UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
AQUILES SALES CRAVEIRO SARMENTO
ALTERAÇÕES NA HOMEOSTASE REDOX E DO RETÍCULO
ENDOPLASMÁTICO: MECANISMOS ASSOCIADOS À
LIPODISTROFIA GENERALIZADA CONGÊNITA DO TIPO 2
NATAL
2019
ALTERAÇÕES NA HOMEOSTASE REDOX E DO RETÍCULO
ENDOPLASMÁTICO: MECANISMOS ASSOCIADOS À
LIPODISTROFIA GENERALIZADA CONGÊNITA DO TIPO 2
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientadora: Profª. Drª. Julliane Tamara Araújo de Melo Campos;
Coorientadora: Profª. Drª. Lucymara Fassarella Agnez-Lima.
NATAL
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Craveiro Sarmento, Aquiles Sales.
Alterações na homeostase redox e do retículo endoplasmático: mecanismos associados à lipodistrofia generalizada congênita do tipo 2 / Aquiles Sales Craveiro Sarmento. - 2019.
137f.: il.
Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Natal, 2019.
Orientador: Julliane Tamara Araújo de Melo Campos. Coorientador: Lucymara Fassarella Agnez-Lima.
1. BiP - Dissertação. 2. CHOP - Dissertação. 3. PDI - Dissertação. 4. APE-1 - Dissertação. 5. Berardinelli - Dissertação. 6. Estresse oxidativo - Dissertação. I. Campos, Julliane Tamara Araújo de Melo. II. Agnez-Lima, Lucymara Fassarella. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 577.1 Elaborado por Raimundo Muniz de Oliveira - CRB-15/429
Dedico esta obra
À Ana Craveiro Sales Sarmento e Antônio Neto Sarmento, meus queridos e para sempre amados pais.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte que, por meio do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, permitiu a execução técnica desse trabalho;
Às duas agências de fomento à pesquisa no Brasil: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), que financiou o meu sustento pessoal durante os meses de trabalho; e o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), que financiou o custeio dos materiais e métodos;
À Dra. Julliane Tamara Araújo de Melo Campos, orientadora e idealizadora dessa dissertação. Obrigado por confiar em mim e sempre estar disponível ao trabalho. Desejo
que o grupo BSCL cresça cada vez mais e você se torne grande referência mundial no estudo das lipodistrofias. Ainda estamos no começo, mas estamos no caminho certo!
À Dra. Lucymara Fassarella Agnez Lima, coorientadora e facilitadora dessa dissertação. Obrigado pela confiança, pelo imenso aprendizado profissional e por ser um excelente
padrão de competência em todas as áreas!
À ASPOSBERN (Associação dos Pais e Portadores da Síndrome de Berardinelli do Estado do Rio Grande do Norte), que luta diariamente pela melhoria da qualidade de vida
das pessoas com lipodistrofias e a todos os que doaram o sangue para das coletas desse trabalho. Obrigado por não desacreditarem na ciência! “Nossa luta não será em
vão”;
Aos membros titulares da banca de defesa desse trabalho: Dr. Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin, Dra. Ana Paula Trussardi Fayh, Dr. Renan Magalhaes Montenegro Junior e Dra.
Adriana Augusto de Rezende, bem como aos membros suplentes: Dr. Leonardo Capistrano Ferreira e Dr. Leonam Gomes Coutinho.
Aos membros da banca de qualificação desse trabalho: Dr. Andre Ducati Luchessi, Dr. Daniel Carlos Ferreira Lanza e Dr. Joao Paulo Matos Santos Lima. Suas contribuições
foram muito valiosas!
Aos coautores do artigo experimental derivado desse trabalho:
Drª. Ana Rafaela de Souza Timoteo, Drª. Aurigena Antunes De Araujo, Dr. Josivan Gomes de Lima, Drª. Marcela Abbott Galvao Ururahy, Drª. Roseane Carvalho Vasconcelos e Verônica Kristina Cândido Dantas. Sem a ajuda de vocês, esse trabalho
A todos os componentes do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, com ênfase para: Drª. Angélica Maria de
Sousa Leal, Drª. Carolina Fonseca Minnicelli, Drª. Daniele Maria Lopes Pinheiro, Drª. Fabricia Lima Fontes, MSc. Júlia Firme Freitas, Drª. Rita de Cássia Barreto Silva-Portela,
Drª. Sinara Carla Da Silva Araújo e Drª. Tirzah Braz Petta Lajus. Obrigado pelas agradáveis companhias, bem como pelos conselhos ao longo do caminho!
À Drª. Monique Gabriela das Chagas Faustino Alves, que me proporcionou a incrível experiência de dar aulas no mestrado. Você é uma professora sensacional!
Aos outros componentes da turma de mestrado 2018.1 do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte: Cynthia Haynara Ferreira da Silva, Geovanna Maria de Medeiros Moura, Johny Wysllas de Freitas Oliveira,
Lucas Alighieri Neves Costa Batista, Luiz Henrique Costa de Medeiros e Thais Teixeira Oliveira. À cada um de vocês, desejo muito sucesso profissional e pessoal. Obrigado
pela companhia durante a jornada!
À Drª. Amanda Katarinny Goes Gonzaga e ao Dr. Leorik Pereira da Silva por acreditarem tanto em mim!
Aos grandes companheiros Jorge Lucas Nascimento Souza, Maria Fernanda Bezerra de Souza e MSc. Matheus da Silva Zatti. Obrigado por escolherem ser meus amigos!
Ao Dr. Leo Henryk Sternbach (in memorian), cujos trabalhos científicos permitiram a invenção e comercialização do clonazepam.
À Ana Craveiro Sales Sarmento e Antônio Neto Sarmento, por terem me escolhido para ser seu único filho. Todas as páginas dessa dissertação e da minha vida são possíveis
por causa de vocês!
e
Ao Deus que me foi proposto durante o ano de 2018. Obrigado por ser diferente do que eu anteriormente acreditava, bem como por ser uma das razões da minha esperança!
[...] Gaste mais horas realizando que sonhando, fazendo que planejando, vivendo que esperando porque, embora quem quase morre esteja vivo, quem quase vive já morreu.
Alterações na homeostase redox e do retículo endoplasmático: mecanismos associados à lipodistrofia generalizada congênita do tipo 2
RESUMO
A lipodistrofia generalizada congênita (LGC) do tipo 2 consiste numa rara síndrome autossômica recessiva caracterizada pela quase completa falta de tecido adiposo corporal desde o nascimento. A LGC, geneticamente causada por mutações de perda de função nos dois alelos do gene BSCL2, já foi fenotipicamente caracterizada por hipertrigliceridemia, hiperglicemia, diminuição do HDL-c e hipoadiponectinemia. Esses achados laboratoriais são importantes gatilhos para alterações na homeostase redox e do retículo endoplasmático (RE). Por conseguinte, o objetivo desse trabalho foi investigar se esses mecanismos intracelulares estariam presentes nessa síndrome. Para tal, o sangue total foi coletado a partir de pessoas originárias do Nordeste do Brasil com 0, 1 e 2 alelos mutantes para a mutação c.325dupA (rs786205071) no gene BSCL2. Por meio da técnica qPCR, foi avaliada a expressão de genes responsáveis por desencadear a resposta antioxidante, reparo de DNA e estresse do RE nos leucócitos. Testes colorimétricos foram utilizados para quantificar produtos de peroxidação lipídica e avaliar o status redox da glutationa, bem como acessar o panorama do metabolismo energético do plasma. A PCR convencional foi escolhida para observação das lesões no DNA das mitocôndrias dos leucócitos. Também foi escolhido o imunoblot para o estudo da expressão gênica de proteínas chaperonas relacionadas com o estresse do RE nos leucócitos, bem como das concentrações de adiponectina no plasma. Em relação aos grupos que não apresentavam lipodistrofia, as pessoas com a mutação rs786205071 nos 2 alelos apresentaram aumento da transcrição de NFE2L2, APEX1, OGG1 e αOGG1 nos leucócitos, bem como das concentrações de malondialdeído e da taxa GSSG:GSH no plasma. Além disso, também foi observada diminuição da taxa de polimerização in vitro do DNA mitocondrial e aumento do splicing de XBP1 nos leucócitos. As análises in sílico apontaram para alta probabilidade da seipina rs786205071 pertencer à membrana do RE, embora a mutação supracitada remova regiões amiloidogênicas dessa proteína. Ademais, também foi observada a diminuição da transcrição de BSCL2 nesses leucócitos, associado à ausência de diferenças significativas no padrão de expressão das chaperonas HSPA5 e P4HB. Em paralelo, essas células apresentaram diminuição das transcrições de DDIT3, mas sem diferenças significativas no padrão de clivagem da procaspase-3. Por fim, também foi observado leve aumento plasmático de triglicerídeos, junto com a diminuição das concentrações plasmáticas de adiponectina e do HDL-c. Juntos, os resultados apontaram para a presença de lesões em lipídeos decorrentes das alterações na homeostase redox, associadas com o aumento do número de danos no DNA mitocondrial e recrutamento transcricional de genes que participam da resposta antioxidante e do reparo do DNA. Embora também haja evidências de estresse do RE, a mutação rs786205071 se mostrou como tendo uma possível baixa probabilidade de gerar diretamente esse mecanismo. Ademais, os dados sugerem que não houve evidências de aumento significativo de morte celular e que as diminuições das concentrações de adiponectina e do HDL-c podem ser sugestivos gatilhos para as alterações na homeostase redox e do RE na LGC do tipo 2.
