Sorocea bomplandii Baill. pertence à família Moraceae. São árvores pequenas ou arbustos, com ramos eretos, troncos com casca lisa, folhas rijas e serrilhadas nas bordas, que crescem em lugares sombreados (Fig. 5.1). Popularmente são conhecidas como bainha-de-espada, canxim- mirim, cega-olho, cincho, erva cancrosa, maria-mole, sorocó e sorococó (Carauta 1996).
As folhas de S. bomplandii têm aspecto muito semelhante às da “espinheira-santa” (Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium), cujo chá das folhas tem comprovada atividade antiúlcera gástrica (Carlini, 1988). Por isso, as folhas de S. bomplandii podem facilmente ser confundidas com as da verdadeira “espinheira-santa” e algumas vezes têm-se constatado o uso do chá de S. bomplandii ao invés do chá de Maytenus spp. Avaliação toxicológica indicou que S. bomplandii não apresenta toxicidade aguda aos animais testados (Bianchi 1993). Contudo, o desconhecimento de sua composição química representa um sério risco à sua utilização como planta medicinal.
Fig. 5.1: Sorocea bomplandii Baill. (Moraceae) (Lorenzi, 1992)
e S. ilicifolia conduziram ao isolamento e identificação de polifenóis prenilados com estruturas complexas, resultantes da formação de adutos de Diels-Alder entre chalconas e compostos prenilados (Ferrari et al., 1986; Hano et al.1995a; Hano et al. 1995b; Messana et al. 1994; Messana et al. 1991). Dos extratos hexânico e diclorometânico foram isolados triterpenos pentacíclicos derivados do oleanano, ursano e lupano (Andrade & Vilegas, 1998).
5.1. Experimental / Resultados / Discussões
Preparamos a infusão 10% com 90 g de folhas de Sorocea bomplandii. Esse extrato aquoso foi fracionado em coluna de Amberlite XAD2. A dessorção foi iniciada com 200 mL de metanol/água, seguida por 200 mL de metanol. Depois de secado, 10 mg do extrato metanólico dessorvido foi dissolvido em 1 mL de de metanol e preparado para análise cromatográfica.
As condições cromatográficas para a separação dos flavonóides glicosilados de S. bomplandii usando fase C30, assim como as condições para usar HPLC-MS e HPLC-RMN foram semelhantes àquelas utilizadas na separação de extratos de Maytenus (Sannomiya et al., 1998).
A separação foi otimizada sendo que a eluição foi feita com metanol/H2O (40:60) por
20 min, seguida por um gradiente de 40 min até se chegar à proporção de metanol/água 80:20. O fluxo foi reduzido para 0,7 mL/min a fim de diminuir a pressão sobre a coluna.
A Fig. 5.3 mostra a separação dos flavonóides de S. bomplandii. Todos os componentes tiveram separação de linha-base e quase não se observa alargamento irregular dos picos. Devido à alta seletividade da fase C30, até mesmo os componentes minoritários puderam ser separados. Os triglicosídeos mostram um baixo tempo de retenção devido às suas altas polaridades quando comparadas com os diglicosídeos. De modo semelhante aos extratos de Maytenus (Vilegas et al. 1999), os respectivos derivados da quercetina eluem primeiro por serem mais hidroxilados do que os do kaempferol.
Apesar da grande quantidade de material injetado, não se perceberam efeitos de saturação da coluna. Devido à alta capacidade dessa coluna, as substâncias eluídas puderam ser injetadas diretamente nos sistemas de MS e de RMN sem a necessidade de pré-concentração.
Os flavonóides puderam ser identificados a partir de experimentos de HPLC-ES-MS. A Fig. 5.3 mostra o cromatograma de HPLC-UV (370 nm) e também os espectros de massas no modo negativo dos picos detectados. Na região entre 40 e 60 min observam-se os diglicosídeos. A literatura mostra que os açúcares mais comuns encontrados em plantas - especialmente os ligados a flavonóides - são glicose e rhamnose (Harborne, 1993). Por esse motivo, explanaremos os resultados a seguir baseados apenas nesses dois açúcares, ficando claro no entanto que os experimentos realizados não permitem diferenciar unidades de hexoses, pentoses, etc. A seguir será empregada uma nomenclatura simplificada para denominar as substâncias detectadas.
