Distrofia de Fuchs é uma desordem bilateral e progressiva da córnea6, clinicamente caracterizada pela formação de córnea guttata (deposição anormal de fibras colágenas), espessamento da membrana de Descemet e perda acentuada de células endoteliais da córnea, a qual resulta em disfunções corneanas e diminuição da visão59. Embora duas formas bem definidas de acordo com a idade de início sejam reconhecidas81 e, alguns genes associados a esta afecção tenham sido identificados (entre eles o COL8A27, SLC4A114 e o TCF447), a fisiopatologia da doença ainda permanece pouco compreendida58.
Mutações de ponto são uma das causas mais comuns de doenças genéticas em humanos e, aproximadamente, metade destas afetam sítios de splicing. Consequentemente, o alto número de doenças associadas a genes com muitos éxons e íntrons é relacionado ao fato de que nesses genes há um maior número de sítios regulatórios de splicing alternativo, os quais são alvos mais suscetíveis a mutações80.
O processo de splicing alternativo do pré-RNAm é o principal contribuinte para a diversidade proteômica dos organismos eucarióticos, permitindo que diferentes isoformas de proteínas sejam sintetizadas a partir do mesmo conjunto gênico e que atuarão de diferentes maneiras nos tecidos alvos. Estudos revelam que falhas neste mecanismo, decorrentes de mutações, podem interferir em sítios de splicing ou elementos regulatórios e estar associadas a doenças em humanos71,72. Este processo é catalisado por 5 pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP, do inglês small nuclear ribonucleoprotein, as quais são complexos formados por pequenos RNAs nucleares associados a proteínas e denominados U1, U2, U4, U5 e U6) e que, combinadas a outras mais de 100 proteínas auxiliares, formam um grande complexo conhecido como spliceossomo (Figura 12a), cuja função é a remoção dos íntrons do pré-RNAm72,73,84.
Entretanto, além do complexo spliceossomo, diversos outros fatores também são indispensáveis para que ocorra o mecanismo de splicing: os elementos Cis, dos quais fazem parte os sítios de splicing 5’s – GU e 3’s –AG; o ponto de ramificação (BP, do inglês branch point), marcado por uma adenina que é reconhecida pela maquinaria de splicing; o trato Polipirimidínico (PPT, do inglês Polypyrimidine Tract), sítio rico em nucleotídeos pirimidínicos e crucial para a montagem do spliceossomo e regulação do processo de splicing alternativo; além das sequências relacionadas à ativação (intronic e exonic splicing enhancers - ISEs e ESEs) e repressão (intronic e exonic splicing silencers - ISSs e ESSs) de splicing, as
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quais recrutam os fatores Trans, que compreendem em outras proteínas regulatórias ligantes de RNAm, como por exemplo, as proteínas ricas em Serina (SR proteins) e a classe das hnRNPs 71,72,73,74,79, como mostra a figura 12b.
Figura 12. Elementos e fatores indispensáveis para a regulação do processo de splicing do pré-RNAm. (A) Montagem do spliceossomo: se inicia com a ligação da snRNP U1 ao sítio 5’ e dos fatores de splicing U2AF65 e U2AF35 ao trato polipirimidínico e sítio 3’, respectivamente, formando o complexo E. Em seguida, a snRNP U2 se liga ao ponto de ramificação, formando o complexo A. Então, U4, U6 e U5 são recrutadas formando o complexo B. Em um último processo catalítico, rearranjos entre os componentes e interações com o pré-RNAm formam o complexo C. Fonte: ADAPTADO de SOLIS et al., 2008. (B): Elementos Cis e fatores Trans indispensáveis para a regulação do splicing: sítio de splicing 5’S (GU) e 3’S (AG), ponto de ramificação (representado por um nucleotídeo
adenina), o trato polipirimidínico – (Py)n (região rica em pirimidinas), sequências relacionadas à repressão (ISS e ESS) e ativação (ISE e ESE) de splicing. Ribonucleoproteínas heterogêneas (hnRNPs) e proteínas ricas em serinas (SR proteins) também participam deste processo. Fonte: ADAPTADO de YEAP, NAMASIVAYAM, HO, 2014.
Neste estudo, foi observado a presença da deleção c.1172-19_1172-18delTC (rs113277027) co-segregando com o fenótipo da doença na família 3 (figura 6). Embora já descrita segundo o banco de dados Exome Aggregation Consortium (ExAC), não há relatos de associação desta deleção com a FECD.