Changes in redox and endoplasmic reticulum homeostasis are mechanisms associated with congenital generalized lipodystrophy type 2
ABSTRACT
Congenital generalized lipodystrophy (CGL) type 2 consists of a rare autosomal recessive syndrome characterized by almost complete lack of body fat at birth. CGL, genetically caused by loss-of-function mutations in the two alleles of the BSCL2 gene, was phenotypically characterized by hypertriglyceridemia, hyperglycemia, decreased HDL-c, and hypoadiponectinemia. These laboratory findings are important triggers for changes in redox and endoplasmic reticulum (ER) homeostasis. Therefore, our aim was to investigate if these intracellular mechanisms are part of this syndrome. Therefore, we collected the whole blood from people living in Northeastern Brazil with 0, 1 and 2 mutant alleles for the c.325dupA mutation (rs786205071) in the BSCL2 gene. Through the qPCR technique, we evaluated the expression of genes responsible for triggering the antioxidant response, DNA repair and ER stress in leukocytes. Colorimetric tests were applied to quantify lipid peroxidation products and to evaluate the redox status of glutathione, as well as to access plasma energy metabolism panorama. Conventional PCR was also chosen to observe leukocyte mitochondrial DNA lesions. We also chose the immunoblot technique for the study of gene expression of chaperone proteins related to ER stress in leukocytes, as well as plasma adiponectin concentrations. Comparing to the healthy group, subjects with the rs786205071 mutation in the 2 alleles showed increased transcription of NFE2L2, APEX1, OGG1 and αOGG1 in leukocytes, as well as the concentrations of malondialdehyde and the GSSG:GSH ratio in plasma. In addition, we also observed decreased in vitro polymerization rate of mitochondrial DNA and increased XBP1 splicing in leukocytes. In silico analyses indicated a high probability of seipin rs786205071 belonging to the ER membrane, although the aforementioned mutation removes amyloidogenic regions from that protein. In addition, we observed a decrease in the transcription of BSCL2 in these leukocytes, associated with the absence of differences in the expression pattern of HSPA5 and P4HB chaperones. In parallel, these cells showed decreased DDIT3 transcripts, but without differences in the procaspase-3 cleavage pattern. Finally, we also observed a soft increase of plasmatic triacylglycerol, together with a decrease in plasma concentrations of adiponectin and HDL-c. Together, results pointed to the presence of lipid lesions due to changes in redox homeostasis, associated with increased numbers of mitochondrial DNA damage and transcriptional recruitment of genes that participate of the antioxidant response and DNA repair. Although there is also evidence of ER stress, the rs786205071 mutation was shown to possibly have a low probability to directly generate this mechanism. In addition, the data suggest that there was no evidence of increased cell death and that decreases in adiponectin and HDL-c concentrations may act as potential triggers for changes in redox and ER homeostasis in CGL type 2.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1–MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DAS LIPODISTROFIAS GENERALIZADAS CONGÊNITAS, COM ÊNFASE PARA A DO
TIPO 2. ... 3
FIGURA 2–ALINHAMENTO DAS REGIÕES TRANSMEMBRANARES DE SEIPINA ... 5
FIGURA 3–ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE SEIPINA.. ... 5
FIGURA 4–BIOSSÍNTESE INTRACELULAR DE TGS E LOCALIZAÇÃO DE SEIPINA NO RE.. ... 6
FIGURA 5–MODULADORES PLASMÁTICOS DE ALTERAÇÕES NA HOMEOSTASE REDOX E MECANISMOS ANTIOXIDANTES.. ... 14
FIGURA 6–MODULADORES PLASMÁTICOS DO ESTRESSE DO RE E MECANISMOS DE REVERSÃO.. ... 16
FIGURA 7–ESQUEMA GERAL DOS EXPERIMENTOS REALIZADOS.. ... 28
FIGURA 8–DETERMINAÇÃO DO STATUS REDOX DA GLUTATIONA NO PLASMA. ... 31
FIGURA 9–CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E EPIDEMIOLÓGICA DA AMOSTRA EM ESTUDO.. ... 40
FIGURA 10–CARACTERIZAÇÃO DO METABOLISMO ENERGÉTICO DA AMOSTRA EM ESTUDO.. ... 42
FIGURA 11 – QUANTIFICAÇÕES DOS MARCADORES DE ALTERAÇÕES DA HOMEOSTASE REDOX E DA RESPOSTA ANTIOXIDANTE.. ... 43
FIGURA 12–CORRELAÇÕES INTERNAS ENTRE OS PARÂMETROS QUANTITATIVOS DOS MARCADORES DE ALTERAÇÕES DA HOMEOSTASE REDOX A PARTIR DOS RESULTADOS APRESENTADOS NA FIGURA 11.. ... 45
FIGURA 13 – CORRELAÇÕES ENTRE OS PARÂMETROS QUANTITATIVOS DOS MARCADORES DE ALTERAÇÕES DA HOMEOSTASE REDOX E OS PARÂMETROS DO METABOLISMO ENERGÉTICO. ... 46
FIGURA 14 – QUANTIFICAÇÃO DE LESÃO NO DNAMT E PREDIÇÃO DA OCORRÊNCIA DE DISFUNÇÃO NESSA ORGANELA. ... 48
FIGURA 15–COMPARAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES PLASMÁTICAS DE ADIPONECTINA.. ... 50
FIGURA 16–CARACTERIZAÇÃO IN SILICO DAS CONSEQUÊNCIAS DE RS786205071. ... 52
FIGURA 17– REGIÕES AMILOIDOGÊNICAS DE SEIPINA IMPORTANTES PARA FORMAÇÃO DE CORPOS DE INCLUSÃO E UPR. ... 53
FIGURA 18–MARCADORES LEUCOCITÁRIOS DE ESTRESSE DO RE. ... 54
FIGURA 19–CONTAGEM LEUCOCITÁRIA EM SITUAÇÕES AMBULATORIAIS E APOPTOSE... 55
LISTA DE TABELAS TABELA 1–LIPODISTROFIAS DE ETIOLOGIA GENÉTICA MAIS IMPORTANTES. ... 2
TABELA 2–MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE SEIPINA E SUA RELAÇÃO COM O ESTRESSE DO RE. ... 20
TABELA 3–COLETÂNEA DE ARTIGOS QUE MOSTRAM O PAPEL DAS ALTERAÇÕES NA HOMEOSTASE REDOX E DO RE NO SURGIMENTO E/OU AGRAVAMENTO DAS PRINCIPAIS CAUSAS DE MORTE OU COMORBIDADES DAS LIPODISTROFIAS GENERALIZADAS. ... 23
TABELA 4–CARACTERÍSTICAS GENOTÍPICAS E FENOTÍPICAS PRINCIPAIS ENTRE OS GRUPOS COMPARATIVOS. ... 27
TABELA 5–TESTES ESTATÍSTICOS PARA OS GRUPOS ESTRATIFICADOS. ... 38
TABELA 6–CONDIÇÕES PARA DOSAGENS DE GLICOSE, TRIGLICERÍDEOS, COLESTEROL TOTAL E FRAÇÕES... 29
TABELA 7–INICIADORES UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE QPCR. ... 33
TABELA 9–ANTICORPOS UTILIZADOS NO IMUNOBLOT. ... 35
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4-HNE: 4-hidroxi-2-nonenal; 8-oxoG: 8-oxoguanina; AF: ácido fosfatídico;
AGE: produtos de glicação avançada, do inglês advanced glycation end-product;
AGPAT: 1-acilglicerol-3-fosfato aciltransferase, do inglês 1-acylglycerol-3-phosphate acyltransferase; AGs: ácidos graxos;
ALF: ácido lisofosfatídico;
AMP: monofosfato de adenosina, do inglês adenosine monophosphate;
AMPK: proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina (AMP), do inglês AMP-activated protein kinase;
ANOVA: análise de variância;
APE-1/APEX1: endonuclease 1 de sítios apurínicos/apirimidínicos, do inglês apurinic/apyrimidinic endonuclease 1;
APS: persulfato de amônio, do inglês ammonium persulfate;
AS: fita anti-senso
ATF2: fator 2 de ativação da transcrição, do inglês activating transcription factor 2; ATF6: fator 6 de ativação da transcrição, do inglês activating transcription factor 6;
BER: reparo do DNA por excisão de bases, do inglês base excision DNA repair;
BiP: proteína ligadora de imunoglobulina, do inglês binding-immunoglobulin protein;
BSCL: lipodistrofia congênita do tipo Berardinelli-Seip, do inglês Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy;
CAT: catalase; CAV1: caveolina-1; CAVIN1: cavina-1;
CEP-FACISA: Comitê de Ética e Pesquisa da FACISA
CETP: proteína de transferência de colesterol esterificado, do inglês cholesteryl ester transfer protein; CHOP: proteína homóloga à proteína ligadora do acentuador CCAAT, do inglês CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein;
CIDEC: efetor C indutor de morte celular semelhante à DFFA, do inglês cell death-inducing DFFA-like effector C;
CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico;
CT: cycle threshold;
