Grupo caso (Famílias)

Foram recrutados 39 indivíduos pertencentes a três famílias, com histórico da FECD confirmada por meio de microscopia especular. Na família 1, composta por quatro gerações, 18 indivíduos estavam disponíveis para o estudo, sendo 11 afetados e sete não afetados. Já na família 2, 15 indivíduos compreendendo três gerações estavam disponíveis e foram analisados, dos quais cinco eram afetados e 10 não afetados. Na família 3, composta por seis indivíduos representando duas gerações, todos os familiares, quatro indivíduos afetados e dois não afetados, foram analisados. Apenas os indivíduos com alteração bilateral foram denominados afetados. Os familiares sem nenhum sinal e sintoma da FECD, foram denominados não afetados (Figura 5).

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Figura 5. Heredograma. Representação das três famílias analisadas no estudo. Apenas os indivíduos enumerados em preto estavam disponíveis e foram analisados. Os números em vermelho correspondem à idade dos indivíduos analisados.

3.1.2.2 Critérios de Exclusão:

1. Cirurgia ocular prévia em qualquer olho

3. Afecções oculares ou sistêmicas de caráter inflamatório ou autoimune incluindo uveíte, olho seco grave, diabetes ou doenças reumatológicas

3.1.3 Grupo Controle

3.1.3.1 Critérios de Inclusão:

Para a melhor compreensão de alterações em que foi verificado segregação familiar, foram avaliados 100 indivíduos, saudáveis em termos oftalmológicos, de uma amostra da população brasileira atendidos no Ambulatório de Doenças Externas do Departamento de Oftalmologia, Hospital de Clínicas da UNICAMP, segundo os seguintes critérios:

1. Indivíduos acima de 50 anos

2. Microscopia especular sem evidência de guttata corneana

3. Pressão intraocular (PIO) com valores considerados normais em ambos os olhos

3.1.3.2 Critérios de Exclusão:

1. Histórico familiar de doença da córnea 2. Histórico familiar de cegueira

3. Afecções oculares ou sistêmicas de caráter inflamatório ou autoimune incluindo uveíte, olho seco grave, diabetes e doenças reumatológicas

3.2 Métodos

3.2.1 Exame Oftalmológico

Os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a exame oftalmológico, incluindo: 1. Biomicroscopia do segmento anterior realizada em lâmpada de fenda;

2. Medida da espessura central da córnea por meio de Paquimetria Ultrassônica; 3. Microscopia especular, permitindo a análise qualitativa e quantitativa da camada

endotelial da córnea.

Além do exame oftalmológico, foram coletados dados sobre sexo e idade de ambos os grupos.

3.2.2 Extração de DNA

Foram colhidos 10 ml de sangue periférico em frasco estéril, com EDTA 10% como anticoagulante, de todos os indivíduos submetidos ao estudo. O DNA foi extraído pelo método fenol/clorofórmio.

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3.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) – Análise dos genes COL8A2 e SLC4A11 As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram padronizadas utilizando-se os seguintes reagentes: um par de primer para cada região determinada (sense e anti-sense) a partir da sequência registrada no “Genbank” sob o número NG_017016, tampão da enzima 10X [Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, gelatina 0,01%]; MgCl2 50 mM; mistura de nucleotídios 10mM (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), Taq DNA polimerase (InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) na concentração de 5U/µl, somados a 50ng de DNA genômico e água deionizada estéril, completando o volume para 25 µl.

Posteriormente, as amostras foram amplificadas por meio de aparelho termociclador (APPLIED BIOSYSTEMS VERITI™ 96-WELL THERMAL CYCLER, Forster City, CA, EUA), segundo as condições: desnaturação inicial de 5 minutos a 95ºC; seguida por 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a XºC, onde X é a temperatura de anelamento específica para cada par de primers, e 45 segundos a 72ºC. A extensão final foi de 7 minutos a 72ºC. A tabela 3 detalha todos os primers, tanto para o gene COL8A2 quanto para o gene SLC4A11, utilizados no presente estudo. Finalmente, os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese e visualizados com auxílio da luz ultravioleta em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídeo.

Tabela 3. Sequências dos primers utilizados no rastreamento dos genes COL8A2 e SLC4A11

Gene Primer (5' – 3') Éxon

Sense (Forward) Antisense (Reverse)

COL8A2 AGGAGGTGGCTTATGCAGAC ATGACCTGAAGGTGGAGTGG 1 COL8A2 CAAACCCCATCTTCCATGAG TGGGCACCTGGTTTTCC 2 COL8A2 CCCCTCAGGCATTACTATCC TCCCACACCGTCTACTCCAG 2 COL8A2 AGCTGGCTTAGGCAAACCTG GAGCCCCAAGTCACCTTTC 2 COL8A2 TCCTGGAGTAGACGGTGTGG GCCTGGTTCCCCCTTCAG 2 COL8A2 GGGGCAGAAAGGTGACTTG TGTGGCCATTGTAGAGAGTCC 2 COL8A2 CTCTCTACAATGGCCACAGC GTTATGTGGGGCAGAGCAAG 2 SLC4A11 CCCAATTGTTCTCCCTTTTG TCTAGCTTCCCGAAGAGTGG 1-2 SLC4A11 AGCTGCCTTCCTCGCCTATG TCCCTGTTGAGCTGCTCCTG 3-4 SLC4A11 TCCAGGAGCAGCTCAACAG AGTGCTCCAGCCCTCTTCTC 5-6 SLC4A11 CGTCCCATTTGCTCTTCTTT GTTTCTGACACACCCACAGG 7 SLC4A11 ATGGGGAGAGCACCTTCAC GAAGTCCAAGGGGTACAAGG 8 SLC4A11 CTTGGTGCATCAGAGACAGC GATGGGAGAGAGGGTTTGC 8-9 SLC4A11 GAAGGAACGCAGCACAGTCTC GCTATGGTCTTCTGCACGTCTG 9-10-11 SLC4A11 CCATTGGTGATTCTGCTGAC TCATCAGAGTGGGTGTGGTC 11-12 SLC4A11 CTCAAGGCTTGGGATCTGG CTTGAGCCAGTCCTATGTGC 13

