A LGC do tipo 2 é uma síndrome autossômica recessiva muito rara causada por mutações no gene BSCL2, que codifica para seipina. Essa proteína funciona como um arcabouço na membrana do RE, ajudando na montagem das VLs (revisado em CRAVEIRO SARMENTO et al., 2018). Apesar de ser altamente prevalente no Nordeste do Brasil, essa lipodistrofia ainda necessita de maior atenção por parte dos pesquisadores, profissionais da saúde e governantes (CANDIDO DANTAS et al., 2018; LIMA et al., 2016; LIMA et al., 2018; MEDEIROS et al., 2017). Mesmo sendo caracterizados pelo fenótipo de ausência quase completa tecido adiposo desde o nascimento, vários indivíduos com lipodistrofias possuem algumas características em comum com pessoas que têm síndrome metabólica: hipoadiponectinemia, hipertrigliceridemia, HDL-c baixo e hiperglicemia (CHEHAB, 2008; LEI et al., 2016). Esses aspectos são gatilhos para alterações na homeostase redox e do RE. Aqui, foi hipotetizado que esses dois mecanismos também fizessem parte das lipodistrofias, ainda mais pelo fato de seipina ser uma proteína do RE, o que poderia contribuir para o distúrbio dessa organela na presença de mutações em seu gene. Esse estudo considerou pessoas residentes no Nordeste do Brasil, estratificadas em grupos pela presença de 0 (HD), 1 (HT) ou 2 (HR) alelos com a mutação rs786205071, muito prevalente nessa região (DE AZEVEDO MEDEIROS et al., 2017; LIMA et al., 2016).
No grupo HR, a quantificação dos marcadores plasmáticos de alterações na homeostase redox demonstrou a presença de mecanismos oxidativos. O aumento das concentrações de malondialdeído foi observado nesse grupo em relação aos saudáveis, o que revelou a presença prévia de eventos de oxidação em lipídeos, principalmente os localizados na membrana plasmática (SIDDIQUE et al., 2012). Ademais, o aumento da glutationa oxidada em relação à reduzida também revelou a presença de um ambiente pró-oxidante. A detecção desses marcadores no plasma não permitiu a sugestão de qual seria a fonte dessas modificações. Contudo, pelo fato de haver evidências que demonstram a montagem de uma resposta antioxidante e de reparo de DNA nos leucócitos, é possível sugerir que os glóbulos brancos sejam uma das células que estão expostas aos contextos pró-oxidantes nesse grupo de pessoas.
A proteína OGG1 possui 8 diferentes isoformas conhecidas e, por isso, foram escolhidos iniciadores que indicassem o perfil de todos os transcritos do seu gene. Porém, os resultados também foram restringidos após a seleção da αOGG1
(NM_00254.5), uma forma alternativa que codifica para uma enzima conhecidamente ativa contra o dano oxidado 8-oxoG (FURIHATA, 2015), e que recentemente foi mostrada como sendo importante para o reparo de DNA nas mitocôndrias (LIA et al., 2018). Nesse trabalho, os resultados não demonstraram uma correlação entre os transcritos de OGG1 e αOGG1; todavia foi possível perceber o aumento de ambos nas pessoas com a lipodistrofia (HR), em relação às que conservavam a massa adipocitária (HT + HD). Esse achado sugeriu a presença de um maior número de danos oxidados no DNA no grupo lipodistrófico, reafirmado também pela observação do aumento da transcrição do gene APEX1, a qual codifica para uma enzima classicamente parceira de OGG1 no reparo BER (revisado em KROKAN et al., 2013).
O aumento da transcrição leucocitária de genes que codificam para enzimas de reparo se justifica em contextos nos quais existam danos no DNA. Esse evento pode ser observado por meio da menor taxa de amplificação na técnica de quantificação de danos no DNAmt no grupo lipodistrófico (HR), em relação ao saudável (HT + HD). Embora essa técnica não seja suficiente para concluir que o mecanismo que causou atraso na polimerização in vitro foi a oxidação das bases nitrogenadas, é possível inferir que esse seja um importante mecanismo de lesão no DNA de pessoas com a mutação rs786205071 nos dois alelos do gene BSCL2, uma vez que outros resultados desse trabalho apontaram para alterações na homeostase redox nessas células. Além disso, os protocolos que guiam a execução experimental dessa técnica demonstram que as lesões oxidadas no DNA são um importante fator de atraso na extensão da reação pela DNA polimerase (FURDA et al., 2012). Dessa forma, também é valido relembrar que danos no DNAmt são importantes fontes de disfunções nessa organela e que, tanto nesse estudo (MITODB), como em outros independentes, as lipodistrofias já foram associadas com alterações na homeostase mitocondrial (JENINGA et al., 2011; SLEIGH et al., 2012).