DDIT3: transcrito 3 induzido por dano de DNA, do inglês DNA damage-inducible transcript 3; DGATs: diacilglicerol aciltransferases, do inglês diacylglycerol acyltransferases;
DG: diacilglicerol;
DNA: ácido desoxirribonucleico, do inglês deoxyribonucleic acid;
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético, do inglês ethylenediamine tetraacetic acid;
EIF2AK3: fator 2 α quinase 3 de iniciação de tradução eucariótico, do inglês eukaryotic translation initiation factor 2 α kinase 3;
FACISA: Faculdade de Ciências da Saúde do Trairi;
FPLD: lipodistrofia parcial familiar, do inglês familial partial lipodystrophy;
G3F: glicerol-3-fosfato;
GAPDH: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, do inglês glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GPATs: glicerol-3-fosfato aciltransferases, do inglês glycerol-3-phosphate acyltransferase;
GSH: glutationa reduzida; GSSG: glutationa oxidada; HD: homozigoto dominante;
HDL: lipoproteína de alta densidade, do inglês high-density lipoprotein;
HDL-c: colesterol contido dentro da HDL, do inglês cholesterol loaded into HDL;
HR: homozigoto recessivo;
HRP: horseradish peroxidase;
HSPA5: membro 5 da família de proteínas de choque térmico A, do inglês heat shock protein family A member 5;
HT: heterozigoto;
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística; IMC: índice de massa corporal;
IRE1: enzima 1 requerente de inositol, do inglês inositol-requiring enzyme-1; JNK: quinases c-jun N-terminal, do inglês c-jun N-terminal kinases;
kDa: kilodaltons;
KEAP1: proteína 1 associada a ECH semelhante à kelch, do inglês kelch-like ECH-associated protein 1;
LDL: lipoproteína de baixa densidade, do inglês low-density lipoprotein;
LDL-c: colesterol contido dentro das LDL, do inglês cholesterol loaded into LDL;
LGC: lipodistrofia generalizada congênita; LMNA: lamina A/C, do inglês lamin A/C;
MEF: fibroblastos embrionários de camundongo, do inglês mouse embryonic fibroblast; NADH: dinucleótideo de nicotinamida e adenina, do inglês nicotinamide adenine dinucleotide;
NADPH: fosfato de dinucleótideo de nicotinamida e adenina, do inglês nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate;
NFE2L2: fator 2 relacionado ao fator nuclear eritroide 2, do inglês nuclear factor erythroid 2-related factor 2;
NMD: degradação mediada por mutação sem sentido, do inglês nonsense-mediated decay;
O2: oxigênio;
OGG1: DNA glicosilase de 8-oxoguanina, do inglês 8-oxoguanine DNA glycosylase; PAPs: fosfatases fosfatidatos, do inglês phosphatidate phosphatase;
pb: pares de base;
PCR: reação em cadeia da polimerase, do inglês polymerase chain reaction; PDB: protein database bank;
PERK: quinase do retículo endoplasmático semelhante à PKR, do inglês PKR-like endoplasmic reticulum kinase;
PPARα: receptor alfa ativado por proliferadores de peroxissomos, do inglês peroxisome proliferator-activated receptor alpha;
PPARγ: receptor gama ativado por proliferadores de peroxissomos, do inglês peroxisome proliferator-activated receptor gamma;
PTRF: fator de liberação do transcrito e polimerase 1, do inglês polymerase i and transcript release factor;
PVDF: fluoreto de polivinilideno, do inglês polyvinylidene fluoride; RCF: força centrífuga relativa, do inglês relative centrifugal force;
RE: retículo endoplasmático;
RNA: ácido ribonucleico, do inglês ribonucleic acid; RNAm: ácido ribonucleico mensageiro;
qPCR: PCR quantitativa em tempo real, do inglês reverse real time quantitative PCR;
SCARB1: membro 1 dos receptores de classe B do tipo scavenger, do inglês scavenger receptor class B member 1;
SDS: dodecil sulfato de sódio, do inglês sodium dodecyl sulfate;
SE: fita senso
SOD: superóxido dismutase, do inglês superoxide dismutase; TEMED: tetrametiletilenodiamina;
TG: triglicerídeos;
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte;
UPR: resposta às proteínas malformadas, do inglês unfolded protein response; VLDL: lipoproteína de muito baixa densidade, do inglês very low-density lipoprotein;
VLs: vesículas de lipídeo;
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 As lipodistrofias ... 1
1.1.1 Seipina e a LGC do tipo 2 ... 3
1.2 A relação entre as lipodistrofias e obesidade ... 8
1.3 Alterações na homeostase redox ... 9
1.4 Alterações na homeostase do RE ... 10
1.5 Papel das lipoproteínas nas alterações na homeostase redox e do RE ... 13
1.6 Papel da glicemia nas alterações na homeostase redox e do RE ... 15
1.7 Papel da adiponectina nas alterações na homeostase redox e do RE ... 17
1.8 Papel da seipina nas alterações na homeostase redox e do RE ... 18
1.9 A importância do estudo das alterações na homeostase redox e do RE nas lipodistrofias ... 21 2 OBJETIVOS ... 24 2.1 Objetivo geral ... 24 2.2 Objetivos específicos ... 24 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 25 3.1 Caracterização da pesquisa ... 25
3.2 Coleta de sangue e extração de macromoléculas ... 25
3.3 Estratificação dos participantes por meio do sequenciamento capilar ... 26
3.4 Dosagem de glicose, triglicerídeos, colesterol total e frações no plasma e cálculo do índice de massa corporal (IMC). ... 29
3.5 Determinação do status redox da glutationa ... 30
3.6 Determinação da concentração de malondialdeído ... 30
3.7 PCR quantitativa em tempo real (qPCR) ... 32
3.8 Imunoblot ... 33
3.9 Quantificação relativa de lesão no DNA mitocondrial ... 34
3.10 Predição estatística da ocorrência de disfunção mitocondrial... 36
3.11 Predições bioinformáticas das consequências da mutação rs786205071 ... 36
3.12 Predição bioinformática de regiões amiloidogênicas ... 37
3.13 Testes estatísticos ... 37
4 RESULTADOS ... 39
4.1 Caracterização epidemiológica e molecular das pessoas que compuseram a amostra em estudo ... 39
4.2 Pessoas que compuseram o grupo HR possuíram significativa diminuição do HDL-c .. 39
4.3 Pessoas que compuseram o grupo HR possuíram significativo aumento dos marcadores de alterações na homeostase redox e da resposta antioxidante ... 41
4.4 As concentrações dos marcadores de alterações na homeostase redox se
correlacionaram com a diminuição do HDL-c e com o aumento dos triglicerídeos ... 44
4.5 Pessoas que compuseram o grupo HR possuíram significativo aumento dos marcadores de lesões no DNA das mitocôndrias, bem como alta probabilidade de disfunções nessa organela ... 47
4.6 Pessoas que compuseram o grupo HR possuíram significativa diminuição das concentrações séricas de adiponectina, embora sua secreção residual tenha se correlacionado positivamente com os transcritos de NFE2L2 ... 47
4.7 Caracterização in silico da mutação rs786205071 no gene BSCL2 ... 49
4.8 Embora as predições in silico apontem para o RE como localização da seipina rs786205071, essa mutação remove importantes regiões amiloidogênicas para formação de corpos de inclusão ... 51
4.9 Pessoas que compuseram o grupo HR possuíram significativo aumento dos marcadores de estresse do RE ... 51
5 DISCUSSÃO ... 56
6 CONCLUSÕES ... 66
REFERÊNCIAS ... 67
APÊNDICE A – Artigo produzido a partir dessa dissertação. ... 80
APÊNDICE B – Artigos oriundos de dados gerados nessa dissertação. ... 101
APÊNDICE C – Artigos oriundos de pesquisas paralelas ... 103
APÊNDICE D – Termos de Consentimento Livre e Esclarecido ... 105
1 INTRODUÇÃO
1.1 As lipodistrofias
O tecido adiposo humano tem sido alvo de muitos estudos nos últimos anos dada a grande prevalência de várias condições clínicas como a obesidade, resistência à insulina e diabetes melito tipo 2 (revisado em VIGOUROUX et al., 2011). No interior das suas principais células, os adipócitos, existem organelas chamadas de vesículas de lipídeos (VLs), cuja função principal é a estocagem de triglicerídeos (TGs) para eventuais situações de limitação prolongada de suprimento alimentar (revisado em BELLER et al., 2010).
