Estudo químico de chás brasileiros

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“Júlio de Mesquita Filho”

Instituto de Química - Araraquara

Estudo químico de chás brasileiros

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade

Orientador: Wagner Vilegas

ARARAQUARA - 2002

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Comissão examinadora

Prof.Dr. Wagner Vilegas (Orientador)

Professor adjunto do Instituto de Química / UNESP / Araraquara

Profª Drª Vanderlan da Silva Bolzani

Professor adjunto do Instituto de Química / UNESP / Araraquara

Profª Drª Alba Regina Monteiro Souza Brito

Professor Titular do Instituto de Biologia / UNICAMP / Campinas

Profª Drª Mitsue Haraguchi

Professor Doutor do Instituto Biológico de São Paulo

Profª Drª Joana D’Arc Felicio de Souza

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Curriculum vitae

Dados pessoais

Nome: Fábio Donisete Pezzuto de Andrade

Filiação: Antônio Fernandes de Andrade e Vilma Pezzuto de Andrade Data de Nascimento: 26 / 11 / 1973

Estado Civil: Solteiro

Naturalidade: Araraquara - SP Nacionalidade: Brasileira

Carteira de Trabalho: 092320 Série 00122 - SP Carteira de Identidade: 25.572.600-4

Órgão Emissor: SSP-SP Data de Emissão: 07/02/1990 Titulo de Eleitor: 1905932601-16 Zona: 013

CIC: 196.338.418-01

Certificado de Reservista: 131747 Série B Registro no CRQ-IV: 04140182

Passaporte: CJ 680556 Tipo Sanguineo: O positivo

Endereço: R. Dr. Cristiano I. Vieira, 615, Parque das Laranjeiras CEP: 14.801-556

Cidade: Araraquara - SP Telefone: (016) 236-4214

Correio eletrônico: andrade@bigfoot.com

Formação Primeiro grau:

Instituição: E.E.P.G. “Pedro José Neto” Local: Araraquara - SP

Início: 1981 Conclusão: 1988

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Instituição: E.E.P.S.G. “Bento de Abreu” Local: Araraquara - SP

Curso: Colegial Normal Início: 1989 Conclusão: 1991

Terceiro grau:

Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química - Câmpus de Araraquara

Local: Araraquara - SP

Curso: Bacharelado em Química

Início: 1993 Conclusão: 1996

Pós-graduação

Mestrado

Orientação: Prof. Dr. Wagner Vilegas Área: Química Orgânica

Sub área: Química de Produtos Naturais

Projeto: “Investigação química de plantas da família Eriocaulacea” Financiamento: FAPESP

Início: agosto de 1997 Conclusão: junho de 1999

Doutorado

Orientação: Prof. Dr. Wagner Vilegas Área: Química Orgânica

Sub área: Química de Produtos Naturais

Projeto: “Investigação química de chás brasileiros” Financiamento: FAPESP

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ANDRADE, F.D.P.; VILEGAS, W.. Constituintes de Sorocea bomplandii Bailon. Revista de Ciências Farmacêuticas, v.19, p. 129-139, 1998.

ANDRADE, F.D.P.; SANTOS, L.C.; DOKKEDAL, A.L.; VILEGAS, W.. Acyl glicosylated flavonols from Paepalanthus species. Phytochemistry, v. 51, p. 411-415, 1999.

TAVARES, D.C.; VARANDA, E.A.; ANDRADE, F.D.P.; VILEGAS, W.; TAKAHASHI, C.S.. Evaluation of the genotoxic potential of the isocoumarin Paepalanine in in vivo and in vitro

mammalian systems. Journal of Ethnopharmacology, v. 68, p. 115-120, 1999.

SANTOS, L.C.; ANDRADE, F.D.P.; VASCONCELOS, COELHO, R.G.; DOKKEDAL, A.L.; GARCIA, A.C.L.; SANO, P.T.; VILEGAS, W.. Simultaneous separation of flavonoids and naphtopyrones from Brasilian everlating plants by droplet coutercurrent chromatography. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 2, n. 1, p. 43-47, 1999.

SANTOS, L.C.; DATCHLER, M.; ANDRADE, F.D.P.; ALBERT, K.; VILEGAS, W.. Application of HPLC-NMR coupling using C30 phase in the separation and identification of flavonoids of taxonomic relevance. Fresenius Journal Analytical, v. 368, n. 5, p. 540-542, 2000.

ANDRADE, F.D.P.; PIACENTE, S.; PIZZA, C.; VILEGAS, W.. Studies on the constituents of Brasilian folk infusion. Isolation and structure elucidation.of new triterpene saponins from Ilex amara leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, p. 255-261, 2002.

ANDRADE, F.D.P.; SANTOS, L.C.; DATCHLER, M.; ALBERT, K.; VILEGAS, W.. Use of on-line HPLC-NMR for rapid invetigation of flavonids form Sorocea bomplandii. Journal of Chomatography A, v. 953, p 287-291, 2002.

ANDRADE, F.D.P.; PIACENTE, S.; PIZZA, C.; VILEGAS, W. A new arbutin derivative from Ilex theezans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002 (submetido).

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ethanolic extracts from higher plants of the Cerrado, Brazil. Flavonoid glycosides from Alchornea castaneifolia. Phytomedicine, 2002 (submetido).

TOMA, W.; GRACIOSO, J.S.; ANDRADE, F.D.P.; PAULA, A.C.B.; ALMEIDA, A.B.A.; HIRUMA-LIMA, C.A.; VILEGAS, W.; SOUZA BRITO, A.R.M. (2002). Phytochemical analysis and evaluation of the analgesic and antiedematogenic activities of four extracts of different polarities obtained from bark of Quassia amara L. (Simaroubaceae). J. Pharmaceutical Pharmacology, 2002 (submetido).

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Agradecimentos

A DEUS pela vida e pela oportunidade de sempre evoluir.

Aos meus pais por todo amor, carinho e ensinamentos que um doutoramento jamais ensinaria.

A FAPESP pela bolsa concedida.

A todos, que direta ou indiretamente, nos auxiliaram na realização deste trabalho.

Aos prof. Klaus Albert e Dr. Markus Datchler (Tübingen - Alemanha) e a Dra. Lourdes Campaner dos Santos pelas análise por HPLC-RMN.

Aos professores da Faculdade de Farmácia de Salerno, principalmente aos profs. Cosimo Pizza e Sonia Piacente, pela grande contribuição para esse trabalho.

Ao prof. Dr. Wagner Vilegas pela orientação

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Índice

Comissão examinadora...i

Curriculum vitae ... ii

Agradecimentos...vii

Índice...viii

Abreviaturas...1

Resumo...3

Abstract...4

Objetivos... 5

Considerações preliminares ...6

Introdução...7

Plantas medicinais e os chás ... 7

Atividade antiúlceras gástricas ...9

Plantas ... 9

Testes para avaliação de atividade antiúlcera ... 10

O tratamento de úlceras (Silva, 1998) ... 10

Materiais e métodos ...12

Reagentes ... 12

Solventes PA:... 12

Equipamentos... 12

Extrações ... 14

Procedimentos cromatográficos. ... 15

Material Vegetal... 16

Capítulo 1: Quassia amara (Simaroubaceae)...18

1.1. Experimental / Resultados / Discussões ... 19

1.1.1. Ensaios biológicos ... 19

Preparação dos extratos utilizados nos ensaios biológicos ... 19

Testes de analgesia... 20

Resultados dos ensaios ... 20

1.1.2. Análise fitoquímica de Quassia amara... 24

Fracionamento do extrato hexânico. ... 24

Qa1... 24

Qa2... 25

Qa3... 25

Qa4... 26

Análise do extrato hexânico por HPLC-ES-MS ... 26

Capítulo 2: Alchornea castaneifolia (Euphorbiaceae)...30

2.1.1Ensaios biológicos ... 31

Preparação dos extratos para os ensaios biológicos:... 31

Avaliação do extrato etanólico de A. castaneifolia... 31

2.1.2. Estudo fitoquímico:... 34

Ac1... 35

Ac2... 35

Ac3... 36

Ac4... 37

Capítulo 3: Curatella americana L. (Dilleniaceae)...40

(10)

Preparação dos extratos para os ensaios biológicos ... 41

Avaliação do extrato etanólico de C. americana... 42

Extrato clorofórmico... 45

Ca1... 46

Ca2... 46

Extrato etanólico... 47

Extrato aquoso (decocto) ... 47

Ca3... 47

Ca4... 48

Ca5... 48

3.1.4. Ensaios químicos para detecção de taninos no extrato etanólico de C. americana... 50

Capítulo 4: Hancornea speciosa Gomez (Apocynaceae)... 52

Preparação do decocto de H. speciosa... 55

Fracionamento por HSCCC... 55

Capítulo 5: Sorocea bomplandii Baill. (Moraceae)...56

Capítulo 6: Ilex (Aquifoleaceae)...65

6.1. Ilex amara (Vell.) Loes... 65

6.2. Ilex theezans Mart. ... 66

6.3. Experimental / Resultados/ Discussões ... 67

6.3.1. Fracionamentos de I. amara e I. theezans... 67

6.3.2. Determinação estrutural... 71

Espectros de RMN de saponinas triterpênicas ... 71

Ilex amara... 72

Ia1... 72 Ia2... 80 Ia3... 83 Ia4... 84 Ia5... 85 Ia6... 86 Ia7... 86 Ia8... 87 Ia9... 87 Ia10... 88 Ia11... 88 Ia12... 89

