, It1 foi identificada como o ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-olean-12-en-23-hidroxi-28-óico (Fig. 6.9).

It2

O espectro de RMN 1_{H condiz com aquele de um derivado de ursano 19α-hidroxilado.}

Similarmente a It1, observam-se apenas 6 sinais de grupos metílicos, além de sinais em δ 4.28 (d, J = 12 Hz) e δ 4,01 (d, J = 12 Hz), referentes a Ha-23 e Hb-23, indicando que a Me-23 está hidroxilada.

Não se observam sinais de hidrogênios anoméricos. Através dos espectros HMQC e HMBC foi possível atribuir os valores dos deslocamentos químicos de carbono e de hidrogênio. Comparação com dados da literatura (Mahato & Kundu, 1994) permitiram identificar It2 como o ácido 3β,19α,23-triidroxiurs-12-en-28-óico (Fig. 6.9).

It3

O espectro de RMN 1_{H mostra que a substância é um derivado do ácido 19α-hidroxi-}

ursólico. Pelo sinal de H-3, observado como singleto largo em δ 4,00, deduz-se que H-3 ocupe a posição equatorial, ou seja, possui configuração α. Através do espectro COSY 1H-1H foi possível atribuir os sinais dos hidrogênios de It3 e comparar com dados da literatura (Mahato & Kundu, 1994), tendo sido identificada como o ácido 3α,19α-diidroxiurs-12-en-28-óico (Fig. 6.9).

It4

O espectro de RMN 1_{H mostrou que esta substância é muito semelhante a It3, porém}

observa-se o sinal de H-3 como duplo dubleto em δ 3,15 (J = 8,4 e 4,2 Hz ). Esses valores indicam que H-3 ocupa posição axial, e portanto possui configuração β. Através do espectro COSY 1_H-1_{H foi}

possível atribuir os sinais dos hidrogênios de It4. Comparação com dados da literatura (Mahato & Kundu, 1994) permitiram identificar essa substância como o ácido 3β,19α-diidroxiurs-12-en-28-óico (Fig. 6.9).

It5

A substância It5 foi isolada diretamente da coluna de Sephadex LH20. Quando

No documento Estudo químico de chás brasileiros (páginas 81-104)