Ainda superficialmente conhecidas pela comunidade biomédica, as lipodistrofias, são um conjunto de síndromes caracterizadas pela quase completa falta do tecido adiposo. Podem ser fisiologicamente classificadas como adquiridas ou congênitas (Tabela 1), dependendo da ausência ou presença de um componente genético elicitador, respectivamente. Também podem ser chamadas de parciais ou generalizadas, variando de acordo com o grau do acometimento do tecido em questão (Tabela 1). Dentro do grupo das congênitas, as causas moleculares primárias são mutações em genes importantes para a homeostase dos adipócitos (revisado em PATNI et al., 2015).
As lipodistrofias generalizadas congênitas (LGCs), também conhecidas como síndromes de Berardinelli-Seip, são classificadas como: do tipo 1, causada por mutações no gene 1-acilglicerol-3-fosfato aciltransferase 2 (AGPAT2, do inglês acylglycerol-3-phosphate o-acyltransferase 2) (AGARWAL et al., 2002); do tipo 2, causada por mutações no gene lipodistrofia congênita de Berardinelli-Seip do tipo 2 (BSCL2, do inglês Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy type 2) (MAGRÉ et al., 2001); do tipo 3, por mutações em caveolina-1 (CAV1) (KIM et al., 2008) e do tipo 4 em cavina-1 (CAVIN1), também conhecida como fator de liberação do transcrito e polimerase 1 (PTRF, do inglês polymerase I and transcript release factor) (LIU et al., 2008).
As LGCs são muito prevalentes no Nordeste do Brasil, principalmente as causadas por mutações no gene BSCL2 (DE AZEVEDO MEDEIROS et al., 2017; GOMES et al., 2004; LIMA et al., 2016). Mesmo sendo uma raríssima síndrome no mundo todo, o seu estudo é de extrema importância para o Brasil, já que o
desconhecimento por parte dos profissionais da saúde, governantes e população é um fator que agrava o preconceito social (CANDIDO DANTAS et al., 2018; DAMASCENO et al., 2018), bem como atrasa o desenvolvimento de novas terapias para melhoria da qualidade de vida das pessoas com a LGC do tipo 2.
Tabela 1 – Lipodistrofias de etiologia genética mais importantes.
Tipo Gene afetado Localização
cromossômica Proteína Lipodistrofia
Parcial LMNA 1q22 Lamin-A/C FPLD do tipo 2
Parcial PPARG 3p25.2 PPARγ FPLD do tipo 3
Parcial PLIN1 15q26.1 Perlipin-1 FPLD do tipo 4 Parcial CIDEC 3p25.3 Cell death activator CIDE-3 FPLD do tipo 5 Generalizada AGPAT2 9q34.3 1-AGPAT 2 LGC do tipo 1
Generalizada BSCL2 11q12.3 Seipin LGC do tipo 2
Generalizada CAV1 7q31.2 Caveolin-1 LGC do tipo 3 Generalizada CAVIN1 17q21.2 Cavin-1 LGC do tipo 4 Fonte: adaptação da literatura revisada (revisado em GARG, 2011; revisado em VIGOUROUX et al., 2011). A tabela mostra a classificação das lipodistrofias genéticas agrupadas por tipo, junto com seus respectivos genes e proteínas relacionadas com as respectivas etiologias moleculares. AGPAT2: 1-acilglicerol-3-fosfato aciltransferase 2; BSCL: lipodistrofia congênita do tipo Berardinelli-Seip; CAV: caveolina; CAVIN: cavina; LGC: lipodistrofia generalizada congênita; CIDEC: Efetor c indutor de morte celular semelhante a DFFA; FPLD: lipodistrofia parcial familiar; LMNA: lamina A/C; PLIN: perilipina; PPARG: receptor gama ativado por proliferadores de peroxissomo.
As lipodistrofias congênitas usualmente são reconhecidas fenotipicamente desde o nascimento por causa da quase completa falta de tecido adiposo corporal e aparência de proeminente muscularidade (Figura 1). Além disso, no sangue dos lipodistróficos, é comum encontrar aumento das concentrações de insulina, triglicerídeos, glicose e do colesterol contido nas lipoproteínas de baixo peso molecular (LDL-c, do inglês cholesterol loaded into low-density lipoprotein), bem como diminuição das concentrações de leptina, adiponectina e do colesterol contido nas lipoproteínas de alto peso molecular (HDL-c, do inglês cholesterol loaded into high-density lipoprotein) (LIMA et al., 2016) (Figura 1). Dessa forma, os testes bioquímicos de análises clínicas são importantes para auxiliar o diagnóstico, mas somente técnicas de biologia molecular dão a certeza da classificação da LGC (revisado em GARG, 2011).
Figura 1 – Manifestações clínicas das lipodistrofias generalizadas congênitas, com ênfase para a do tipo 2. Adaptado, com autorização, de Cândido Dantas et al. 2018 (CANDIDO DANTAS et al.,
2018). Figura desenvolvida com arcabouços fornecidos pelo SMART (SMART - servier medical ART).
1.1.1 Seipina e a LGC do tipo 2
Durante vários anos, os pesquisadores buscaram diversos genes candidatos cujas funções explicariam os mecanismos bioquímicos e as manifestações clínicas das lipodistrofias. Em 2001, Magré e colaboradores associaram mutações em uma região do cromossomo 11q13 com o tipo 2 da LGC (MAGRÉ et al., 2001). Esse gene foi batizado de BSCL2 e sua proteína ganhou o nome de “seipina”, como um tributo ao médico Martin Seip, um dos pioneiros no estudo das lipodistrofias (SEIP et al., 1963). Dezoito anos após a sua associação com essas desordens do tecido adiposo, a função dessa proteína ainda não está totalmente compreendida.
Seipina é uma proteína localizada na membrana do retículo endoplasmático (RE) (WINDPASSINGER et al., 2004) e o seu gene é altamente expresso nos testículos e em algumas regiões do tecido nervoso (MAGRÉ et al., 2001). Ademais, sua transcrição é muito acentuada durante a adipogênese induzida por hormônios
(CHEN et al., 2008; MAGRÉ et al., 2001) e, em alguns modelos de adipócitos totalmente diferenciados, a sua alta expressão também já foi observada (PAYNE et al., 2008). Atualmente são conhecidas 3 isoformas de seipina, resultantes de variantes na sua expressão. A isoforma 1 possui 398 aminoácidos, enquanto as isoformas 2 e 3 possuem 287 e 462, respectivamente. A isoforma 3 tem uma sequência N terminal maior, enquanto a isoforma 2 é a mais diferente das outras duas, principalmente na sequência C terminal (revisado em CRAVEIRO SARMENTO et al., 2018).