Ilex theezans ...91

It1 ... 91

It2 ... 91

It3 ... 91

It4 ... 92

It5 ... 92

Capítulo 7: Considerações finais ...94

Conclusões...103

Referências bibliográficas...104

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Abreviaturas

δ Deslocamento químico em ppm

AcOEt Acetato de etila ara Arabinose

BAW Sistema de solvente butanol: ácido acético: água

BPI Base Peak Ion

CC Cromatografia em coluna

CCC Countercurrent chromatography. - Cromatografia em contracorrente. COSY Correlation spectroscopy – Espectroscopia de correlações

D Dubleto

d.i. Diâmetro interno

DAD Diodo Array Detector - Detector de foto diodo DAINE Droga antiinflamatória não esteroidal

DCM Diclorometano dd Duplo dubleto

DMSO d6 Dimetilsulfóxido deuterado EtOH Etanol

FI Fase inferior

Fr. Fração

FS Fase superior gal Galactose

GC Gas chromatography - Cromatografia gasosa

GPC Gel Permeation Chromatography – Cromatografia por permeação em gel glcA Ácido glicurônico

glu Glicose

HEX Hexano

HMBC Heteronuclear multiple-bond connectivity - Coerência heteronuclear com ligações múltiplas

HMQC Heteronuclear multiplequantum coherence – Coerência heteronuclear múltiplo quântica

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HOHAHA Homonuclear Hartmann-Hahn espectrometria

HSCCC High Speed Countercurrent Chromatography.- Cromatografia em contracorrente de alta velocidade.

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento M Multipleto

m/z Relação massa/carga

MeOH Metanol

MS Mass Spectrometry - Espectrometria de massas

NI Ï on negativo

NP/PEG Natural Product/Polietilenoglicol PI Ï on positivo

ppm Partes por milhão

rha Rhamnose

RI Índice de refração

RMN Ressonância magnética nuclear

RMN 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio RMN 13_C _{Ressonância magnética nuclear de carbono 13}

RP Reversed phase – fase reversa

s Singleto

t Tripleto

TIC Total Íon Current – corrente total de íons

TLC Thin Layer Chromatography - Cromatografia em camada delgada comparativa TMS Tetrametilsilano

TOCSY Totally Correlated Spectroscopy – Espectroscopia totalmente correlacionada

Tol Tolueno

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Resumo

Neste trabalho apresentamos o estudo químico de plantas que são popularmente utilizadas na forma de infusão. Como parte de nosso projeto, estudamos espécies usadas no tratamento de úlceras gástricas: Quassia amara (Simaroubaceae), Alchornea castaneifolia

(Euphorbiaceae), Curatella americana (Dilleniaceae) e Hancornea speciosa (Apocynaceae). Os extratos foram avaliados farmacológicamente em diferente modelos indutores de úlcera para avaliar suas atividades. Os extratos ativos foram fracionados por técnicas cromatograficas e as substâncias identificadas por métodos espectrométricos. Em Quassia amara foram identificados principalmente esteróides e quassinóides; em C. americana foram identificados taninos, catequinas, terpenos e ácidos fenólicos; em A. castaneifolia foram encontrados flavonóides glicosilados e em H. speciosa

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Abstract

In this work we have investigated plants used in folk medicine in the form of infusion. As a part of our project, we studied species used for the treatment of gastric ulcers: Quassia amara

(Simaroubaceae), Alchornea castaneifolia (Euphorbiaceae), Curatella americana (Dilleniaceae) and

Hancornea speciosa (Apocynaceae). The extracts were submitted to pharmacological evaluation in different models to evaluate their antiulcer activities. The active extracts were fractionated by chromatographic techniques and the substances were identified by spectrometric methods. Quassia amara afforded mainly steroids and quassinoids; C. americana gave tannins, catequins, terpenes and phenolic acids; A. castaneifolia afforded glycosilated flavonoids and H. speciosa gave chlorogenic acid and catechin. These substances supported the antiulcer properties found in the investigated extracts. Other species commonly found in Brazil as infusions are Ilex amara and Ilex theezans

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Objetivos

Foram objetivos deste trabalho:

- Determinar a composição química de Alchornea casteneifolia (Euphorbiaceae), Curatella americana (Dilleniaceae) e Hancornea speciosa (Apocynaceae), plantas popularmente utilizadas no tratamento de úlceras gástricas;

- Determinar a composição química de Quassia amara (Simaroubaceae), planta popularmente utilizada como analgésico;

- Verificar a eficiência das técnicas hifenadas HPLC-RMN e HPLC-MS na análise do extrato aquoso de Sorocea bomplandii (Moraceae), um conhecido adulterante da espinheira-santa;

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Considerações preliminares

Neste projeto investigamos uma série de plantas de várias famílias e gêneros. Tendo em vista este fato, optamos por apresentar o estudo de cada espécie individualmente, incluindo em cada capítulo introdução, desenvolvimento e discussão. Além disso, como para cada espécie foram feitos vários tipos de extratos, preferimos discutir os resultados provenientes de cada um dos extratos separadamente, ao invés de apresentar toda a parte de isolamento e somente depois a identificação espectrométrica de cada substância. Acreditamos que, dessa forma, pode-se ter uma visão mais clara sobre o andamento do trabalho.

Os ensaios biológicos de atividade antiúlceras de Alchornea castaneifolia, Curatella. americana, Hancornea speciosa foram realizados pela prof.ª Dr.ª .Clélia A. Hiruma Lima (IBB-UNESP-Botucatu) e os ensaios de atividade antiinflamatória e analgesia com Quassia amara foram realizados por Walber Toma em seu trabalho de mestrado apresentado ao IB/Unicamp.

As análises realizadas por HPLC-RMN foram realizados com a colaboração do grupo de pesquisa do prof. Klaus Albert (Universidade de Tübingen - Alemanha) e da Dra. Lourdes Campaner dos Santos em seu estágio durante o doutoramento.

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Introdução

Plantas medicinais e os chás

Encontrar a cura para as velhas e novas enfermidades tem sido o objetivo de homens e mulheres, cientistas, mercadores e curandeiros, que perambulam hoje pelas matas brasileiras. No filme Medicine Man (1992), Sean Connery interpreta um desses personagens. No inferno ou paraíso verde da floresta amazônica, o pesquisador procura uma substância capaz de curar o câncer. Ficção à parte, a história mostra o quanto plantas e animais podem contribuir para manter ou restabelecer a saúde humana (Falceta Jr, 2002)

O tratamento de várias doenças vem sendo feito com plantas há mais de 3000 anos a.C. Milhares de receitas empregando plantas medicinais eram usadas e, de lá para cá, quase não houve mudanças. As receitas atravessaram os séculos tendo apenas pequenas variações em suas formulações, ora com acréscimo de algumas ervas, outras vezes com a retirada de alguma das drogas vegetais mas, ainda assim, sempre presentes na vida da humanidade (Zatta, 1996).

Os problemas econômicos são bem conhecidos: fármacos industrializados possuem preços proibitivos para a população em geral (Gottlieb & Kaplan, 1993). A preparação de um fármaco aprovado pelo FDA americano em torno de 500 milhões de dólares para ser desenvolvida (Clay, 2000). Segundo a OMS, 80% da humanidade não tem acesso à medicina convencional, seja pelos preços, seja pela distância que residem dos centros urbanos. A utilização de plantas medicinais é uma prática generalizada na medicina popular brasileira, a qual é baseada no acúmulo secular de conhecimentos empíricos sobre a ação dos vegetais, por diversos grupos étnicos (Gottlieb & Kaplan, 1993).

Hoje, o uso de plantas medicinais não se restringe apenas às zonas rurais ou regiões desprovidas de assistência médica e farmacêutica. Elas são usadas intensamente no meio urbano como forma alternativa ou complementar aos medicamentos da medicina industrializada (Simões, 1996).

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Atualmente, a população das cidades acaba adquirindo os fitoterápicos no comércio, na maioria das vezes de fornecedores não adequados. Em virtude dessa falta de conhecimento, muitas vezes a população pode ser enganada pelos comerciantes, tanto voluntária quanto involuntariamente (Di Stasi, 1996).

Toda sociedade acumula um acervo de informações sobre o ambiente que a cerca, que vai lhe possibilitar interagir com ele para prover suas necessidades de sobrevivência. Nessa coleção de dados, inscreve-se o conhecimento relativo ao mundo vegetal com o qual estas sociedades estão em contato. É uma troca constante de informações sobre “qual chazinho faz bem para quê” ou “qual garrafada cura o quê”. Essa coletânea aumenta com a mistura de culturas; um país como o Brasil, por exemplo, tem um acervo de uso popular imenso, com influências trazidas pelos negros da África, pelos europeus desbravadores, que giravam o mundo em busca de especiarias e pelos índios, nativos dessa terra, que possuíam sua farmacopéia particular guardada com o pajé de sua tribo (Di Stasi, 1996).