Em 2018, Silva-Islas e colaboradores revisaram que NFE2L2 seria considerado o principal regulador contra o estresse oxidativo, principalmente pela sua função como indutor da expressão de proteínas da resposta antioxidante (revisdo em SILVA-ISLAS et al., 2018). Ademais, esse fator de transcrição também é muito importante para a proteção das mitocôndrias contra as consequências negativas das alterações na homeostase redox (revisado em STROM et al., 2016). Dada a sua função canônica, o estudo do o perfil de transcrição do seu gene foi escolhido, seguido da observação do aumento da sua transcrição nas pessoas com a lipodistrofia (HR), em relação às
saudáveis (HT + HD). Sendo mais um achado que demonstrou a presença de mecanismos oxidativos em pessoas com lipodistrofias (HR), a sua transcrição esteve maior quanto maiores estavam as quantidades de danos no DNA das mitocôndrias dos leucócitos das pessoas desse mesmo grupo (HR).
Além dos danos às mitocôndrias, as alterações na homeostase redox podem desencadear disfunções em outras organelas, como o RE (BANERJEE et al., 2017). A oxidação de lipídeos com posterior formação de aldeídos como produtos finais, como o 4-HNE, pode ativar a UPR e aumentar o splicing do RNAm de XBP1 (VLADYKOVSKAYA et al., 2012). Por meio da agregação de forma inespecífica com várias proteínas dessa organela, o 4-HNE pode comprometer a proteostase por gerar adutos de proteínas (HABERZETTL et al., 2013). Os resultados desse trabalho demonstraram que a peroxidação lipídica estava mais presente no grupo HR, o qual também apresentou aumento do splicing de XBP1, o principal marcador intracelular das disfunções no RE.
A morte celular é a efeito mais grave das alterações na homeostase redox e do RE. Bioquimicamente, a persistência da expressão do fator de transcrição DDIT3 é um significante estímulo para a apoptose secundária ao estresse irreversível do RE. Logo, sua supressão de expressão é um mecanismo adaptativo para a sobrevivência de macrófagos (WOO et al., 2009). Aqui, embora se tenha detectado essas alterações que predispõem à morte celular, uma significativa diminuição da transcrição de DDIT3 foi observada. Além disso, também não foram encontradas alterações quantitativas no número de leucócitos de pessoas do grupo HR em relação aos valores de referência do resto da população. De fato, também não foram encontradas diferenças nos padrões das clivagens da procaspase-3 em pessoas do grupo HR em relação aos outros grupos em comparação. Juntos, esses resultados sugerem que os glóbulos brancos conseguem se adaptar quantitativamente às lesões celulares observadas nesse trabalho.
A associação da presença de alterações na homeostase redox e do RE com as lipodistrofias se justifica pelo fato de que essa síndrome geralmente cursa com a significativa ausência de moléculas antioxidantes no plasma, como HDL-c (seção 1.5) e adiponectina (seção 1.7), bem como com a presença em excesso de moléculas pró- oxidantes, como o LDL-c (seção 1.5) e glicose (seção 1.6). Desses, apenas o aumento do LDL-c não foi significativamente encontrado no grupo HR.
O papel antioxidante da HDL é importante nas zonas formadoras de placas de ateroma como prevenção da oxidação da LDL. Pessoas que apresentam baixo HDL- c usualmente possuem aumento dos marcadores de estresse oxidativo por causa da diminuição da atividade antioxidante dessa lipoproteína (KONTUSH et al., 2005). Essa característica é conferida pela da enzima PON 1 (revisado em KONTUSH et al., 2010; revisado em SORAN et al., 2015), responsável por degradar lipídeos oxidados (revisado em CAMPS et al., 2012). Alguns autores também já mostraram que a presença da HDL é importante contra as consequências negativas do estresse do RE (MULLER et al., 2011a, revisado em MULLER et al., 2011b), por diminuir a concentração dos marcadores bioquímicos desse mecanismo (NICULESCU et al., 2013).