Essa proteína também possui 2 regiões transmembranares, com suas extremidades C e N voltadas para o citosol, embora ainda existam divergências nas posições dos aminoácidos entre as previsões (AGARWAL et al., 2004; APWEILER et al., 2004; ITO et al., 2008; LUNDIN et al., 2006; MAGRÉ et al., 2001) (Figura 2). Em Escherichia coli, a expressão da seipina de Drosophila melanogaster gera uma proteína oligomérica formada por 12 subunidades (SUI et al., 2018). Em outra perspectiva, Yan e colaboradores observaram que a seipina humana também se oligomeriza, porém somente com 11 subunidades, representadas na Figura 3 (YAN et al., 2018). Esses estudos apresentam concordâncias com outros que já haviam sugerido uma forma radialmente simétrica de seipina, lembrando um toroide (BINNS et al., 2010; SIM et al., 2013). Até abril de 2019, não existem evidências para algum domínio ou atividade enzimática dessa proteína, embora já se saiba sobre o seu papel estrutural nas membranas (SIM et al., 2014).
A biossíntese de muitos lipídeos intracelulares inclui reações envolvendo ácidos graxos (AGs) e TGs. A síntese de TGs depende da disponibilidade de AGs e ocorre na maioria das células, com ênfase para os adipócitos e hepatócitos. As células geralmente recebem AGs das lipoproteínas do sangue com a finalidade de produzir energia ou sintetizar TGs para posterior armazenamento nas VLs (revisado em GLUCHOWSKI et al., 2017; revisado em WANG et al., 2015). Essas organelas nascem no RE, auxiliando na produção de energia e funcionando como local para armazenamento de alguns lipídeos neutros, como ésteres de colesterol e TGs (revisado em JOSHI et al., 2017).
Baixas concentrações de lipídeos podem existir no ambiente aquoso do RE, contudo, à medida que seu número aumenta durante a síntese de TGs, as VLs podem brotar em uma superfície de monocamada e se tornar estruturas independentes (revisado em OHSAKI et al., 2017). A Figura 4 resume os principais passos da biossín-
Figura 2 – Alinhamento das regiões transmembranares de seipina. Múltiplos alinhamentos das
isoformas de seipina foram realizados por meio do T-COFFEE (DI TOMMASO et al., 2011). É possível observar que, mesmo com diferenças, algumas regiões são conservadas na previsão para a mesma isoforma ou entre diferentes isoformas. A isoforma 2 foi omitida devido ao baixo número de trabalhos que se propuseram a estuda-la. A cor rosa representa alinhamentos idênticos; * representação de igualdade entre os aminoácidos. cons: sequência de consenso. Adaptado, com autorização, de Craveiro Sarmento et al. 2018 (CRAVEIRO SARMENTO et al., 2018).
Figura 3 – Estrutura tridimensional de seipina. A resolução da estrutura quaternária da seipina
humana foi recentemente publicada (YAN et al., 2018) e depositada no repositório público protein data
bank (PDB) (BERMAN et al., 2003) com o código 6DS5. Aqui, a sua visualização em 3 perspectivas foi
Figura 4 – Biossíntese intracelular de TGs e localização de seipina no RE. Durante a síntese dos
TGs, as fosfato aciltransferases (GPATs) catalisam a acilação na posição sn-1 do glicerol-3-fosfato (G3F) e dão origem ao ácido lisofosfatídico (ALF). Então, as 1-acilglicerol-3-glicerol-3-fosfato aciltransferases (AGPATs) catalisam a acilação na posição sn-2 do ALF e dão origem ao ácido fosfatídico (AF). Logo, as fosfatases fosfatidatos (PAPs), como a Lipin1, podem remover o grupo fosfato do AF e produzir diacilglicerois (DGs). Finalmente, as diacilglicerol aciltransferases (DGATs) catalisam a acilação na posição sn-3 e dão origem aos TGs (revisado em AGARWAL et al., 2003; revisado em LEUNG, 2001). No mesmo contexto, a seipina é uma proteína oligomérica e transmembranar do RE que atua na montagem das VLs. Figura adaptada, com autorização, de Craveiro Sarmento et al. 2018 (CRAVEIRO SARMENTO et al., 2018) e desenvolvida com arcabouços fornecidos pelo SMART (SMART - servier medical ART).
tese intracelular de TG, mostrando a usual localização de seipina e sua função no processo. Atualmente, é bem aceito que essa proteína tem importante papel na
montagem das VLs, já que essas organelas são vizinhas do RE e seipina está concentrada nas regiões de comunicação entre elas, onde permite a transferência de lipídeos recém sintetizados para essas organelas nascentes, auxiliando no seu amadurecimento (FEI et al., 2008; SZYMANSKI et al., 2007; WANG et al., 2016).
Embora muito relacionada com o metabolismo de lipídeos, seipina parece ter uma função tecido-específica, principalmente em situações de diferenciação adipocitária. Em modelos adipogênicos, o silenciamento ou nocaute do gene BSCL2 gera alterações na maturação dessas células, por também diminuir a síntese de TGs (CHEN et al., 2008) e estimular a lipólise (CHEN et al., 2012). Para os pesquisadores, uma das principais vias pela qual seipina seria importante para a adipogênese é por meio da regulação do principal fator de transcrição que controla esse processo: o receptor gama ativado por proliferadores de peroxissomos (PPARγ, do inglês peroxisome proliferator-activated receptor gamma). Chen e colaboradores observaram que o silenciamento do gene BSCL2 durante a adipogênese causou menor expressão do gene PPARG, e comprometimento desse processo. Todavia, o tratamento com um agonista da proteína PPARγ reverteu esse mecanismo, sugerindo que a seipina poderia ser importante para a cascata da adipogênese em um ponto anterior ao PPARγ (CHEN et al., 2008).
Em humanos, a perda de função de seipina e o surgimento da LGC do tipo 2 está relacionada com uma das mais graves formas de lipodistrofias, dada a quase completa ausência de tecido adiposo, juntamente com deficiência intelectual de muito leve a moderada e alguns casos de cardiomiopatias (BHAYANA et al., 2002; JENINGA et al., 2011; MALDERGEM et al., 2002). Para o melhor entendimento da LGC do tipo 2, foi preciso estudar a fundo as funções bioquímicas de seipina, dando origem ao primeiro artigo fruto das pesquisas dessa dissertação (CRAVEIRO SARMENTO et al., 2018). Por estar fora do escopo desse manuscrito, o aprofundamento dos detalhes bioquímicos de seipina poderá ser acessado na fonte supracitada (apêndice A).
A partir de revisões bibliográficas possibilitadas pelo último artigo publicado pelo grupo de pesquisa que conduziu essa dissertação (CRAVEIRO SARMENTO et al., 2019) (apêndice C), foi possível observar que a mutação c.325dupA, também conhecida como rs786205071, é muito encontrada na região Nordeste do Brasil. Além disso, os dados epidemiológicos apontam para a presença de aproximadamente 0,96 casos de lipodistrofia generalizada a cada 1 milhão de pessoas no mundo (CHIQUETTE et al., 2017), enquanto no Nordeste do Brasil, no estado do Rio Grande
do Norte, esse número aumenta significativamente para 32,3 casos com lipodistrofia generalizada para cada 1 milhão de nordestinos (DE AZEVEDO MEDEIROS et al., 2017). Esses dados ratificam a importância do estudo de mutações em seipina para a população do Brasil, com ênfase para a rs786205071. Além disso, o estudo dessa variante possui relevância do ponto de vista estatístico, por causa do elevado número de casos no mundo e no Brasil com essa mutação, em relação ao total de pessoas com lipodistrofias congênitas (CRAVEIRO SARMENTO et al., 2019). Além disso, poucos estudos moleculares se propuseram a trabalhar com efeitos fenotípicos dessa variação no genótipo.