A análise das tradições populares no uso de plantas medicinais faz parte do conjunto de objetivos de estudo da etnobotânica. A etnobotânica pode ser definida como a disciplina que se ocupa do estudo do conhecimento e das conceituações desenvolvidas por qualquer sociedade a respeito do mundo vegetal; este estudo engloba tanto a maneira como um grupo social classifica as plantas, como os usos que dá a elas. O interesse de conferir se as atividades anunciadas pela cultura popular são reais estimula a intedisciplinaridade, associando ao trabalho etnobotânico, o farmacológico e o químico (Di Stasi, 1996).

O potencial das plantas como fonte de novas drogas é ainda pouco explorado. Estima-se existir entre 250.00-500.000 espécies de plantas em todo o mundo, das quais uma porcentagem muito pequena foi submetida a estudo fitoquímico. As plantas contêm centenas ou milhares de metabólitos. Assim, a investigação fitoquímica de uma dada planta pode revelar apenas uma pequena porcentagem de seus constituintes (Hamburger & Hostettman, 1991).

Especialmente nos países em desenvolvimento, a população encontra nas plantas uma importante oportunidade de solução para seus problemas de saúde. Isso leva a um grande risco de envenenamento devido ao uso inapropriado ou excessivo dessas plantas. Um exemplo desse fato foi o uso para afecções do fígado de Symphytum officinale (Boraginaceae), conhecido popularmente como confrei. Estudos fitoquímicos revelaram que essa espécie é rica em alcalóides pirrolizidínicos, que causam obstruções nas veias do fígado (IPCS News, 1995)

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não se tem um controle de qualidade confiável das plantas medicinais que estão no mercado. Esse conjunto de fatos pode levar a conseqüências desastrosas.

Recentemente na Bélgica, um grupo de mulheres que estava ingerindo um chá emagrecedor de origem chinesa apresentou insuficiência renal e, nos casos mais graves, câncer das vias urinárias e até mesmo morte. A planta com efeito emagrecedor é Stephania tetranda, que foi trocada por Aristolochia fang-chi. A confusão deveu-se ao fato de que, em chinês, o nome vulgar das duas plantas é o mesmo, pinyin, e não se conhece metodologia para diferenciar as duas plantas. A intoxicação ocorre porque os ácidos aristolóquios (altamente cancerígenos) interagem com o DNA das células renais. Na Bélgica, foram 110 vítimas do equivoco e existem relatos de que o problema também tenha ocorrido na França, Japão, Espanha e Reino Unido (Laport, 2000).

Se problemas desse tipo ocorrem nos países europeus, onde a legislação é mais contundente com relação ao conhecimento das propriedades das plantas medicinais e ao controle de qualidade de fitoterápicos, o desconhecimento dos chás brasileiros pode estar causando problemas tão graves quanto os que ocorreram na Bélgica ou, na melhor das hipóteses, estamos desperdiçando novos medicamentos devido a esse desconhecimento.

Popularmente conhecem-se muitas plantas utilizadas no combate às úlceras gástricas. No entanto, as cientificamente mais estudadas são espécies do gênero Maytenus, conhecidas como espinheiras-santas (Carlini, 1988; Sannomiya et al., 1998).

Para melhor situar esse trabalho, que em grande parte avalia plantas utilizadas no tratamento popular de úlceras gástricas, apresentamos um breve apanhado sobre as úlceras: processo de formação e combate, plantas antiúlceras e modelos biológicos utilizados nos ensaios in vivo.

Atividade antiúlceras gástricas

Plantas

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Testes para avaliação de atividade antiúlcera

Para se estudar a atividade anti-úlceras é necessário encontrar modelos de indução de úlceras em animais de laboratório que simulem as principais causas de úlceras gástricas que atingem os seres humanos. Posteriormente, deve-se analisar o tratamento das lesões gástricas causadas com os extratos ou substâncias isoladas de plantas por via oral, intraduodenal ou intraperitoneal.

Hiruma-Lima (1998) apresenta uma revisão de modelos indutores de úlceras mais empregados em animais:

a) Solução ácido clorídrico/etanol: produz úlcera devido à ação necrosante na mucosa gástrica. b) Ligadura do piloro: induz lesões gástricas por estímulo e acúmulo de ácido no lúmen do estômago.

c) Uso de DAINE: causam lesões hemorrágicas na mucosa gástrica decorrentes da inibição da síntese de prostaglandinas, diminuindo os mecanismos de citoproteção da mucosa gástrica. Um exemplo de DAINE usado na indução de úlceras é a indometacina.

d) Agentes parassimpatomiméticos: sensibilizam a mucosa gástrica através do estímulo da secreção ácida e de pepsina, facilitando a irritação gástrica causada pelas DAINE. Um desses agentes é o betanecol.

e) Estresse: as alterações no fluxo sanguíneo da mucosa gástrica e o estímulo para a secreção ácida, têm sido apontados como os principais fatores do aparecimento de lesões gástricas.

Os animais utilizados para os testes de indução de úlceras são camundongos Swiss (25-35 g), ratos Wistar (150-250 g) todos aclimatados e preparados previamente para os testes.

Os testes biológicos orientaram a análise fitoquímica das plantas, indicando os extratos mais ativos a serem fracionados. Dependendo da polaridade do extrato, chás ou óleos essenciais, foram selecionados as técnicas cromatográficas mais adequadas para as separações.

O tratamento de úlceras (Silva, 1998)

A úlcera é o resultado da ruptura do equilíbrio entre forças defensivas/reparadoras e daquelas agressivas da mucosa gastroduodenal, bem como desgaste da mucosa (Lewis et al., 1991).

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úlcera é uma doença sócio-psicossomática, estando relacionada à personalidade do doente; assim, um medicamento pode aliviar os problemas, mas a cura pode depender de uma mudança radical dos hábitos do doente. Em alguns casos de tratamento recomenda-se até o uso de psicofármacos para um tratamento mais eficaz.

O tratamento clínico da úlcera baseia-se em auxiliar as forças reparadoras da mucosa gástrica ou duodenal e atenuar as forças agressivas mediante neutralização ou bloqueio da secreção clorídro-péptica, proteção da mucosa gástrica (efeito emoliente) e moderação da atividade motora gastroduodenal, além de tranqüilizar o paciente.

De modo geral, são utilizados cinco alvos farmacológicos para o tratamento das úlceras gástricas. (1) neutralização do ácido gástrico; (2) bloqueadores da secreção gástrica; (3) citoprotetores e reparadores da mucosa, (4) moduladores do esvaziamento gastroduodenal e; (5) psicofármacos.

Os alcalinizantes ou neutralizantes mais usados são Mg(OH)2, CaCO3 e Al(OH)3, mas esse tratamento não é o mais adequado, porque pH alto estimula a produção de gastrina que estimula as células parietais a produzirem mais HCl; este fenômeno é chamado de rebote ácido.

A célula parietal, produtora de HCl, pode receber estímulos da histamina, da gastrina e da acetilcolina; assim, os bloqueadores da secreção gástrica objetivam anular a ação dessas substâncias.É possível bloquear a secreção gástrica utilizando-se anticolinérgicos, bloqueadores dos receptores H2 da célula parietal e inibidores da bomba protônica. Os anticolinérgicos influenciam a motilidade estomacal retardando o esvaziamento gástrico e bloqueiam a secreção estimulada pela histamina; a atropina é uma substância anticolinérgica muito utilizada. Os bloqueadores dos receptores de H2 da célula parietal bloqueiam os receptores histaminérgicos tipo 2, provocando a diminuição da produção de HCl mediada pela histamina. Um exemplo desse tipo de droga é a cimetidina, utilizada em nossos testes como controle positivo.

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Materiais e métodos

Reagentes

Solventes PA:

Hexano, acetato de etila, tolueno, butanol, ácido acético, etanol, diclorometano, clorofórmio, metanol. Marca Synthlab.

Solventes grau HPLC: Metanol, acetonitrila, clorofórmio Merck e Mallinkrodt. Água purificada em sistema Milli Q.

Solventes deuterados: Clorofórmio, DMSO-D6, água deuterada, metanol-D4, marcas Merck, Aldrich, Sigma, Acros.

Reveladores para TLC: Anilsaldeído/H2SO4, sulfato cérico/H2SO4, NP/PEG, cloreto férrico 5% em metanol, idoplatinato e Dragendorff.

TLC: Silicagel em suporte de alumínio e/ou vidro Merck e Aldrich.

Equipamentos

RMN:

Espectrômetro Bruker DRX-600 - 600MHz.

Espectrômetro Varian Inova 500 e Inova 300, de 500 e 300 MHz, respectivamente. Espectrômetro Bruker AC 200 - 200MHz.