SLC4A11 CAGAGATGGGACAGGGACAG CAGTCGGACAGGATCTCTCG 14 SLC4A11 CTCAGCCTCCTCATCATGC ATCGCAAAGGGGCTCTC 15 SLC4A11 CGGGAAATCGAGAGTGAGTT CGTCTCCTTCACGTTCACAA 16-17 SLC4A11 CTTAGTGGAGGAGCGTGTGG ACCCTCCGGATGTAGTGTG 18 SLC4A11 CTGGCCACATGGGACATAG CTAGGCAGGACCCCTCCTC 18-19 SLC4A11 CCACTGCCTTCTCTCTGACC AAATCCATCCTGCTCAGTCC 20

3.2.4 Sequenciamento de DNA

Os produtos da PCR foram purificados com 1 µl das enzimas exonuclease I e fosfatase alcalina “ExoSAP-IT” (Amersham Life Sciences, Uppsala, Sweden) e incubados a 37ºC por 15 minutos seguido de 80ºC por 15 minutos. Para a reação de sequenciamento foi utilizado 1 µl do produto purificado para um volume final de reação de 10 µL, contendo 1 µL de “Big Dye Terminator Ready Reaction v3.0” (ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems Foster City, CA, USA), 4 µL do tampão de sequenciamento 5X (Applied Biosystems Foster City, CA, USA) e 5 pmol de um dos primers (“sense” ou “antisense”) utilizados na PCR, sendo o volume final completado com água deionizada estéril. As condições das reações de sequenciamento foram: 25 ciclos a 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 5 segundos e 60ºC por 4 minutos. Após esta reação, as amostras foram novamente purificadas para eliminação dos nucleotídeos não incorporados, eluídas em 10 µL de Formamida Hi-DiTM (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA), colocadas em gelo e submetidas à eletroforese no sequenciador automático de DNA “ABI PRISM 3500” (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA).

As sequências genômicas foram analisadas com o auxílio dos softwares gratuitos CodonCode Aligner v6.0.2 e CLC Sequence Viewer 6.8.1 e submetidas a buscas por similaridade, utilizando-se o “algoritmo de buscas” BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

3.2.5 Ensaio de STR – Short Tandem Repeat (STR) Assay

A análise do microssatélite TGC no gene TCF4 foi realizada através de PCR em duplicata para cada amostra, utilizando-se um primer sense, marcado com 6- carboxyfluorescein na extremidade 5’ (FAM-5’ CAGATGAGTTTGGTGTAAGATG 3’) e um primer anti-sense não marcado (5’ ACAAGCAGAAAGGGGGCTGCAA 3’), tampão da enzima 10X [Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, gelatina 0,01%]; MgCl2 50 mM; mistura de nucleotídios 10mM (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), Platinum Taq DNA Polimerase

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(InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) na concentração de 5U/µl, somados a 4 µl de DNA genômico a 50ng/µl e água deionizada estéril, completando o volume para 15 µl. As condições de ciclagem foram: Desnaturação inicial por 5 minutos a 94ºC, seguida por 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 61ºC, e 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi de 5 minutos a 72ºC. Aos produtos de uma das PCRs foram adicionados Formamida Hi-DiTM (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA) e o padrão interno de peso molecular GeneScan™ 600 LIZ® (Foster City, CA, USA), e levados ao sequenciador automático “ABI PRISM 3500” (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA). Os perfis eletroforéticos foram analisados utilizando o software GeneiousTM (Biomatters Limited). Foi considerado como alelo expandido repetições iguais ou maiores do que 40 TGCs64,68,69, um valor de corte ligeiramente maior do que as 37 repetições relatadas por BRESCHEL et al.66 como limiar da estabilidade alélica neste lócus.

Para validação do ensaio STR, realizou-se a separação dos produtos da duplicata das PCRs em gel de agarose 3%. Cortou-se o gel no local exato das bandas com o auxílio de luz ultravioleta e realizou-se a purificação com o Kit WIZARD® _{SV GEL AND PCR CLEAN-UP}

SYSTEM (Promega, Madison, WI, USA). Em seguida, estes produtos foram analisados por Sequenciamento de Sanger no sequenciador automático “ABI PRISM 3500” (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA) e os resultados foram comparados com os fragmentos analisados pelo software GeneiousTM (Biomatters Limited).

3.2.6 Análises in silico

Foram realizadas análises in silico por meio de três programas que avaliam alterações em sítios de splicing, SpliceAid2 (http://193.206.120.249/splicing_tissue.html), Exonic splicing regulatory elements ou ESRs (http://ibis.tau.ac.il/ssat/ESR.htm) e Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org). Os dois primeiros analisam possíveis efeitos de mutações em nível de RNA, avaliando se sítios de proteínas regulatórias que determinam padrões de splicing do pré-RNAm atuantes na região da alteração são afetados. Já o terceiro software, não só estima o impacto da variante analisada no(a) gene/proteína, como também avalia o potencial efeito da alteração em causar doenças, classificando-a.

Foram realizados os testes exato de Fisher para variáveis categóricas (gênero) e o teste t de Student para variáveis contínuas (idade) com o intuito de avaliar a diferença da média entre os dois grupos. Considerou-se estatisticamente significativo valor de p < 0,05.