1.2 A relação entre as lipodistrofias e obesidade
Em 2017, González-Muniesa e colaboradores revisaram o conceito de obesidade, definindo que essa condição é diagnosticada quando há um peso corporal desproporcional para a altura, com um acúmulo excessivo de tecido adiposo, geralmente acompanhada de inflamação sistêmica crônica leve. Ademais, esses autores também discutiram a alta relação entre a obesidade e a síndrome metabólica. Essa, por sua vez, é observada quando pelo menos 3 dos seguintes pontos são observados simultaneamente no mesmo indivíduo: (a) obesidade visceral: circunferência da cintura ≥94 cm em homens e ≥80 cm em mulheres; (b) trigliceridemia alta: ≥150 mg/dL; (c) HDL-c baixo: <40 mg/dL para homens e <50 mg/dL para mulheres; (d) pressão arterial elevada: sistólica ≥130 mmHg e diastólica ≥85 mmHg; e (e) glicemia alta: ≥100 mg/dL (revisado em GONZÁLEZ-MUNIESA et al., 2017).
Embora a circunferência da cintura de pessoas com lipodistrofias seja menor do que a dos obesos, alguns autores vêm mostrando vários aspectos em comum entre essas duas disfunções do tecido adiposo (revisado em CHEHAB, 2008; revisado em GARG, 2006). Em 2006, Garg já revisava que algumas pessoas com obesidade e com lipodistrofia usualmente apresentam resistência à insulina, diabetes, hipertrigliceridemia, HDL-c baixo e esteatose hepática. Entretanto, o padrão de secreção de alguns hormônios derivados do tecido adiposo seria diferente: enquanto que a secreção de adiponectina estaria comprometida nos dois casos, a da leptina seria maior na obesidade, mas menor nas lipodistrofias (revisado em GARG, 2006). Interessantemente, todos esses achados são classificados como causadores e intensificadores dos seguintes mecanismos indesejáveis em algumas pessoas
obesas: alterações na homeostase redox (revisado em MARSEGLIA et al., 2014) e na homeostase do RE (revisado em CNOP et al., 2012).
1.3 Alterações na homeostase redox
A interação do oxigênio (O2) com diversas moléculas leva a formação de espécies derivadas que podem reagir com vários componentes celulares. Essas espécies reativas do oxigênio (ERO) podem, em alguns casos, ter um elétron desemparelhado altamente reativo na sua última camada de valência, sendo também chamadas de radicais livres. Essas ERO são produzidas a partir de processos endógenos intracelulares e possuem importantes funções na sinalização celular. Não obstante, as altas concentrações das ERO podem ter efeitos indesejáveis, o que as tornam substratos para mecanismos neutralizantes conhecidos como defesa antioxidante. O desbalanço entre o aumento da produção das ERO e/ou a diminuição da sua eliminação por mecanismos antioxidantes é conhecido como estresse oxidativo ou alterações na homeostase/metabolismo redox (revisado em LIGUORI et al., 2018).
Por evitar os danos que as ERO podem causar às macromoléculas celulares, a função do fator 2 relacionado ao fator nuclear eritroide 2 (NFE2L2, do inglês nuclear factor erythroid 2-related factor 2), foi selecionada como uma das principais reguladoras da resposta antioxidante. Em situações de alterações na homeostase redox, o fator de transcrição NFE2L2 citoplasmático se desliga de sua molécula inibitória, conhecida como proteína 1 associada a ECH semelhante a Kelch (KEAP1, do inglês Kelch-like ECH-associated protein 1). Então, NFE2L2 é translocado para o núcleo, onde participa da transcrição de genes importantes para a proteção celular (revisado em SILVA-ISLAS et al., 2018), como os genes da maquinaria antioxidante da glutationa, a qual permite a metabolização do H2O2, uma importante ERO. Enquanto a ação da NFE2L2 pode ser entendida como uma das primeiras respostas temporais às alterações na homeostase redox, os mecanismos de reparo ou morte celular fazem parte de uma segunda resposta temporal aos danos já ocorridos (revisado em TONELLI et al., 2018).
As modificações oxidativas geradas no ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid) são bastante comuns e causam modificações na estrutura das bases nitrogenadas, convertendo-as em lesões oxidadas. Uma das
bases mais frequentemente alteradas é a guanina, a qual pode se tornar a 8-oxoguanina (8-oxoG), substrato para a ação da DNA glicosilase de 8-8-oxoguanina (OGG1, do inglês 8-oxoguanine DNA glycosylase) e, posteriormente, da endonuclease 1 de sítios apurínicos/apirimidínicos (APE-1, do inglês apurinic/apyrimidinic endonuclease 1), as quais atuam na via de reparo do DNA por excisão de bases (BER, do inglês base excision DNA repair) (revisado em KROKAN et al., 2013). Embora esteja relacionada com a primeira resposta temporal às alterações na homeostase redox, NFE2L2 também pode auxiliar positivamente na transcrição de genes que codificam para enzimas da via BER, como a OGG1. De fato, deficiências na expressão de NFE2L2 estão intimamente relacionadas com deficiências de expressão de OGG1 (SINGH et al., 2013).
Um dos compartimentos celulares mais susceptíveis aos danos pelas ERO são as mitocôndrias, já que de 1 a 5% do O2 é naturalmente convertido nessas espécies ao final da cadeia transportadora de elétrons em situações saudáveis. Por estar fisicamente mais próximo de uma das grandes fontes intracelulares das ERO, o DNA mitocondrial (DNAmt) é cercado por uma eficiente maquinaria de enzimas da via BER, já que modificações no seu genoma podem gerar disfunções nessa organela e, consequentemente, comprometer a função geral da célula (revisado em BHAT et al., 2015), uma situação já descrita para o câncer (revisado em HSU et al., 2016), doenças neurodegenerativas (revisado em JOHRI et al., 2012) e envelhecimento (revisado em SUN et al., 2016).
Por outro lado, as modificações geradas em moléculas lipídicas acontecem quando as ERO reagem com lipídeos que possuem duplas ligações carbono-carbono, especialmente os AGs poli-insaturados. Sua oxidação dá origem a produtos finais de peroxidação que podem ser danosos para as células, como o malondialdeído e o 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE). Quando em baixas concentrações, o 4-HNE possui importante função de sinalização para a montagem da resposta antioxidante, também por meio do estímulo da via NFE2L2. Porém, em altas concentrações, o 4-HNE estimular a morte celular (revisado em AYALA et al., 2014).
1.4 Alterações na homeostase do RE
O retículo endoplasmático (RE) é uma organela especializada na síntese, dobramento e transporte de proteínas em células eucarióticas. A estrutura terciária
dessas macromoléculas é essencial para a sobrevivência celular e o seu acúmulo fora de suas conformações nativas pode comprometer a proteostase. Situações nas quais proteínas mal dobradas se acumulam nessa organela desencadeiam o que se conhece como estresse do RE, o seu principal distúrbio da homeostase (revisado em TODD et al., 2008; revisado em WANG et al., 2016).
Vários estímulos podem desencadear esse mecanismo, tais como: inflamação, limitação de nutrientes, aumento da tradução global, deficiência de ubiquitinação, deficiência de autofagia, depleção energética, desequilíbrio na concentração de cálcio, hipóxia, e ação química de tunicamicina e tapsigargina. Esse estresse dispara o que se conhece como resposta às proteínas mal dobradas (UPR, do inglês unfolded protein response), um mecanismo que pode ser quantificado para indicação da presença de disfunções nessa organela. Caso o evento estressor seja resolvido e a homeostase celular recuperada, essa lesão é caracterizada como reversível. Não obstante, uma lesão celular irreversível poderá acontecer se a UPR for ativada constantemente em situações de estresse do RE causadas por mutações que alteram o padrão de dobramento proteico de genes que codificam para proteínas que passam por ou possuem sua localização final nessa organela (revisado em TODD et al., 2008; revisado em WANG et al., 2016).