0 10 20 30 40 50 0 100 200 300 400 500 mAu min
A aglicona dos derivados do kaempferol (K) apresentam [K-H]- com m/z 285 e os da
quercetina [Q-H]- com m/z 301. O pico com tR 39,2 min apresenta [M-H]- com m/z 609 e [Q-H]- com
m/z 301, podendo ser caracterizado como um derivado da quercetina ligada a duas unidades de açúcares, um dos quais glu e outro rha. O pico que elui com tR 44,9 min apresenta massa [M-H]- com
m/z 593, e [K-H]- com m/z 285, sendo portanto um diglicosídeo do kaempferol contendo glu e rha.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 [min] m/z 593 m/z 755 m/z 609 m/z 739 m/z 771
Fig.5.3: Análise de S. bomplandii por HPLC-ES-MS. Cromatograma UV (370 nm) e cromatogramas extraidos dos íons m/z 771, m/z 755, m/z 739, m/z 609 e m/z 593.
Analogamente, os triglicosídeos com tR 10,2 min, 20,3 e 22,9 puderam ser identificados
respectivamente como 771 (Q-glu-glu-rha), 755 (K-glu-glu-rha), 739 (K-glu-rha-rha).
É interessante observar que nos cromatogramas extraídos dos íons m/z 609 e m/z 593, referentes aos triglicosídeos, que eluem entre 10 e 25 min, podem ser vistos sinais intensos na região entre 35 e 45 min. Estes últimos sinais são derivados das fragmentações dos triglicosídeos formando diglicosídeos.
O cromatograma extraído do íon de m/z 755 mostra 2 picos, de onde se deduz que 2 diferentes derivados de kaempferol com 2 unidades de glicose e 1 rhamnose estão presentes em S. bomplandii. Provavelmente os açúcares estão ligados entre si ou à aglicona de formas diferentes.
Pudemos também registrar os espectros MS-MS de alguns dos picos a fim de obter uma determinação estrutural mais detalhada. Na Fig. 5.4 mostramos um resumo dos 3 picos principais.
0 20 40 60 80 100 200 300 400 500 600 700 m/z 0100 200 300 400 500 600 700 m/z 20 40 60 80 755,0 285,0 0 20 40 60 80 100 Abund. 100 200 300 400 500 600 700 m/z 609,0 MS (Peak bei 39,2 min)
0 20 40 60 80 100 Abund. 301,0 100 200 300 400 500 600 700 m/z MS/MS von Q-Glc-Rha 593,0 100 200 300 400 500 600 700 m/z 0 20 40 60 80 100 Abund. 285,0 100 200 300 400 500 600 700 m/z 0 20 40 60 80 100 Abund.
MS (Peak bei 44,9 min) MS/MS von K-Glc-Rha
Q-Glc-Rha
K-Glc-Rha
Fig. 5.4: Espectros de massas dos 3 constituintes princípais de S. bomplandii, com tR 20,3 min,
Os espectros de MS-MS no modo negativo dos picos com m/z 771 e m/z 593, mostram a aglicona do kaempferol [K-H]- m/z 285, enquanto que o espectro MS-MS do pico com m/z 609 mostra a aglicona correspondente à quercetina [Q-H]- m/z 301.
O pico de tR 20,3 min indica um derivado diglicosilado do kaempferol em que
simultaneamente perdeu uma molécula de água, gerando o pico o íon MS2 com m/z 575 [M-H]- -
[glu-rha-H2O]-.
Com o emprego do HPLC-MS acoplados foi possível identificar rápida e facilmente os derivados de kaempferol e de quercetina. Paralelamente à análise cromatográfica, os espectros de MS e MS2 possibilitaram uma análise detalhada do pico.