Uma das principais razões pela qual há a diminuição da HDL é o aumento de triglicerídeos circulantes. Após uma refeição rica em calorias, esses ésteres são transportados do fígado para os tecidos periféricos por meio das lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL, do inglês very low-density lipoprotein). Não obstante, a ação da proteína de transferência de colesterol esterificado (CETP, do inglês cholesteryl ester transfer protein) transfere esses triglicerídeos em excesso das VLDLs e quilomícrons para a HDL. Logo, essa última se torna instável e mais propensa a ser metabolizada pelas lipases hepáticas. Assim, a hipertrigliceridemia é uma importante causa do aumento do catabolismo da HDL (revisado em BARTER, 2002; revisado em BARTER, 2011; CLAY et al., 1992). Esse fato também predispõe pessoas com altas taxas de triglicerídeos no sangue às alterações na homeostase redox e, consequentemente aos seus efeitos indesejáveis (AL-AUBAIDY et al., 2014; revisado em DUDANI et al., 2010; KATSUKI et al., 2004). Logo, o aumento dos triglicerídeos plasmáticos pode tanto gerar estresse do RE (KIM et al., 2007), como também agravar esse mecanismo (SAH et al., 2014; ZENG et al., 2012).
Juntos, o aumento dos triglicerídeos no grupo HR em relação ao grupo HT + HD e a considerável diminuição do HDL-c em relação ao todos os outros grupos comparativos podem ser possíveis explicações para o surgimento de um estado pró- oxidante e de disfunções no RE nas pessoas lipodistrofias que constituíram o grupo amostral (HR) desse estudo. De fato, as pessoas desse grupo com as menores concentrações séricas do HDL-c foram as mesmas que apresentaram concentrações de triglicerídeos mais altos. Além disso, elas também possuíram maiores transcrições de APEX1 e αOGG1 nos leucócitos que circulavam nesse mesmo sangue.
Disfunções da massa adipocitária já foram associadas com o alterações na homeostase redox em obesos (FURUKAWA et al., 2004), usualmente pelo fato de o adipócito perder suas funções na síntese de importantes moléculas sinalizadoras, como a adiponectina (revisado em MATSUDA et al., 2014). A presença desse hormônio é um fator protetor para as consequências negativas das alterações na homeostase redox para as células em geral (revisado em CHAN et al., 2012; revisado em YAMAUCHI et al., 2008), mas também para as mitocôndrias (IWABU et al., 2010; LIN et al., 2014; REN et al., 2017). Ademais, a adiponectina também é importante para supressão do estresse do RE e atenuação dos seus efeitos indesejados (revisado em BODDU et al., 2014; revisado em HOU et al., 2018; KYRIAKAKIS et al., 2017; LIU et al., 2016; revisado em MONDAL et al., 2012; revisado em UENO et al., 2011). A ligação da adiponectina com o seu receptor aumenta a expressão e atividade de NFE2L2 para a montagem da resposta antioxidante (LI et al., 2015; REN et al., 2017), um mecanismo semelhante ao que foi visto para os resultados dessa dissertação. Em um ambiente com alterações na homeostase redox, como no grupo HR, as maiores concentrações de adiponectina plasmáticas se correlacionaram positivamente com as maiores transcrições leucocitárias de NFE2L2. Nesse trabalho, também foi observada diminuição das concentrações da adiponectina no grupo com lipodistrofias (HR) em relação ao saudável (HT + HD), um resultado já visto por outros autores (ANTUNA- PUENTE et al., 2010; CUI et al., 2011). Porém, o que é sugestível é que o tecido adiposo remanescente ainda possa secretar adiponectina numa concentração que talvez ajude no desencadeamento de uma resposta antioxidante nas pessoas com a LGC do tipo 2 por meio do aumento da expressão de NFE2L2.