A UPR se inicia quando proteínas fora de suas conformações nativas no RE atraem chaperonas, como o membro 5 da família de proteínas de choque térmico A (HSPA5, do inglês heat shock protein family A member 5), também muito conhecida como proteína ligadora de imunoglobulina (BiP, do inglês binding-immunoglobulin protein). Normalmente, HSPA5 está fisicamente ligada à 3 proteínas transmembranares dessa organela: o fator 2 alfa quinase 3 de iniciação de tradução eucariótico (EIF2AK3,do inglês eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3), também chamada de quinase do retículo endoplasmático semelhante a PKR (PERK, do inglês PKR-like endoplasmic reticulum kinase); a enzima 1 requerente de inositol (IRE1, do inglês inositol requiring 1) e o fator 6 de ativação da transcrição (ATF6, do inglês activating transcription factor 6) (revisado em WANG et al., 2016). Durante o estresse do RE, a separação física de HSPA5 e EIF2AK3 permite que esse último também se oligomerize, o que provoca a fosforilação do fator 2 alfa de iniciação de tradução eucariótico (EIF2α, do inglês eukaryotic translation initiation factor 2-alpha). Essa proteína tem a atividade de parar seletivamente a tradução geral da
célula, com o objetivo de atenuar temporariamente a entrada de mais proteínas nessa organela (revisado em TODD et al., 2008; revisado em WANG et al., 2016).
Paralelamente, o desligamento de HSPA5 de IRE1 faz com que suas isoformas α e β se oligomerizem e ativem a via das quinases jun N-terminal (JNK, do inglês c-jun N-terminal kinase). Além disso, a atividade de endorribonuclease de IRE1 possibilita a remoção de alguns nucleotídeos do ácido ribonucleico (RNA, do inglês ribonucleic acid) mensageiro (RNAm) do gene que codifica para a proteína ligadora de X-box (XBP1, do inglês X-box-binding protein 1). Esse processamento, muito conhecido como “splicing de XBP1” permite que esse transcrito seja traduzido na forma ativa de XBP1, um importante fator de transcrição. Ao mesmo tempo, ATF6 transloca-se para o complexo de Golgi e é clivado, produzindo fragmentos que induzem a transcrição de genes que codificam para diversas chaperonas. Essa via pode aumentar a expressão do transcrito 3 induzido por dano de DNA (DDIT3, do inglês DNA damage-inducible transcript 3), muito conhecido como proteína homóloga à proteína ligadora do acentuador CCAAT (CHOP, do inglês CCAAT/enhancer-binding potein-homologous protein), a qual prepara a célula para morte celular programada em casos de estresse não reversível. Ao final, as proteínas mal dobradas são marcadas para ubiquitinação e degradadas no proteassomo, num processo conhecido como degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD, do inglês endoplasmic reticulum-associated degradation) (revisado em TODD et al., 2008; revisado em WANG et al., 2016).
Em último lugar, é importante destacar que o aumento das concentrações das ERO também pode desencadear o estresse do RE de forma indireta (BANERJEE et al., 2017). Por meio da peroxidação dos lipídeos, o 4-HNE pode ser formado e se agregar de forma inespecífica com várias proteínas dessa organela. Isso compromete a proteostase (revisado em DALLEAU et al., 2013), por gerar adutos de proteínas (HABERZETTL; HILL, 2013), induzindo a UPR (VLADYKOVSKAYA et al., 2012). Um clássico exemplo de proteína que pode ser alterada por produtos de peroxidação lipídica é a P4HB, muito conhecia como proteína disulfeto isomerase (PDI, do inglês protein disulfide-isomerase), uma das principais chaperonas do RE (MULLER et al., 2013).
1.5 Papel das lipoproteínas nas alterações na homeostase redox e do RE
Modificações nas concentrações séricas das lipoproteínas também podem modular a homeostase redox e do RE. A lipoproteína de baixa densidade (LDL, do inglês low-density lipoprotein) já foi mostrada como sendo uma partícula pró-oxidante quando a incubação de fibroblastos humanos com essa lipoproteína aumentou a concentração das ERO intracelulares, bem como dos produtos finais de peroxidação lipídica (MAZIÈRE et al., 2000). Ademais, outros pesquisadores já observaram correlação significativa entre o aumento das concentrações do LDL-c e dos marcadores de alterações na homeostase redox (AL-BENNA et al., 2006) e inflamação (LARA-GUZMÁN et al., 2018). Enquanto a LDL aumenta essas espécies, a lipoproteína de alta densidade (HDL, do inglês high-density lipoprotein) contrabalanceia esse mecanismo por meio de uma importante ação antioxidante. Essa molécula diminuiu a concentração das ERO intracelulares em cultura de células musculares (ROBBESYN et al., 2003), e o seu papel positivo na regulação do status redox das células já inspirou estudos que concluíram que ela poderia ser uma molécula auxiliar no tratamento do câncer de próstata por reduzir a proliferação celular induzida pelas ERO (RUSCICA et al., 2018) (Figura 5).
A atividade antioxidante dessa lipoproteína se dá por causa de uma enzima confinada dentro de sua membrana: a paraoxonase-1 (PON 1). Polimorfismos no gene PON1 que diminuem suas atividades plasmáticas estão associados com aumento de alterações na homeostase redox (BHATTACHARYYA et al., 2008; ROZENBERG et al., 2003). A PON 1 regula negativamente a produção do ânion superóxido, um tipo de ERO, prevenindo a apoptose (CAMPS et al., 2016) e agindo naturalmente no metabolismo de lipídeos oxidados. Originalmente, a molécula da HDL foi vista como sendo importante por impedir a oxidação da LDL e ajudar na prevenção da formação do ateroma. Além disso, sua ação pode contribuir para proteção dos complexos mitocondriais contra a degradação causada pelas lisofosfatidilcolinas (revisado em WHITE et al., 2017), lipídeos pró-inflamatórios que causam danos nessa organela (HOLLIE et al., 2014). Hansel e colaboradores observaram que pessoas obesas que apresentavam um aumento do LDL-c, diminuição do HDL-c, resistência à insulina e hiperglicemia também apresentavam estresse oxidativo e baixa atividade antioxidante da HDL. (HANSEL et al., 2004) (Figura 5).
Figura 5 – Moduladores plasmáticos de alterações na homeostase redox e mecanismos antioxidantes. A hiperglicemia aumenta a concentração das ERO intracelulares por meio da formação
de sorbitol e frutose, em reações que diminuem NADPH e aumentam NADH, respectivamente. A HDL funciona como antioxidante por meio da ação da enzima paraoxonase, a qual metaboliza lipídeos que induzem a formação de mais ERO, como as lisofosfatidilcolinas. Além disso, a adiponectina, secretada pelo tecido adiposo, promove a fosforilação do AMPK, que ativa NFE2L2 para auxiliar na transcrição de genes da resposta antioxidante. Figura desenvolvida com arcabouços fornecidos pelo SMART (SMART - servier medical ART).
A presença excessiva da LDL também pode comprometer a homeostase do RE (NICULESCU et al., 2013; PLAISANCE et al., 2016; SONG et al., 2016), uma vez que, em concentrações intracelulares elevadas, ela induz o acúmulo não controlado de colesterol livre dentro dessa organela, um mecanismo que ativa a via de morte celular dependente de DDIT3. Contudo, esse mecanismo pode ser antagonizado pela HDL, no momento em que essa partícula estimula vias que aumentam a expressão do membro 1 dos receptores de classe B do tipo scavenger (SCARB1, do inglês scavenger receptor class B member 1), o seu principal receptor, estimulando a saída desse colesterol. Ademais, a ação da HDL contra o estresse do RE é tão significativa que essa molécula consegue reduzir significativamente as consequências do principal estressor do RE utilizado em cultura de células: a tunicamicina (SONG et al., 2016). Além disso, a LDL pode inibir indiretamente a atividade de P4HB (MULLER et al., 2013). De fato, a hipercolesterolemia está bastante associada com doenças metabó- licas por meio do estresse do RE (revisado em SOZEN et al., 2017) (Figura 6).
1.6 Papel da glicemia nas alterações na homeostase redox e do RE
O aumento concentração de glicose no sangue (hiperglicemia) também gera alterações na homeostase redox intracelular (revisado em CANNIZZARO et al., 2017). Alguns autores demonstraram que as essas condições inibem a atividade de alguns membros de uma importante família de enzimas da defesa antioxidante: as tiorredoxinas (SCHULZE et al., 2004). Ademais, quando a glicose reage com algumas moléculas, são formados os produtos de glicação avançada (AGE, do inglês advanced glycation end products), os quais podem ligar-se nos receptores dos produtos de glicação avançada (AGER, do inglês receptor for advanced glycation end products), expressos em várias células. A cascata de sinalização AGE-AGER ativa enzimas que geram muitas ERO em suas atividades, culminando indiretamente na formação de moléculas como o 4-HNE (revisado em CANNIZZARO et al., 2017) (Figura 5).