Experimentos 1D e 2D: COSY 1_H-1_{H, TOCSY-1D, HSQC e HMBC}

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LC10

Espectrômetro Fisons VG Platform de quadrupolo simples. Ionização Electrospray, 70 ou 100 V, modo positivo ou negativo.

HPLC Semipreparativo: Waters modelo 590, com injetor Rheodyne volume do loop: 100 µL e detector de índice de refração Waters modelo 401, atenuação 8x. Coluna: Water µBondapak C18 PN 84176 Fluxo: 2,0 mL/min Solventes: MeOH:H2O (65:35) multiplas injeções de 80 µL Registrador: The Recorder Company

HPLC-DAD-prep

Sistema Binário Varian Pro Star Bombas: modelo 210. PDA Detector Varian Pro Star modelo 330. Coluna Phenomenex 25 cm x 10 mm 5 µm RP18. Fluxo: 2,0 mL/min Solventes: MeOH:H2O, modo gradiente.

HPLC-DAD analítico:Sistema Binário Varian Pro Star Bombas: modelo 210. PDA Detector Varian Pro Star modelo 330. Coluna Microsorb 25 cm x 4,6 mm 100 Å RP18.

HPLC-RMN

HPLC-NMR- Bruker AMX 600 equipado com uma probe inversa para acoplamento com LC com volume de 120 µL. BPSU (Bruker Peak Sampling Unit) necessário para experimentos stopped-flow. Software Chromstar Software (Bruker, Rheinstetten, Germany). Coluna

Bischoff ProntoSil C

30

-Material com 25-40 µm

MS-MS

Espectrômetro Bruker Esquire-LC Ion Trap LC/MS(n)-System G1980AA (Bruker Daltonik, Bremen) - ES e APCI Interface HPLC-MS-Coupling : HP 1100

DCCC

Cromatógrafo Tokyo Rikakikai CO., equipado com 300 colunas de vidro 2,0 d.i. x 400 mm. Fluxo 10 mL/45 min.

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High Speed Countercurrent Chromatography P.C. Inc. equipado com coluna de teflon de 130 m X de 1,6 mm d.i. volume 285 mL. Sample Injector P.C. Inc. com loop de 16 mL Bomba FMI Q2

Sistema para GPC

Bomba peristáltica Pharmacia mod P1 18-1110-91; coluna de 1m x 3 cm preenchida com Sephadex LH-20; coletor de frações Pharmacia mod. RediFrac com capacidade para 95 frações; fluxo de 0,5 mL/min.

Extrações

Decocção

Decocção foi utilizada para preparação de extratos aquosos de cascas. Toda decocção foi preparada a 10% (m/v). O material vegetal moído foi colocado em água em ebulição por 15 minutos sendo deixado em repouso até que o extrato atingisse a temperatura ambiente. A solução foi filtrada em papel e concentrada em evaporador à pressão reduzida ou liofilizada.

Infusão

Infusão foi utilizada para preparação de extratos aquosos de folhas. As infusões foram preparadas a 10% (m/v). Às folhas moídas foi adicionada água fervente. O recipiente foi fechado e deixado em repouso até a temperatura ambiente. Em seguida, o extrato foi filtrado em filtro de papel e concentrado em liofilizador e/ou destilador à pressão reduzida.

Maceração

(25)

CC

As colunas de sílica foram montadas para a separação de 500 mg a 1,0 g de extratos em colunas de 2 cm d.i.. A quantidade de sílica empregada sempre perfazendo 30 vezes a quantidade de amostra. A aplicações foram realizadas pela impregnação do extrato em uma pequena quantidade de sílica posteriormente aplicada no topo da coluna. As eluições foram realizadas no modo gradiente escolhendo-se entre dois sistemas de solventes avaliados para cada caso por TLC: tol/AcOEt ou Hex/AcOEt. As frações foram coletadas pela observação das manchas eluídas e/ou por frações de 10 mL.

Coluna de Amberlite XAD-2

Os extratos aquosos depois de filtrados foram eluídos por coluna de Amberlite XAD-2 de 2,0 cm d.i. x 40 cm, na fase de adsorção foi realizada em um fluxo baixo. A dessorção foi feita em duas fases: a primeira com metanol/água (1:1) seguida pela passagem de metanol 100% pela coluna. Os extratos dessorvidos foram secados e fracionados para a análise de suas composições químicas.

GPC

Em média foram utilizados 2 g de extrato para a realização de cromatografia de filtração em gel. O extrato foi dissolvido em 8 mL de metanol, centrifugado e aplicado em coluna preenchida com Sephadex LH20 (1 m x 2,5 cm) eluída com metanol (0,5 mL/min), coletando-se automaticamente frações de 6 mL cada.

DCCC

(26)

HSCCC

A amostra é preparada dissolvendo-se 2,0 g de extrato em 16 mL de fase móvel. Inicialmente o sistema é preenchido com a fase móvel. Em seguida, com uma seringa de 20 mL o reservatório de amostra é preenchido com a solução da amostra. Inicia-se o bombeamento da fase móvel a 2 mL/min com a rotação em 850 rpm até que o sistema esteja em equilíbrio. Alcançado o equilíbrio a amostra é injetada. As frações são coletadas em coletor automático programado para coletas de 3 min.

HPLC semi-preparativo

As eluições foram realizadas no modo isocrático. As amostras foram preparadas dissolvendo-se as frações em metanol numa concentração de 100 mg/mL. Essa solução foi centrifugada duas vezes antes de ser injetada. A detecção foi por índice de refração ou UV, dependendo da natureza química das frações previamente analizadas por TLC.

Material Vegetal

Plantas antiúlceras: As espécies foram coletadas pela prof.ª Clelia A. Hiruma Lima em Palmas (TO). A identificação foi realizada pela prof.ª Solange de Fátima Lólis. Exsicatas foram depositadas no Herbário da Fundação Universidade do Tocantins com os seguintes números de voucher: Alchornea castaneifolia Willd A. Juss (Euphorbiaceae) - TO4321; Curatella americana L. (Dilleniaceae) - TO1637; Hancornea speciosa Gom. (Apocynaceae) – TO4064.

Quassia amara L. (Simaroubaceae) foi coletada pela equipe de botânicos do Instituto Enda-Caribe em Santo Domingo, República dominicana; voucher BP 165 F 97323.

Espécies de Ilex (Aquifoliaceae): As especies foram coletadas em Bertioga - SP, e identificadas pela prof.ª Lucia Rossi, do Instituto de Botânica de São Paulo.

I. theezans Mart. ex Reissek, praia do Itaguaré, uma exsicata foi depositada no herbário do IB/USP com voucher SPF 430.

Ilex amara (Vell.) Loes. Praia de Guaratuba, Fazenda Três Irmãos, estrada da captação, uma exsicata foi depositada no herbário do IB/USP com voucher SPF434.

(27)

(28)

Capítulo 1:

Quassia amara

(Simaroubaceae)

Quassia amara, da família Simaroubaceae, é uma pequena árvore de 2-6 m, natural da região norte do Brasil e toda região amazônica (Fig.1.1). Na floresta amazônica Q. amara é muito usada como “quina” (Cinchona spp.), contra malária e febre. Ela cresce em regiões onde a “quina” não cresce e contém algumas das substâncias ativas da quina. Q. amara também é usada como inseticida, como tônico e contra febres e hepatite (Rutter, 1990). Os indígenas amazônicos se banham com suas folhas para curar sarampo (Brabch et al., 1983) e usam como desinfetante bucal após a extração de dentes. A medicina popular utiliza cascas de Q. amara como tônico e aperitivo. É recomendada contra diarréia, disenteria, dispepsia, blenorragia, gases intestinais, dores de estômago, anemia, desordens no fígado e do trato gastrintestinal (Duke et al., 1994).

A composição química de Q. amara é bastante conhecida, incluindo algumas substâncias amargas conhecidas como quassinóides (Ohmoto et al., 1989; Diadanamwa et al., 1993; Grieco et al., 1994), alcalóides _β-carbolínicos (Ajaiyeoaba et al., 1994), alcalóides indólicos, triterpenos e esteróides, cantin-6-onas (Njar et al.,1993; Ouyang et al., 1994). Os quassinóides e alcalóides cantinônicos são os principais constituintes bioativos (Njar et al., 1995).

(29)

Molecular e Funcional do Departamento de Fisiologia do IB/Unicamp, fazendo-se o isolamento e identificação das substâncias e uma série de testes biológicos - DL50, toxicidade aguda in vivo e in

vitro, atividade antiulcerogênica, atividades narcóticas, mecanismos de ação das atividades biológicas - a partir dos extratos, frações e substâncias isoladas.

Apesar de nosso projeto estar voltado principalmente para extratos polares de plantas medicinais e, dentre esses extratos, principalmente os aquosos, infusão ou decocção, os resultados da atividade analgésica apresentados pelos extratos apolares foram mais expressivos do que aqueles polares, o que nos estimulou a estudar fitoquímicamente os primeiros. Investigamos a composição química dos extratos hexânico e diclorometânico das cascas de Q. amara e realizamos a análise dos extratos brutos por HPLC-ES-MS.