A hiperglicemia e o diabetes melito são frequentes achados em pessoas com lipodistrofias (AGARWAL et al., 2003; LIMA et al., 2016, LIMA et al., 2018). Embora também tenham sido encontradas altas concentrações de glicose no sangue das pessoas que compuseram o grupo HR em relação aos outros grupos comparativos, é preciso lembrar que o jejum de 8 horas para a dosagem desse carboidrato não é recomendado e poucas vezes alcançado com sucesso para pessoas sem o tecido adiposo. Levando em consideração que o diabetes já foi diagnosticado previamente em várias pessoas da nossa amostra (LIMA et al., 2016), é preciso apontar que essa comorbidade, comumente encontrada nas lipodistrofias, já foi destacada como sendo importante causa de estresse oxidativo, principalmente após a ligação dos AGE nos AGER (revisado em GUGLIUCCI et al., 2014), bem como do estresse do RE por
glicação inespecífica de proteínas dessa organela (revisado em PIPERI et al., 2012). Com o objetivo de observar se a hiperglicemia poderia ter relação com os estresses observados no grupo HR, a quantificação dos transcritos de AGER foi escolhida. Embora não tenham sido observadas diferenças significativas entre os grupos em comparação, esse dado não descarta que essa disfunção do metabolismo dos carboidratos seja importante na gênese desses estresses, mas dá aos distúrbios plasmáticos no metabolismo dos lipídeos uma significante relevância como sugestão de origem das alterações na homeostase redox e do RE na LGC do tipo 2. Juntos, a diminuição do HDL-c, o leve aumento dos triglicerídeos no sangue, as disfunções nas concentrações de adiponectina e, provavelmente o diabetes melito, podem ser fatores que predispõem as células de pessoas com lipodistrofias às alterações na homeostase redox e do RE.
Além de tudo, também é preciso relembrar que as pessoas do grupo HR apresentam a mutação rs786205071 nos dois alelos do gene BSCL2. Embora ainda não esteja claro quais sejam todas as consequências bioquímicas dessa variação genômica para as células não adipocitárias de pessoas com a LGC do tipo 2, outras mutações em seipina já apresentaram graves efeitos em outros modelos de estudo. As seipinopatias, por exemplo, são doenças causadas por mutações de ganho de função no gene BSCL2, as quais não comprometem a adipogênese, mas atingem o sítio de glicosilação de seipina, alterando sua conformação terciária (revisado em ITO et al., 2009). A encefalopatia de Célia também é uma grave condição associada com morte prematura, causada por mutações de ganho de função que não comprometem a adipogênese, mas que geram estresse irreversível no tecido nervoso (RUIZ- RIQUELME et al., 2015).
Essas duas condições clínicas nos fizeram hipotetizar se a mutação rs786205071 também seria causa suficiente e direta para a geração do estresse do RE. Além disso, pelo fato desse estresse também ser uma das fontes de alterações da homeostase redox (revisado em MALHOTRA et al., 2007), seria razoável pensar que essa alteração genômica pudesse ser a fonte primária de todos os estresses encontrados nessa dissertação. Contudo, o desenho experimental desse trabalho não permitiu o teste dessa hipótese, pois não contou com um modelo controlado em que só essa específica mutação fosse a diferença mais importante entre os grupos caso e controle. O papel per si da mutação rs786205071 na geração de estresse do RE e de alterações na homeostase redox está sendo estudado pelo grupo de pesquisa que
conduziu essa dissertação em um modelo experimental de cultura de células obtidas pessoas com a LGC do tipo 2. Por conseguinte, alguns dos resultados aqui represntaram, apenas permitiram a inferência sobre o papel da seipina rs786205071 na geração dos estresses aqui observados.
Os estudos que mostraram a associação direta entre a seipina mutante e estresse do RE em modelos de seipinopatia encontraram aumento da expressão de chaperonas que marcam um mecanismo adaptativo para retorno à proteostase (ITO et al., 2007; YAGI et al., 2011). Embora essas mesmas chaperonas também tenham sido alvo desse trabalho, não foram encontradas diferenças de expressão de HSPA5 e P4HB entre os grupos comparativos, sendo um dos possíveis indícios da ausência de estresse do RE pela presença de uma proteína malformada nessa organela. Outros autores também já observaram que o nocauteamento do gene BSCL2 e, consequentemente, ausência da função da proteína não seriam suficientes para gerar distúrbios detectáveis no RE (CHEN et al., 2012; WANG et al., 2016, 2018; ZHOU et al., 2014). Aqui, também foi observado que o grupo HR apresentou significativa diminuição da transcrição do gene BSCL2, outro achado que diminui as probabilidades de rs786205071 ser suficiente para geração de estresse direto nessa organela. Por impedir a tradução de RNAs mensageiros com códons de paradas prematuros, o mecanismo da degradação mediada por mutação sem sentido (NMD, do inglês nonsense-mediated decay) foi selecionado (revisado em HUG et al., 2016). Aqui, também foi observado que essa mutação impede a polimerização de 71% da proteína seipina, e a formação muito prematura de um códon de parada pode fazer com que seu RNAm seja substrato para a NMD. Mais estudos são necessários para testar se essa hipótese se sustenta para a rs786205071.