Em paralelo, as altas concentrações de glicose dentro de algumas células desencadeiam a via dos polióis. Inicialmente, essa hexose é convertida no álcool sorbitol por meio da ação da enzima aldose redutase, à qual necessita do fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADPH, do inglês nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) como cofator. Logo então, o sorbitol é convertido em frutose
Figura 6 – Moduladores plasmáticos do estresse do RE e mecanismos de reversão. As altas
concentrações da LDL predispõem ao acúmulo de colesterol no RE, o que desencadeia a UPR, um mecanismo antagonizado pela HDL. As altas concentrações das ERO causam peroxidação lipídica, que produz 4-HNE, uma molécula que pode se agregar no RE, gerando estresse. A glicose também pode interagir com proteínas dessa organela, alterando suas conformações. A adiponectina, ao fosforilar AMPK, inibe a ação de PPARα, não permitindo que haja a transcrição do gene ATF2 e estímulo ao estresse do RE. Figura desenvolvida com arcabouços fornecidos pelo SMART (SMART -
por meio da ação da enzima sorbitol desidrogenase, numa reação que aumenta as concentrações do dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH, do inglês nicotinamide adenine dinucleotide). O consumo do NADPH pela aldose redutase diminui as suas concentrações intracelulares, o que é prejudicial para o mecanismo antioxidante da glutationa. Ademais, a ação da enzima sorbitol desidrogenase no aumento das concentrações de NADH causam a ativação da NADH oxidase, numa atividade que naturalmente gera muitas ERO (revisado em MATHEBULA, 2015).
Juntos, esses mecanismos desencadeiam alterações na homeostase redox em pessoas com hiperglicemia constante, mais conhecidas como portadoras do diabetes melito (revisado em ROBERTSON et al., 2007) (Figura 5). Para o RE, a hiperglicemia também pode ser tóxica. A ligação inespecífica dessa hexose em proteínas dessa organela pode formar produtos de glicação que ativam a UPR (revisado em PIPERI et al., 2012). Além disso, alguns intermediários da via glicolítica, quando em concentrações elevadas, também podem ativar a UPR (revisado em SHEIKH-ALI et al., 2010) (Figura 6).
1.7 Papel da adiponectina nas alterações na homeostase redox e do RE
Um importante mecanismo de atenuação para os efeitos indesejáveis da hiperglicemia é mediado pelo hormônio adiponectina, secretado principalmente pelo tecido adiposo. Após a ligação nos seus receptores, a transdução do sinal mediada por esse hormônio culmina na fosforilação da proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina (AMP, do inglês adenosine monophosphate) (AMPK, do inglês AMP-activated protein kinase). Essa enzima ajuda na cascata de sinalização da insulina, reduzindo a hiperglicemia por ser um estímulo positivo à sensibilidade a esse hormônio (revisado em FANG et al., 2018). Essa quinase é conhecida por fosforilar o fator de transcrição NFE2L2, permitindo o seu translocamento do citoplasma para o núcleo (JOO et al., 2016). De fato, o aumento da concentração de adiponectina no plasma culmina no aumento da expressão e atividade de NFE2L2 nas células (LI et al., 2015; REN et al., 2017) (Figura 5).
A adiponectina também ajuda na proteção contra o estresse do RE e suas consequências negativas. O tratamento com esse hormônio já foi mostrado como sendo auxiliar na diminuição da apoptose de células endoteliais submetidas à esse mecanismo bioquímico (HOU et al., 2018). Ademais, células musculares de ratos
nocauteadas para o gene que codifica para adiponectina apresentaram marcadores de estresse do RE e inflamação aumentados (BODDU et al., 2014). Em situações de esteatose hepática não alcoólica, esse hormônio já foi mostrado como atenuador das disfunções no RE (UENO et al., 2011). Ao ativar AMPK, a adiponectina diminui indiretamente a transcrição do receptor alfa ativado por proliferadores de peroxissomos (PPARα, do inglês peroxisome proliferator-activated receptor alpha) em adipócitos. Usualmente, esse fator de transcrição ligar-se-ia no fator 2 de ativação da transcrição (ATF2, do inglês activating transcription factor 2), uma proteína que também ajuda a desencadear a UPR (LIU et al., 2016) (Figura 6).
1.8 Papel da seipina nas alterações na homeostase redox e do RE
Além dos moduladores plasmáticos das alterações na homeostase redox e do RE, modificações em proteínas intracelulares também podem ter influência nesses mecanismos. Recentemente, Sánchez-Iglesias mostrou que a transcrição de BSCL2 se correlacionava significativamente com a transcrição de enzimas do sistema antioxidante, num modelo experimental de autópsias de regiões específicas do tecido nervoso humano. Além disso, concluiu que a superexpressão de BSCL2 em cultura de células SH-SY5Y1 aumentava a transcrição de genes importantes para a defesa antioxidante. Todavia, o que ainda não está claro é: i) se a presença de seipina auxiliaria na proteção antioxidante, já que essa proteína poderia ajudar direta ou indiretamente na expressão das enzimas antioxidantes como efeito; ou ii) se a presença de seipina teria um papel pró-oxidante, estimulando uma resposta antioxidante que culminaria na expressão das enzimas antioxidantes como consequência (SÁNCHEZ-IGLESIAS et al., 2018). Caso a função canônica de seipina esteja relacionada com expressão de proteínas do sistema antioxidante numa relação tecido-independente (proposição “i”), é possível inferir que as mutações de perda de função no seu gene seriam importantes para gerar estresse nessas células por culminar em disfunções na atividade de enzimas antioxidantes.
Embora a possibilidade acima descrita ainda precise de mais estudos para confirmação, alguns trabalhos já encontraram situações em que há a propensão para alterações na homeostase redox em pessoas com lipodistrofias. Em uma portadora
de mutação em BSCL2, marcadores de danos mitocondriais secundários foram encontrados na urina (JENINGA et al., 2011). Da mesma forma, já foi visto que, em pessoas com lipodistrofias, a fosforilação oxidativa estaria disfuncional (SLEIGH et al., 2012). Mesmo que esses achados sejam clássicos precursores de alterações na homeostase redox em pessoas com lipodistrofias, ainda não é possível afirmar que a disfunção de seipina poderia ser a sua causa elicitatória de forma suficiente e direta.
Seipina, por ser uma proteína do RE, contribui direta ou indiretamente para a homeostase dessa organela. Contudo, não é possível dizer que a ausência de sua função, nem a presença de mutações que impeçam seu correto dobramento estão sempre associadas com a UPR. A Tabela 2 resume os principais trabalhos que se propuseram a estudar a expressão quantitativa e qualitativa de seipina e sua relação com o estresse do RE. Em situações de diminuição quantitativa na expressão de seipina (silenciamento ou nocauteamento gênico), observa-se que 50% dos trabalhos demonstram positividade para o disparo da UPR (BI et al., 2014; LIU et al., 2014; LOUNIS et al., 2017; ZOWALATY et al., 2017), enquanto que os outros 50% não apresentaram esse mecanismo (CHEN et al., 2012; WANG et al., 2016, 2018; ZHOU et al., 2014). Por conseguinte, mais estudos são necessários para demonstrar os padrões de montagem da UPR secundários à ausência de seipina em diferentes tecidos.
Ademais, em situações de alterações qualitativas em seipina (mutações que alteram o dobramento dessa proteína), o estresse do RE também não é encontrado em todos os artigos. As mutações N88S e S90L são exemplos que não afetam a função de seipina, porém seu dobramento comprometido é suficiente para gerar estresse do RE (ITO et al., 2007). Elas são diferentes da R96H, na qual nem a função de seipina é comprometida, nem as modificações no dobramento proteico são suficientes para a geração do estresse do RE (HSIAO et al., 2016). Por outro lado, a mutação de A212P tanto compromete a função, como o correto dobramento de seipina, gerando estresse do RE (QIU et al., 2013).
Nesse ponto, é importante ressaltar que o estudo de Ito e colaboradores em 2008 (ITO et al., 2008) tentou observar um padrão de como as alterações qualitativas de seipina poderiam gerar estresse do RE. Esses pesquisadores expressaram vários tipos de seipina em células humanas HeLa e traçaram quais seriam suas sequências aminoacídicas essenciais para geração de UPR. Suas principais evidências apontaram que a primeira região transmembrânica de seipina seria essencial para sua