Obviamente, o acoplamento HPLC-ES-MS não permite que se estabeleça a estrutura completa do flavonóide, como por exemplo a identificação dos açúcares ligados a ele. Por esse motivo, é necessário empregar técnicas de HPLC-RMN.
O acoplamento HPLC-RMN é uma das mais modernas técnicas de separação de detecção on-line e fornece novas perspectivas ao trabalho fitoquímico, possibilitando a separação e identificação simultânea. As principais vantagens desse acoplamento são a rapidez da análise partindo-se do extrato bruto e a baixa quantidade de material vegetal envolvida na análise (Albert, 1995).
Todas análises por HPLC-RMN foram realizadas em espectrômetro Bruker AMX 600. Foi usada uma POBRE inversa com volume de detecção de 120 µL.
A Fig. 5.5 mostra as regiões alifática e aromática do espectro RMN 1H (stopped-flow) dos componentes principais de S. bomplandii. Os derivados da quercetina e do kaempferol podem ser facilmente diferenciados através do exame da região aromática dos espectros. O kaempferol mostra 2 dubletos (δ 8,00 e 6,94 J = 8 Hz) de um anel aromático p-substituído e a quercetina apresenta três grupos de sinais um dubleto de 2 Hz em δ 7,69, um dubleto de 8 Hz em 6,90 e um duplo dubleto de 8 e 2 Hz em δ 7,55 O número de açúcares ligados à cada flavonóide pode ser facilmente determinado pelo número de prótons anoméricos na região entre δ 5,2 e 4,4. Apesar do sinal da mistura de solventes metanol/D2O entre δ 3,3 e δ 4,7, todos os sinais dos prótons anoméricos foram detectados.
(ppm) 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
2'
6'
5'
8
6
Glc
Rha
3' 5'
6 8
Glc
Rha
2' 6'
2' 6'
3' 5'
6
8
Glc
Rha
Glc
a) Quercetina-diglicosilada (tR 44,9 min) b) Käempferol-diglicosilado (t+R 39,2 min) c) Käempferol-triglicosilado(tR 20,3 min)a)
b)
c)
Fig. 5.5: Espectro de RMN 1H (600 MHz, δ, TMF) dos componentes principais de
O pico com tR = 44,9 min (Fig. 5.5a) mostra dois prótons anoméricos: em δ 5,01 (d,
7,5 Hz) e em δ 4,47 (d, 1,5 Hz). A constante de aclopamento de J = 7,5 Hz mostra a configuração β da unidade de glicose, enquanto que a constante de acoplamento J = 1,5 Hz identifica a outra unidade de açúcar sendo α-rhamnose. Estes sinais também são encontrados no derivado de quercetina, que elui da coluna C30 com tR 39,2 min (Fig. 5.5b). No pico que elui com tR 20,3 min (Fig. 5.5c)
encontram-se 3 unidades de açúcar: δ 5,17(d, 7,5 Hz), δ 4,78 (d, 7,5 Hz) e δ 4,47 (d, 1,5 Hz). Esses dados são compatíveis com aqueles de HPLC-MS indicando a presença de diglicosídeos e triglicosídeos no chá de S. bomplandii.
Através da combinação HPLC-MS e HPLC-RMN foi possível uma rápida determinação estrutural dos componentes do extrato de S. bomplandii. Nesta planta foram encontrados componentes diferentes daqueles determinados em Maytenus aquifolium. Dessa forma, é possível que os extratos de S. bomplandii não possuam os mesmos efeitos terapêuticos das espinheiras-santa.
Ao contrário de Maytenus aquifolium, na qual se encontram grandes quantidades de tetraglicosídeos (Sannomyia, 1998), em S. bomplandii não foi detectado nenhum tetraglicosídeo. Esse resultado permite que se tenha parâmetros químicos para um controle de qualidade mais eficaz das espinheiras-santas.