Análises in silico (figuras 7 e 8) revelaram que essa deleção suprime um sítio de ligação de uma Ribonucleoproteína heterogênea tipo I, PTB, também conhecida como Polypyrimidine tract-binding protein 1 ou PTBP1, nos transcritos mutantes. As hnRNPs estão entre as proteínas nucleares mais importantes na maturação do pré-RNAm e, juntamente com diversas outras proteínas regulatórias ligantes de RNAm, participam da ativação ou supressão de splicing alternativo dos genes82. Especificamente, a PTB possui uma afinidade de ligação à região do trato polipirimidínico (presente na porção 3’de íntrons) e é uma proteína regulatória conhecida por sua associação com regiões relacionados à repressão de splicing, afetando muitos éxons alternativos82,83. Esta proteína pode competir por sítios-alvo de outras proteínas regulatórias participantes do mecanismo de splicing, inibindo a montagem do spliceossomo85, ou ainda interferir no reconhecimento funcional do sítio de splicing 3’ de alguns genes72,75,85. Interessantemente, de acordo com FU & ARES, não há uma divisão simples de papel positivo ou negativo de proteínas regulatórias no mecanismo de splicing, devido ao fato deste processo ser controlado por inúmeros fatores que agem em conjunto75.
Desta forma, é possível que a supressão do sítio de ligação da Ribonucleoproteína PTB nos transcritos mutantes interfira também em alguma outra proteína regulatória ou sítio funcional de splicing do gene SLC4A11 (proposição feita também por FU & ARES em 2014). Esta interferência pode gerar padrões anormais de splicing e culminar em retenção intrônica ou retirada de um éxon, fato que resultaria em perda ou função anormal da proteína processada.
Visto que o gene SLC4A11 é expresso nas células endoteliais e epiteliais da córnea, atuando no transporte eletrogênico e na via condutora de água55-58, é plausível que esses distúrbios comprometam a homeostase e regulação da hidratação normal do tecido corneano,
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processo fundamental para a manutenção da córnea. Esse comprometimento da função normal do gene SLC4A11 pode resultar ainda em estresse celular e, consequentemente, no aumento do processo de apoptose, fato observado por LIU & colaboradores61 em córneas de pacientes com a FECD. Estudos anteriores relatando que a expressão reduzida (knockdown) do gene SLC4A11 induz mudanças no pH celular e, que mutações neste gene podem comprometer a função da proteína processada em células da córnea de pacientes com a FECD57,59, também reforçam nossa hipótese de que alterações no gene SLC4A11 podem contribuir para a FECD.
Entretanto, é possível que a deleção não seja suficiente para interferir em padrões normais do gene SLC4A11 devido ao fato do mecanismo de splicing ser controlado por inúmeros fatores, sendo a deleção apenas uma alteração em que foi verificada uma segregação familiar (família 3) e que não foi encontrada na amostra controle analisada. Este fato pode ser explicado devido à grande variabilidade de frequência desta deleção nas mais variadas populações, como pode ser observado na Figura 13.
O grande número de proteínas regulatórias de splicing que possuem o mesmo sítio de ligação no pré-RNAm, porém propriedades bioquímicas completamente diferentes, podendo gerar diferentes efeitos na regulação de splicing, o fato de que muitas proteínas regulatórias de splicing funcionam em complexos com outras proteínas, interferindo na especificidade de ligação umas das outras, e a impossibilidade de uma divisão simples de função positiva ou negativa na regulação de splicing por parte da classe das hnRNPs75 dificultam melhores afirmações da exata consequência que a deleção rs113277027 possui sobre o gene SLC4A11. É possível que haja uma espécie de “código de splicing” devido ao fato de existirem um grande número de proteínas regulatórias de splicing que reconhecem distintas sequências de pré-RNAm. Este “código” poderia ajudar numa exata compreensão dos resultados e/ou funções no mecanismo de splicing das mais variadas proteínas regulatórias em diferentes tipos celulares. Não é descartado também, a hipótese de que alterações em outros genes em loci próximos ao gene SLC4A11 possam agir como moduladores. Isto torna o gene SLC4A11 um interessante alvo a ser melhor estudado.
Figura 13. Frequência da deleção rs113277027 em diferentes populações, segundo os bancos de dados Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) (A) e Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org) (B). Note a grande diferença de frequência da deleção nas diferentes populações.
Avaliou-se também a expansão intrônica TGC (CTG18.1) no gene TCF4, amplamente relatado na literatura por sua forte relação com a FECD63-70. A expansão foi verificada apenas na família 1. Nesta família, a expansão estava presente em um total de 9 indivíduos, sendo 8 afetados pela FECD, indicando uma penetrância incompleta, porém alta, de 88,89%. Observou-se um indivíduo não afetado, com 76 anos de idade, portador de um alelo expandido (16/66 repetições), mas que não expressa o fenótipo da doença, fato que pode indicar que a expansão seja uma mutação casual com uma penetrância incompleta. A expansão estava ausente nas outras duas famílias analisadas (Figura 11). Além disso, não foi observado a presença da expansão em homozigose neste estudo, como já observado por
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NAKANO & colaboradores70 em pacientes japoneses com a FECD, mas em oposição aos resultados de MOOTHA & colaboradores68 encontrados em uma população caucasiana.