Supondo-se que os mecanismos supracitados não sejam tão importantes para a rs786205071 e a seipina mutante ainda esteja expressa em quantidades usuais na membrana do RE dos leucócitos, as possibilidades de geração de estresse nessa organela aumentariam significativamente. Entretanto, Ito e colaboradores estudaram quais seriam as sequências importantes para seipina gerar esse tipo de mecanismo intracelular e concluíram que, para disparar a UPR, seipina deveria reter as duas regiões transmembranares (ITO et al., 2008). Aqui, foi observado que a rs786205071 remove a segunda região transmembranar dessa proteína, uma sequência altamente amiloidogênica. Juntos, esses resultados sugerem que, mesmo se a seipina rs786205071 estiver na membrana do RE, haveria uma possível baixa probabilidade
de geração de distúrbios nessa organela por ausência de formação de fibrilas amiloides. Ademais, não foi encontrada correlação entre os transcritos de BSCL2 e o splicing de XBP1.
Embora seja possível sugerir que a presença da rs786205071 não seja suficiente para diretamente gerar os mecanismos aqui descritos nos leucócitos dos participantes dessa pesquisa, essas proposições serão confirmadas pelo grupo de pesquisa que conduziu essa dissertação com um modelo experimental de cultura de células obtidas de pessoas com a LCG do tipo 2. Interessantemente, foi observado que pessoas que possuíam apenas 1 alelo mutante para a rs786205071 (HT) apresentaram um aumento, ainda que não estatisticamente significativo, nas médias das concentrações de malondialdeído, glutationa oxidada em relação à reduzida e clivagem de procaspase-3 em relação ao grupo com 0 alelos mutantes para rs786205071 (HD). No entanto, mesmo com a possível baixa probabilidade da influência direta de rs786205071 nos mecanismos aqui descritos, foi possível observar diferenças significativas entre os grupos HD e HT + HR para os parâmetros supracitados. O que ainda não está esclarecido é se a presença de 1 alelo mutante para rs786205071 já influenciaria nos fenótipos testados, ou se a presença do grupo HR dentro do HR + HT poderia elevar a média desse último grupo, tornando-se um efeito que leva à confusão dos resultados. Mais estudos são necessários para desvendar o papel da variante aqui problematizada na gênese das alterações na homeostase redox e do RE.
Três principais limitações devem ser destacadas para esse trabalho: o relativo baixo número amostral, a análise de apenas um conjunto celular (leucócitos totais), bem como o estudo de apenas um único tipo de mutação em BSCL2. Em primeiro lugar, a quantidade de participantes desse estudo permitiu a observação de resultados significativamente diferentes entre os grupos comparativos. Embora outras conclusões possam ser tomadas após o aumento do número amostral, as análises obtidas a partir da quantidade de participantes são válidas por causa da raridade das lipodistrofias. Em segundo lugar, vale a pena ressaltar que o modelo celular adotado, os leucócitos totais, podem ter padrões diferentes de resposta ao estresse em relação a outras células onde seipina é mais expressa, como os neurônios e testículos (MAGRÉ et al., 2001). Assim, achados discordantes podem ser encontrados caso o foco da análise seja outro tipo celular. Portanto, essa limitação não permite a afirmação de que existe reprodutibilidade dos resultados em outros tecidos, que não
o hematopoético. Em último lugar, também é preciso enfatizar que os achados observados nessa dissertação advêm exclusivamente de pessoas com diferentes formas de herdabilidade para a rs786205071. Portanto, é possível que outras mutações em BSCL2, bem como em outros genes que causem lipodistrofias generalizadas, possuam diferentes padrões de alterações na homeostase redox e do RE. Todavia, é importante destacar que a mutação aqui estudada é altamente prevalente entre as lipodistrofias generalizadas do tipo 1, 3 e 4, assim como essa é a variante em BSCL2 mais frequentemente descrita na literatura (CRAVEIRO SARMENTO et al., 2019). Dessa forma, é possível que os resultados dessa dissertação possam ser extrapolados pelo menos para outras amostras de pessoas com diferentes mutações bialélicas nesse mesmo gene. Além disso, como as diferenças estatísticas entre os resultados quantitativos foram mais bem observadas entre os grupos HR e HT + HD, também é possível que a ausência do tecido adiposo