1.1. Experimental / Resultados / Discussões

1.1.1. Ensaios biológicos

Preparação dos extratos utilizados nos ensaios biológicos

Quinhentos gramas de pó de cascas de Q. amara foram inicialmente macerados com 3 L de hexano por uma semana. A solução hexânica foi filtrada em gaze e em papel e evaporada em rota-evaporador (30o_{C). Procedimento idêntico foi usadopara fornecer, respectivamente, extratos} diclorometânico, etanólico e hidroalcoólico. Os extratos foram enviados para o grupo de pesquisa da prof. Dra. Alba R. M. Souza Brito (IB/Unicamp) para avaliações biológicas, visando um direcionamento para o estudo dos extratos. Foram realizados testes de analgesia utilizando-se analgésicos-padrão como controle positivo e extratos administrados na dose de 100 e 250 mg/kg em um volume final de 10 mL/kg, pelas vias oral e intraperitonial. Os testes realizados foram o de placa quente, antagonismo aos receptores opióides e edema de pata induzido por carragenina. Nos teste foram usados camundongos Swiss machos (25-35 g) previamente preparados para os testes.

(30)

Testes de analgesia

Teste de Placa Quente e antagonismo aos receptores opióides

Este teste é utilizado para determinar a latência pelo método de Eddy e Leiback (1953). Nesse teste é cronometrado o tempo decorrente entre o primeiro contato do animal com a placa quente até o momento em que o mesmo lambe as patas dianteira ou dá saltos repentinos, indicando o estímulo de dor. O teste para análise da participação do sistema opióide é realizado com a mesma metodologia do teste de latência; no entanto, os animais são tratados 15 min antes da aplicação das drogas (extratos e controles) com naloxana (5 mg/kg, intraperitonial)

Edema de pata induzido por carragenina

O experimento é realizado conforme descrito por Henriques et al. (1987). Os animais são pré-tratados com os extratos nas doses 100 e 250 mg/kg por via oral. Depois de 30 min provoca-se um edema em uma das patas posteriores do animal com a injeção de 250 µg de carragenina (1% em suspensão salina 0,9% estéril), para se ter um controle do aumento do peso da pata provocado pelo edema, a pata contralateral recebe volume similar de solução salina 0,9% estéril. Três horas após a administração de carrigenina os animais são sacrificados, as patas amputadas e pesadas. O edema da pata é determinado pela diferença de peso entre a pata que recebeu salina e aquela que recebeu carragenina.

Resultados

dos ensaios

(31)

tratados com morfina subcutânea (10 m/kg), etanol 70%, etanol (EtOH), diclometano (DCM), hexano (HEX) das cascas de Q. amara L. por via oral na dose de 100 mg/kg.

Observação Latência (s)

(min) Controle Morfina EtOH 70% EtOH DCM HEX

0 4,5±0,5 3,9±0.2 4,0±0,3 4,0±0,5 3,3±0,3 4,7±0,5 30 5,2±0,5 13,9±2,7** 4,1±0,6 3,4±0,4 4.2±0,6 7,4±1,2 60 3,5±0,3 12,7±2,6** 5,1±0,6 4,4±0,4 6,6±0,8 2,8±1,1 90 4,8±0,6 10,0±1,4** 5,5±0,6 4,0±0,3 5,2±2,4 6,4±0,3 120 5,5±0,6 8,6±1,3* 6,3±0,6 5,0±0,3 6,8±2,5 7,2±0,4 240 6,3±1,1 7,0±0,6 7,5±0,8 6,3±0,5 9,7±1,0 7,5±1,5

Diferenças estatísticas estabelecidas em comparação com o tempo 0 de observação para cada grupo de 5-6 animais. ANOVA F(5,29) 30 min = 10,861; 60 min = 8,146; 90 min = 7,409; 120 min = 2,708 p<0,05; Teste de Dunnet, *p<0,05; **p<0,001.

Tabela1.2: Evolução temporal da latência (s), no teste de placa quente, em camundongos pré tratados com morfina subcutânea (10 m/kg) e etanol 70%, etanol (EtOH), diclometano (DCM), hexano (HEX) das cascas de Q. amara L. por via oral na dose de 250 mg/kg.

0 3,3±0,2 3,3±0.2 3,0±0,2 3,0±0,1 3,4±0,1 3,2±0,1 30 4,5±0,4 11,9±1,3 5,2±0,3 5,0±0,5 5,0±0,5 5,2±0,7 60 5,7±0,3 10,8±1,0 5,1±0,6 6,1±0,5 5,0±0,9 5,3±1,0 90 5,6±0,6 13,1±1,7 5,4±0,5 5,0±043 6,3±1,1 6,2±1,2 120 5,8±0,4 9,4±1,0 6,4±0,6 6,6±0,5 5,9±1,0 7,3±1,4 240 5,8±0,4 5,4±0,4 4,9±0,4 5,1±0,2 5,3±0,5 5,5±0,4

(32)

Tabela1.3: Evolução temporal da latência (s), no teste de placa quente, em camundongos pré tratados com morfina subcutânea (10 m/kg) e etanol 70%, etanol (EtOH), diclometano (DCM), hexano (HEX) das cascas de Q. amara L. por via intraperitonial na dose de 100mg/kg.

0 2,5±0,1 2,7±0.1 3,1±0,3 3,0±0,2 3,1±0,1 3,2±0,2 30 3,2±0,2 8,5±1,8** 4,4±0,3 3,9±0,3 5,0±0,8 4,1±0,3 60 3,8±0,2 12,6±0,9** 6,0±0,5 5,0±0,4 6,3±1,1 6,4±0,8 90 4,5±0,3 10,8±1,1* 6,1±0,4 5,7±0,5 7,4±0,7* 8,4±0,8** 120 5,7±0,4 10,4±1,5** 6,1±0,4 6,2±0,5 6,7±0,9 7,3±0,6 240 3,7±0,2 4,6±0,5 4,5±0,5 4,4±0,4 5,6±1,0 5,1±0,5

Diferenças estatísticas estabelecidas em comparação com o tempo 0 de observação para cada grupo de 8 animais. ANOVA F(5,42) 30 min = 5,429; 60 min = 18,115; 90 min = 10,154; 120 min = 4,055 p<0,05; Teste de Dunnet, *p<0,05; **p<0,001.

Tabela1.4:Evolução temporal da latência (s), no teste de placa quente, em camundongos pré tratados com morfina subcutânea (10 m/kg) e etanol 70%, etanol (EtOH), diclometano (DCM), hexano (HEX) das cascas de Q. amara L. por via intraperitonial na dose de 250mg/kg.

(33)

tratados com com naloxana (5 m/kg)após tratamento com morfina subcutânea (10 m/kg) e ao extratos hexânico (HEX) e diclometânico (DCM), das cascas de Q. amara L. por via intraperitonial nas doses de 100 mg/kg e 250 mg/kg.

(min) Controle Morfina HEX 100 DCM 100 HEX 250 DCM 250 0 3,0±0,2 3,2±0.1 3,6±0,3 3,1±0,1 3,3±0,1 3,6±0,3 30 4,4±0,3 4,8±0,3 4,3±0,2 4,5±0,5 4,5±0,4 3,7±0,2 60 4,6±0,2 6,4±0,8 4,7±0,3 5,2±0,6 5,1±0,3 4,9±0,4 90 4,5±0,3 10,8±1,5 6,1±0,4 5,7±0,5 7,4±0,7 8,4±0,8 120 4,4±0,4 5,7±1,0 5,2±0,5 4,6±0,5 3,8±0,3 5,0±0,4 240 5,7±0,8 5,1±1,0 5,8±0,6 4,4±0,4 5,9±0,3 5,2±0,4 Diferenças estatísticas estabelecidas em comparação com o tempo 0 de observação para cada grupo de 8 animais. ANOVA F(5,42) 0 min = 1,714; 30 min = 1,370; 60 min = 1,712; 90 min = 0,763; 120 min = 1,544; 240 = 0,264 p<0,05; Teste de Dunnet, *p<0,05; **p<0,001.

Quando os extratos foram administrados por via intraperitoneal, no teste de placa quente, foram observados resultados significativos quando comparados ao grupo controle. O extrato hexânico apresentou atividade em ambas as doses testadas - 100 e 250 mg/kg - sendo esta atividade dose-dependente. Pelos tempos de observação notou-se que o efeito, na dose 250 mg/kg, permanece por mais tempo. O extrato diclorometânico apresentou atividade apenas na dose 100mg/kg, tendo efeito pelo mesmo período do extrato hexânico.

Os animais tratados com naloxana 15 min antes da administração dos extratos tiveram os efeitos observados acima inibidos; assim, é possível de que as substâncias presentes nos extratos apresentem afinidade por receptores opióides.

(34)

1.1.2. Análise fitoquímica de

Quassia amara

Os extratos foram preparados por maceração em hexano, diclorometano etanol e etanol 70%, a partir de 3 kg de cascas secas e moídas. O extrato selecionado para fracionamento devido sua atividade biológica foi o hexânico, que na preparação rendeu 3 g (0,1%).