A sensibilidade, isto é, a capacidade da expansão CTG18.1 em identificar um indivíduo afetado corretamente, foi de 72,7% enquanto que a especificidade, ou seja, a capacidade da expansão em identificar e excluir corretamente os indivíduos saudáveis, foi de 85,7% na família 1. Estes resultados são semelhantes aos de WIEBEN & colaboradores67, que observaram uma sensibilidade e especificidade de 79% e 96%, respectivamente, em uma população caucasiana, e bem diferentes do que os 26% de sensibilidade descritos por NAKANO & colaboradores70 em uma população japonesa. Este fato pode ser um indicativo de uma grande variabilidade de penetrância deste marcador comum presente nas diferentes populações.
Microssatélites com expansões anormais podem resultar em inibição da transcrição ou perda da função proteica e, assim, serem associados a doenças. Enquanto transcritos normais são destinados ao citoplasma, moléculas de pré-RNAm contendo repetições nucleotídicas anormais estão ligadas ao sequestro de proteínas regulatórias ligantes de RNAm. Esse sequestro favorece a formação de estruturas secundárias entre a proteína ligante de RNA e o pré-RNAm, que se agregam por meio dessa interação na região da expansão e ficam retidas no núcleo, sendo patogênicas e conferindo toxicidade à célula, além de gerar erros de processamento do pré-RNAm. Essas estruturas são conhecidas como RNA foci77 (Figura 14).
Figura 14. Mecanismo de formação de RNA foci. Sequestro de proteínas regulatórias ligantes de RNAm que interagem com regiões de repetição expandidas do pré-
RNAm e induzem a formação de estruturas patogênicas conhecidas como RNA foci. Fonte: ADAPTADO de WALSH et al., 2015.
Em algumas doenças, como na Distrofia Miotônica 1 (DM1) que é causada pela repetição anormal da trinca de nucleotídeos (CTG)n no gene DMPK, estas expansões estão diretamente ligadas ao sequestro de uma proteína regulatória ligante de pré-RNAm conhecida como muscleblind-like protein 1 ou muscleblind like splicing regulator 1 (MBNL1)86,87. Esta proteína pertence à uma família de proteínas ligantes de pré-RNAm conhecidas por sua potente atividade reguladora de splicing alternativo e que desempenha importantes funções, por exemplo, nos músculos e no desenvolvimento do olho, além de sua relação com a Distrofia Miotônica 188. Este sequestro, devido à alta afinidade desta proteína regulatória a transcritos contendo estas expansões (CUG)n, tem como consequência a formação de agregados patogênicos (moléculas da proteína MBNL1 associadas a moléculas de pré-RNAm contendo repetições anormais de CUG) que ficam retidos no núcleo (RNA foci) e, devido à perda de atividade desta proteína regulatória70,76,77,78, padrões anormais de splicing alternativo são observados em pacientes com a DM187,89,90.
Observações semelhantes vêm sendo replicadas na FECD. Diversos estudos, como por exemplo o de DU & colaboradores76, vêm demonstrando através da técnica de Hibridização in situ por fluorescência (FISH, do inglês Fluorescence in situ hybridization) a co-localização de agregados nucleolares de moléculas da proteína regulatória MBNL1 associadas à RNAm contendo repetições anormais da trinca (CUG)n em células da córnea de pacientes com a FECD e que possuem a expansão CTG18.1 no gene TCF4. Interessantemente, estes agregados patogênicos não são detectados em córneas de indivíduos não afetados pela FECD e também não são observados em córneas de pacientes com a FECD que não possuem a expansão do microssatélite CTG18.1 (Figura 15)70,76,91.
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Figura 15. RNA FISH (Técnica que permite a detecção e localização de moléculas de RNAs alvos). Em (1) e (2), Co-localização em RNA foci de moléculas da proteína MBNL1 associadas à RNAm contendo expansão CUG em indivíduos com a FECD e com a expansão CTG18.1, indicando o sequestro desta proteína regulatória. Em (3), não foi detectado a formação destas estruturas patogênicas em indivíduos que não portavam a expansão CTG18.1. A saber: Merge + DAPi: corante fluorescente. Fonte: ADAPTADO de DU et al., 2015.