Fracionamento do extrato hexânico.

Quinhentos miligramas do extrato hexânico foram fracionados por CC eluídas com misturas de hexano/acetato de etila. Foram coletadas 60 frações que foram analisadas por TLC (Silica; hexano/acetato de etila 8:2). As frações semelhantes e que se apresentaram mais puras foram analisadas por RMN H e por ES-MS.

Qa1

O espectro de RMN 1H mostrou picos na região entre δ 0,68 e δ 2,29, com o pico mais intenso em δ 1,25. Esse perfil é compatível com a presença de derivados de ácidos graxos de cadeia longa misturados a terpenos. O quarteto próximo a δ 4,10 é característico de H presente em carbono oxigenado, como por exemplo o hidrogênio da posição 3 dos triterpenos e esteróides. Os sinais na região de δ 5,0 - 5,36 são referentes a hidrogênios de ligações duplas, o que também é comum em derivados de ácidos graxos, triterpenos e esteróides. Um conjunto de sinais é visível na região entre δ

7,46 e δ 7,82, caracterizando a presença de substâncias aromáticas. Tendo em vista a presença de alcalóides cantinônicos e indólicos em Q. amara (Njar et al, 1993; Barbetti et al, 1990; Barbetti et al, 1993), é possível que essas substâncias sejam as responsáveis por esse conjunto de sinais.

Foram registrados os espectros de ES-MS nos modos positivo e negativo. O sinal em

(35)

da coronaridina, de relativamente ampla ocorrência.

Qa2

O espectro de RMN 1H mostrou sinais entre δ 0,66 e δ 2,27, característicos de triterpenos ou esteróides. Os sinais próximos a δ 3,7 são referentes ao H-3 desses metabólitos. Os sinais na região entre δ 5,0 e δ 5,31 são referentes aos hidrogênios de ligações duplas, comuns em triterpenos e esteróides. Esses sinais são semelhantes àqueles do sitosterol e do estigmasterol (Fig. 1.2), sendo que o sinal em δ 5,31 refere-se ao H-6, enquanto que o multipleto em redor de δ 5,0 refere-se aos H-22 e H-23 do estigmasterol.

O espectro ES-MS registrado no modo positivo, mostrou um pico com m/z 413, que pode ser referente ao íon [M+H]+_{Perda de uma metila a partir da molécula não-protonada leva ao} fragmento [M-CH3]+ com m/z 397.

Esses conjuntos de sinais dos espectros mencionados acima são compatíveis tanto com o estigmasterol, quanto com a sitostenona, a qual já foi isolada de Q. amara (Lavie & Kaye, 1963).

Qa3

O espectro de RMN 1H mostrou um sinal intenso em δ 1,18, característico de grupos CH2 de derivados de ácidos graxos acompanhado por picos de menor intensidade entre δ 0,72 e δ 2,27. Sinais menos intensos na região de δ3,5 - 4,2 são coerentes com o H-3 de triterpenos e esteróides, cuja posição 3 é hidroxilada. Os sinais em redor de δ 5,0 - 5,3 são referentes a hidrogênios olefínicos, semelhantes aos discutidos anteriormente. Assim, é possível que essa fração seja composta por mistura de derivados de ácidos graxos e de terpenos/esteróides.

O espectro ES-MS no modo positivo também apresentou pico em m/z 411, referente ao pico [M-H]- de esteróide semelhante ao estigmasterol ou à sitostenona. Analogamente, o pico em

(36)

Qa4

O espectro de RMN 1_{H mostrou perfil semelhante àqueles de derivados de ácidos} graxos: um sinal intenso em δ 1,23, sinais distribuídos entre δ 0,66 e δ 2,32 e um sinal aparentando um tripleto em δ 5,34. Não há vestígios de substâncias aromáticas. Pode-se perceber a presença de outras substâncias - provavelmente de natureza terpênica - ao longo de toda a região entre δ 0,66 e δ

5,5. Particularmente na região entre _δ 0,66 e _δ 1,09 há evidência de sinais referentes a metilas. Embora não haja a integração, as intensidades desses sinais são coerentes com aquelas referentes aos H-3 e aos hidrogênios situados em ligações duplas, muito menos intensos.

Os espectros ES-MS nos modos positivo e negativo sugeriram um fragmento comum de m/z 468: o espectro no modo positivo mostra [M+H]+ com m/z 469; no espectro no modo negativo, esse pico tem m/z 467. A perda de uma metila a partir da molécula não-protonada levou ao íon [M-CH3] com m/z 453, tanto no modo positivo, quanto no negativo. Esses resultados correlacionam-se com aqueles esperados para moléculas derivadas do acetato de α-amirina, de β -amirina (Fig. 1.2) ou moléculas afins. Contudo, foi possível a visualização de fragmentos com m/z

maiores do que 468 nos dois espectros. Particularmente informativo foi o espectro no modo negativo, que sugeriu a presença de outras hidroxilas ligadas ao núcleo fundamental, levando a perdas de moléculas de água: perda de duas moléculas de água a partir do íon de m/z 521 leva ao fragmento de

m/z 485, enquanto a perda de uma terceira molécula de água leva ao íon de m/z 467.

Análise do extrato hexânico por HPLC-ES-MS

Cinqüenta miligramas do extrato foram dissolvidos em acetonitrila. A solução foi filtrada em filtro Millex de 0,45 µm e 20 µL foram injetados diretamente no sistema, operando a +70V. A eluição foi feita com mistura de Acetonitrila/água 30:70, com fluxo de 1 mL/min, em coluna C18 de 25 cm x 4,6 mm x 5µm.

(37)

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 Time 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 413 435 9.45 4.65 4.05 2.27 1.43 0.48 3.35 5.91 5.45 6.47 7.21

7.98 10.54 _12.08 13.34_14.18

LULU08 Sm (Mn, 2x3) Scan ES+

389-391 615

9.73

6.05

0.80 1.57 2.79 3.81 4.755.35 6.58 7.84 8.58 10.5411.59 12.19 12.7813.90

391-389 2.87e3 9.31

5.94 11.17

TIC 3.25e5 2.41

0.06 4.72 6.05 9.66

12.82

Fig. 1.3: HPLC-ES-MS do extrato hexânico de Q. amara com TIC, BPI, e cromatogramas extraídos dos íons de m/z 391-389,

Quassia Hex lcms ESI + 70 V

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Da/e 0

100

%

LULU08 276 (9.697) Cm (274:288-137:183) Scan ES+

3.42e3 223 191 177 145 82 237 389

297 329 411 443 473 ₅₃₇₅₇₂ ₈₂₇

Quassina

Quassia Hex lcms ESI + 70 V

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Da/e 0

100

%

LULU08 264 (9.276) Cm (252:266-347:419) Scan ES+

1.64e3 391 207 56 165 121 58 373 329 221 313 269 392

441445475 561 616657689693 786798 839894925946984 1000

Neoquassina

(38)

O cromatograma extraído do íon de m/z 391-389 detectou a neoquassina (PM = 391), enquanto que o cromatograma extraído do íon de m/z 389-391 detectou a quassina (PM = 389). Essas duas substâncias são encontradas em Q. amara (Nestler et al, 1980), mas não foram identificadas nas frações anteriormente mencionadas, referentes ao estudo químico do extrato hexânico. Os cromatogramas mostram que ambas estão presentes no extrato hexânico, que apresentou atividade. Os espectros da neoquassina e o da quassina estão apresentados na Fig. 1.4.

(39)

CH3

O H

C

H₃ _CH

3 C H3 C H3 H H H H sitosterol CH3 CH3 O H C H3 CH3 CH3 H H H estigmasterol

acetato de β-amirina

CH3 CH3 CH3 CH3 C H3 AcO CH3 CH3 C H3 H H H quassina O O O O O O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 C H3 H H H H O O O OH O O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 C H3 H H H H neoquassina CH3 CH3 CH3 CH3 C H3 AcO CH3 C H3 CH3 H H H

acetato de α-amirina

Fig. 1.2.: Substâncias identificadas em Quassia amara. sitostenona

CH3

O

C

H3 CH₃

(40)

Capítulo 2:

Alchornea castaneifolia

(Euphorbiaceae)

A. castaneifolia Willd. A. Juss. (Euphorbiaceae) é conhecida popularmente como sarã, sarão, gurupiá. Encontra-se distribuída do AM a BA e MT, leste do Brasil, GO. Apresenta-se na forma de arbusto ou arvoreta 1-6 m de altura (Fig. 2.1) sendo relatado indivíduos de 10 m na Argentina. É unissexuada, florescendo em março e agosto e frutificando em julho e novembro. Ocorre abundantemente em beira de rios, solos arenosos e argilosos. É importante colonizadora de areia e fixadora de barranco de rio; é importante na formação de mata ciliar na margem que recebe deposição, sendo assim indicada para recuperação de margem de rio (Pott & Pott, 1994).