A perda de atividade da proteína MBNL1, devido a seu sequestro, pode gerar eventos patogênicos como padrões anormais de splicing alternativo do gene TCF4 (de maneira similar ao que ocorre na DM1 – como proposto por DU & colaboradores76), além da possibilidade de um aumento de estresse celular no tecido corneano (induzido por estas estruturas patogênicas), fato que poderia induzir um aumento da instabilidade somática deste lócus e, consequentemente, favoreceria o aumento do número de repetições do microssatélite CTG18.1 no gene TCF4 com o passar de gerações. Interessantemente, estresse celular e apoptose são características muito bem observadas em córneas de pacientes com a FECD14,16,18,20.
O microssatélite CTG18.1 pode também ser um polimorfismo que está em associação com alguma outra variante causal, contribuindo para uma variabilidade de expressividade (fenótipo), característica marcante da FECD. Assim sendo, seria explicado o fato de 3 indivíduos na família 1 não portarem o alelo expandido, mas em contrapartida, expressarem o
fenótipo associado. Interessantemente, MOOTHA & colaboradores68 e WIEBEN & colaboradores65 também observaram associações interessantes entre a expansão, o SNP rs613872 (distante 43 kilobases da mesma e já associado com a FECD na literatura) e a Distrofia de Fuchs.
Além do mais, a expansão CTG18.1 pode ainda ser um lócus de suscetibilidade, contribuindo para um aumento do risco de desenvolvimento da FECD em indivíduos portadores da expansão. Estudos anteriores, como o de MOOTHA & colaboradores68, que demonstraram que alelos contendo essa expansão conferem um aumento do risco de desenvolvimento da FECD em mais de 30 vezes, e o de XING & colaboradores69, que descreveram um aumento do risco de desenvolvimento da doença de 66 vezes para cada cópia do alelo expandido em pacientes chineses, reforçam a hipótese de associação entre a expansão CTG18.1 no gene TCF4 e um aumento do risco de desenvolvimento da FECD.
No entanto, mais estudos são necessários para entender qual a exata contribuição deste microssatélite para a Distrofia de Fuchs. A expansão por si só não é suficiente nem necessária para o desenvolvimento da FECD.
Este foi o primeiro estudo que realizou uma análise genética sobre a Distrofia de Fuchs em famílias da população brasileira. Embora não tenha sido observado alterações importantes no gene COL8A2 dentro das 3 famílias analisadas, não é descartado a importância deste gene, devido ao fato de ser o único gene conhecido na literatura associado à forma rara (início precoce) da FECD. Interessantemente, identificou-se em uma das famílias analisadas (família 3) uma deleção intrônica, c.1172-19_1172-18delTC (rs113277027), no gene SLC4A11. Análises in silico demonstraram interferência da deleção em fatores regulatórios de splicing nos transcritos mutantes, podendo ou não contribuir para a FECD nesta família. A exata maneira de como isto pode ocorrer ainda é desconhecida e, assim, torna o gene SLC4A11 um importante alvo de estudos futuros. Identificou-se também a presença da expansão de um marcador microssatélite (CTG18.1) no gene TCF4, muito comum na FECD, em outra família analisada (família 1). Essa expansão tem atraído a atenção recentemente por sua alta frequência em indivíduos portadores da FECD. Isto faz deste microssatélite um interessante marcador a ser melhor compreendido.
Apesar dos recentes avanços na área, são necessários estudos mais específicos, como estudos pós-transcricionais por exemplo, que possibilitarão responder quais proteínas efetivamente expressas estão realmente envolvidas na fisiopatologia da FECD e de que maneira elas atuam nos tecidos saudáveis e mutantes. Adicionalmente, estes estudos poderão
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identificar novos genes ou alterações envolvidas na doença e, assim, possibilitar a melhor compreensão dos complexos aspectos genéticos intrínsecos a FECD.
6 CONCLUSÕES Portanto, conclui-se que:
1. No estudo do gene COL8A2:
Não foi detectada nenhuma variante no gene COL8A2 co-segregando com o fenótipo da doença em nenhumas das famílias estudadas. Entretanto, este fato não o torna menos importante, devido a esse gene ser o único conhecido na literatura associado à forma rara da FECD.
2. No estudo do gene SLC4A11:
1ª vez que a deleção rs113277027 é descrita na população brasileira;
A deleção rs113277027 pode ou não impactar em padrões normais de splicing do gene SLC4A11;
A deleção rs113277027 pode ser um marcador de algum outro gene, próximo ao SLC4A11, que pode também estar associado com a FECD e que ainda não foi descoberto.
3. No estudo do microssatélite CTG18.1 no gene TCF4:
A expansão pode ser uma mutação causal com uma penetrância incompleta; A expansão pode ser um lócus de suscetibilidade para a Distrofia de Fuchs;
É possível que a expansão seja um polimorfismo em associação com alguma outra variante causal, contribuindo para o fenótipo da FECD.
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