Na medicina popular, A. castaneifolia é utilizada na forma de infusão de meia xícara de folhas ou decocto de 1 colher de sopa de cascas 1-3 ao dia, ou ainda, 2-3 mL duas vezes ao dia da tintura 4:1. A planta é empregada no tratamento de reumatismo, artrite, resfriados e dores musculares pelos indígenas da Amazônia (Duke et al., 1994), no aumento a fertilidade feminina (De Feo,1992) e como analgésico para as dores de articulações em forma de cataplasma (Schultes et al., 1990). Um levantamento etnofarmacológicas realizado no Tocantins indicou que uso de A. castaneifolia para afecções gástricas (Hiruma-Lima, 2000, comunicação pessoal). Por esse motivo foram realizados ensaios antiúlceras com esta planta para se averiguar sua atividade.

Fig. 2.1: Alchornea casteneifolia Willd. A. Juss. (Euphorbiaceae).

(41)

levantamento bibliográfico, não se encontrou estudos químicos dessa planta. Trabalhos realizados com Alchornea cordifolia revelaram a presença de alcorneina, alcorneinona, ácido antranilico, ácido gentísico, isoalcorneina, yoimbina e outros alcalóides (Ogungbamila, et al., 1990). Tona et al. (1998), em uma triagem de plantas medicinais do Congo, detectaram flavonóides, taninos, esteróides e terpenos, saponinas e alcalóides em Alchornea cordifolia. Setzer et al. (2000) reportam a presença dos triterpenóides taraxerona, friedelina, epifriedelinol, taraxerol, seco-3,4-friedelina e seco -3,4-taraxerona no extrato clorofórmico de Alchornea latifolia. Os dois últimos triterpenoides, que apresentam o anel A aberto, mostraram atividade citotóxica in vitro contra células humanas cancerosas e potente inibição da topoisomerase II.

2.1. Experimental / Resultados / Discussões

2.1.1Ensaios biológicos

Preparação dos extratos para os ensaios biológicos:

Duzentos gramas de casca e de folhas de A. castaneifolia foram moídos em moinho de facas e macerados com 2 L de etanol. A solução alcoólica foi filtrada em gaze e papel e posteriormente secada à pressão reduzida em rota-evaporador à temperatura de 45o_{C rendendo 2 g} (1,0%) de extrato de cascas e 3 g (1,5%) de extrato de folhas.

Avaliação do extrato etanólico de A. castaneifolia

(42)

Tabela 2.1: Efeitos do lanzoprazol e do extrato etanólico de cascas e folhas de A. castaneifolia em úlceras induzidas por HCl/etanol em camundongos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos (p.o.)

Dose (mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlcera (mm)

Inibição %

Controle - 11 3,77 ± 0,32 67,5 ± 3,25 -

Lanzoprazol 30 11 5,91 ± 0,38* 21,5 ± 4,02* 68,1

Folhas Cascas 1000 1000 6 6

3,75 ± 0,44 2,17 ± 0,49*

8,17 ± 5,44* 9,50 ± 5,27*

87,9 85,9

ANOVA F(3,30) = 43,1 (P< 0,001) para o índice de úlceras e = 17,5 (P< 0,001) para pH. Teste de Dunnett: * P<0,001.

Tabela. 2.2: Efeitos da cimetidina e do extrato etanólico de cascas e folhas de A. castaneifolia em úlceras induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos (p.o.)

Dose (mg kg-1₎

n pH

(unidade)

Inibição %

Controle - 11 2,45 ± 0,23 38,3 ± 2,13 -

Cimetidina 100 11 3,55 ± 0,05* 14,5 ± 2,02** 62,1 Folhas Cascas 1000 1000 6 5

2,33 ± 0,32 3,20 ± 0,35

14,5 ± 2,89** 15,4 ± 3,17**

62,1 59,8

(43)

modelo de indução de úlceras gástricas por HCl/etanol em camundongos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos (p.o.)

Dose (mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlceras (mm)

Inibição %

Controle - 11 3,77 ± 0,37 67,5 ± 4,02 -

Lanzoprazol 30 11 5,91 ± 0,38* 21,5 ± 4,01* 68,1 Extrato 1000

500 250

6 6 6

3,75 ± 0,11 4,33 ± 0,39 5,67 ± 0,03*

8,17 ± 2,80* 24,7 ± 5,44* 60,0 ± 5,44

87,9 63,4 11,1

ANOVA F:(4,35) = 30,8 (P< 0,05) para os índice de úlceras e = 6,04 (P< 0,05) para pH. Teste de Dunnett: * P<0,01.

Pelos resultados apresentados nas tabelas 2.1, 2.2 e 2.3, notamos que os extratos de A. castaneifolia inibem a formação de úlceras. É necessário ressaltar que a dose necessária para se atingir tais resultados foram altas (1000 mg/kg) quando comparadas com o controle positivo de lanzoprazol (30 mg/kg), para as úlceras induzidas por HCl/etanol, e contra 100 mg/kg de cimetidina para aquelas induzidas por indometacina/betanecol.

(44)

2.1.2. Estudo fitoquímico:

No esquema (Fig. 2.2) abaixo está apresentado de forma resumida os processos de extração e fracionamento dos constituintes químicos de A. castaneifolia.

A.castaneifolia

Folhas - 400 g

5,0 g (1,25%)

2,0 g

25 frações

*

Ac2 (15 mg), Ac3 (8 mg) e Ac4 (5 mg)

3 L EtOH

Alíquota

Sephadex LH20 MeOH

HPLC semi -preparativo

*

juntadas depois de análise por TLC

Fig. 2.2: Esquema resumido do procedimento experimental da análise fitoquímica de A. castaneifolia .

A.castaneifolia

Cascas - 400 g

7,0 g (1,75%)

2,0 g

40 frações

*

Ac1

(20 mg) 3 L EtOH

Alíquota

Sephadex LH20 MeOH

(45)

O espectro de RMN 1H apresenta sinais na região de H aromáticos entre δ 6,5 e δ 8,0. Análise acurada dessa região do espectro permite a identificação de dois anéis aromáticos. Um deles possui um sistema A2X2 em δ 6,7 (J = 8Hz) e δ 7,7 (J = 8 Hz), caracterizando um anel substituído. O outro exibe um sistema ABX em δ 7,48 (J = 2 Hz), δ 7,40 (J = 8 e 2 Hz) e δ 6,72 (J = 8 Hz), mostrando um anel trissubstituído. O espectro COSY H-H com supressão de sinais confirma essas proposições e mostra um sinal adicional em δ 3,77.

O espectro ES-MS (70V,NI) mostra o íon pseudo-molecular [M-H]- com m/z 215, compatível com a fórmula molecular C13H12O3. O pico com m/z 93 corresponde ao anel A. O pico de

m/z 108 pode ser devido ao anel B, referente ao p-metilfenol formado pela fragmentação no sistema benzílico do Anel B.

A partir desses resultados, sugerimos para Ac1 a estrutura apresentada na Fig 2.3.

Ac2

A revelação das placas cromatográficas com NP/PEG forneceu indícios de que a substância Ac2 poderia ser um flavonóide.

O espectro de massas de Ac2 apresenta pico pseudo-molecular [M+H]+_{= 464. Perda} de 162 u leva ao pico base [M-hex]+_{= 303 = [A + H]}+_{. Essa perda é referente a uma hexose, podendo} ser glicose ou galactose.

O espectro RMN 1H (Fig 2.4) apresenta sinais na região de absorção dos sinais de hidrogênios aromáticos. Em δ 7,65 observa-se um duplo dubleto (J = 8,5 e 2,0 Hz), em δ 7,52 um dubleto de J = 2 Hz, em δ 6,80 um dubleto de J = 8,5 Hz. Esses sinais podem ser atribuídos respectivamente aos hidrogênios H-6’, H-2’e H-5’, característicos em um sistema ABX de substituição em anéis aromáticos. Ainda na região de hidrogênios aromáticos, observamos dois dubletos de J = 2 Hz em δ 6,39 e outro em 6,19, atribuídos a H-8 e H-6 do flavonóide. Em δ 5,35 é observado o dubleto (J = 8,0 Hz), atribuído ao hidrogênio anomérico da molécula.

(46)

O conjunto dos dados do espectro de massas e de RMN permitiram identificar o flavonóide Ac2 como a quercetina -3-O-β-D-galactopiranosideo (Fig 2.3).

Ac3

Ac3 também apresenta mancha amarela quando revelada com NP/PEG, característico de flavonóides.

No espectro ES/MS observa-se o pico pseudo-molecular m/z 435 [M+H]+ a perda do açúcar é de 132 u, o que equivale a perda de uma unidade de arabinose, gerando o pico da quercetina

m/z 303 [A + H]+_.

O espectro de RMN 1_{H de}_Ac3₍_{Fig 2.5}_{) apresenta sinais semelhantes aos de}_Ac2_na região dos aromáticos, confirmando que a aglicona é a quercetina. Observa-se o hidrogênio anomérico em δ 5,25 (d, J = 5 Hz). A constante de acoplamento indica que o açúcar apresenta configuração α. Assim, identificamos Ac3 como a quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosídeo (Fig 2.3) (Harborne, 1993).

(47)

Ac4

Ac4 também apresentou revelação para flavonóide quando pulverizado com NP/PEG. Na região de absorção de hidrogênios aromáticos no espectro de RMN 1H de Ac4 (Fig 2.6) observam-se apenas 3 sinais: dois dubletos de J = 2 Hz em δ 6,30 e 6,19, respectivamente atribuídos a H-8 e H-6 do anel A do flavonóide. O sinal em δ 7,18 (s, 2H), possivelmente pertencente

(48)

a um anel aromático com padrão de substituição A2, indicou que o anel B é simétrico e substituído nas posições 3’, 4’ e 5’. Assim, esse sinal foi atribuído a H-2’/H-6’ do anel B de uma unidade de miricetina. Comparando-se os espectros de RMN 1H de Ac2 e Ac3, observa-se que os sinais dos hidrogênios dos açúcares são iguais. No ES/MS observamos o pico do íon pseudo-molecular m/z 451 [M+H]+_{, a perda do açúcar produz o pico}_m/z_{319 [M-ara+H]}+_{= [A+H]}+_{da aglicona. Assim, podemos} identificar Ac4 como miricetina-3-α-L-arabinopiranosídeo (Fig 2.3) (Harborne, 1993).

(49)

Ac1 93 ₁₀₇

109 O

H O H

O H

Ac3

O

H

O

H

O

H

O

H

O

ara

Ac4

O

OH

Oara

O

OH

HO

Fig. 2.3.: Substâncias identificadas em Alchornea castaneifolia. Ac2

O

OH

O

OH

Ogal

1

4 5

8

9

10

(50)

Capítulo 3:

Curatella americana

L. (Dilleniaceae)

Curatella americana L. é uma espécie da família Dilleniaceae. Apresenta-se como árvore ou arbusto tortuoso de 1 a 12 m em cerradão (Fig. 3.1). É conhecida popularmente como lixeira, cajueiro-bravo, cajueiro-do-mato, cambarba, caimbé, marajoara, pentieira, sabeiba e sobro (Lorenzi, 1992),

C. americana ocorre freqüentemente em cerrados com solos arenosos. Cresce na Amazônia e é de ampla dispersão neotropical em savanas, cerrados, matas secas, semidecíduas e tabuleiros (Pott & Pott, 1994). Apesar da plântula frágil e crescimento inicial lento, é invasora de pastagem (Lorenzi, 1992).

C. americana floresce nos meses de agosto e setembro, e frutifica em outubro e novembro. Sua casca grossa a protege contra fogo. As folhas são ásperas por apresentarem cristais de ácido silícico.

São conhecidas várias utilidades de C. americana. É usada como planta forrageira de emergência para vacas, pois não é tóxica, com composição de 8% de proteínas, 0,35% Ca, 0,16% P, 0,23% Mg, 11 ppm Cu e 17 ppm Zn. O arilo branco de seu fruto é comestível com sabor suave e

(51)

dispersoras. C. americana também tem importância na apicultura e apresenta valor ornamental. Sua madeira é usada para pilão; é pesada, compacta com fibras revessas, muito durável ao tempo; serve para marcenaria, carpintaria, tornearia, canga, sela, escultura, lenha e carvão. A folha é usada como lixa para utensílios de chifre, panela, madeira, unhas etc.

No levantamento bibliográfico realizado nos sistemas eletrônicos Web of Science,

Current Contents e Probe não foi encontrado nenhum trabalho químico sobre C. americana. Uma triagem das plantas do Mato Grosso do Sul indicou a presença de triterpenóides e esteróides nas folhas e de corantes e taninos (usados no curtimento) nas cascas do tronco (Honda et al., 1990).

A medicina popular usa o decocto de cascas de C. americana para lavar feridas e úlceras, inclusive de gado. É tida como medicinal contra artrite, diabetes e pressão alta. As flores são usadas contra tosse, bronquites e resfriados. No fruto, a parte vermelha apresenta um corante e suas cerdas são irritantes, causando alergia. (Lorenzi, 1992). Informações etnofarmacológicas indicam que o macerado de C. americana em água por uma noite é intensamente usado para afecções gástricas na região de Tocantins (Hiruma-Lima, 2000, comunicação pessoal). Por esse motivo foram realizados ensaios antiúlceras com esta planta para se averiguar sua atividade.

3.1. Experimental / Resultados / Discussões

3.1.1. Ensaios biológicos

Os extratos de C. americana foram testados em relação às suas atividades antiúlceras gástricas nos modelos de HCl/etanol, indometacina/betanecol de acordo com os procedimentos descritos na literatura (Souza Brito & Nunes, 1997).

Preparação dos extratos para os ensaios biológicos

(52)

Avaliação do extrato etanólico de C. americana

Os resultados dos ensaios realizados estão apresentados nas Tabelas 3.1, 3.2 e 3.3 com C. americana.

Tabela 3.1: Efeitos do lanzoprazol e de diferentes doses de extrato etanólico de casca de C. americana em úlceras induzidas por HCl/etanol em camundongos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos (p.o.)

Dose (mg kg-1₎

n pH

(unidade)

Inibição %

Controle - 10 3,65 ± 1,20 77,3 ± 9,64 -

Lanzoprazol 30 10 6,0 ± 1,05** 21,8 ± 10,65 72

Extrato 1000 500 250 100

7 7 5 5

3,08 ± 1,48 4,60± 1,34 3,86 ± 1,35 4,20 ± 1,10

9,86 ± 3,63** 23,0 ± 11,0 ** 54,8 ± 21,3*

78,3 ± 8,37

87 70 29 -1,3

(53)

Tabela 3.2: Efeitos da cimetidina e de diferentes doses de extrato etanólico de cascas de C.

americana sobre o modelo de indução de úlceras gástricas por indometacina/betanecol em camundongos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos (p.o.)

Dose (mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlceras (mm)

Inibição %

Controle - 11 2,45 ± 0,69 38,3 ± 8,40 -

Cimetidina 100 11 3,54 ± 0,82* 14,5 ± 3,30** 62

Exrato 1000

500 250 100 5 6 5 5

3,40 ± 0,89* 3,17 ± 0,98 2,80 ± 0,84 2,67 ± 0,71

18,2 ± 8,07** 22,2 ± 7,14** 34,0 ± 8,06 36,9 ± 6,89

52 42 11 4

ANOVA F(5,37) = 2,82 (P< 0,05) para pH e = 19,9 (P< 0,05) para os índices de úlceras. Teste de Dunnett: * P< 0,05, ** P<0,001.

Tabela 3.3: Efeitos do lanzoprazol e do extrato etanólico de cascas de C. americana em úlceras gástricas induzidas por etanol em ratos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos (p.o.)

Dose (mg kg-1₎

n Índice de úlcera (mm)

Inibição %

Controle - 5 113,4 ± 9,64 -

Lanzoprazol 30 5 68,6 ± 10,7* 39,5

Extrato 1000 5 6,0 ± 4,94* 94,7

(54)

Os resultados obtidos possibilitaram concluir que o extrato etanólico da casca apresentou atividade gastroprotetora em ratos e camundongos frente aos modelos de úlceras gástricas induzidos por agentes irritantes, HCl, etanol e indometacina e secretagogos como o betanecol. Pôde-se concluir também que as úlceras gástricas foram significativamente reduzidas somente a partir das doses de 500 mg/kg, pela via oral.

Através desses dois modelos experimentais, pôde-se concluir também que o extrato etanólico de C. americana foi tão efetivo em promover proteção gástrica quanto as drogas-padrão lanzoprazol e cimetidina. Porém, apesar da atividade gastroprotetora, não foram observadas alterações significativas na acidez gástrica dos animais tratados com o extrato, com exceção no modelo de indometacina/betanecol em que foi observado elevação dos valores de pH na dose máxima (1000 mg/kg, por via oral).

Analisando a dose de 1000 mg/kg, nota-se que no modelo de indução de úlceras por HCl/etanol o resultado de inibição da ulcerogênese em camundongos é bem maior do que o controle positivo. Apesar de a dose do controle ser 33 vezes menor do que a dose de C. americana, deve-se levar em consideração que foi avaliado um extrato bruto, o qual é composto por grande quantidade de substâncias que podem estar competindo por determinados sítios ativos biológicos constituindo um complexo sistema de agonistas e antagonistas, o que não ocorre com uma substância pura. Ainda, considerando a dose de 1000 mg/kg, verificamos que a atividade permanece alta mesmo mudando o agente indutor de úlcera - HCl/etanol, indometacina/betanecol ou etanol. Além disso, quando se realizam os testes com ratos, animais de massa corporal maior (150-200 g), a dose de 1000 mg/kg de extrato continua ativa e, como podemos ver na Tabela 3.3, bem mais ativa que o lanzoprazol (controle positivo) é mais ativa do que nos testes realizado em camundongos (25-35 g).