Rastreamento dos genes COL8A2 e SLC4A11

Foram identificadas no estudo 23 alterações previamente descritas, como mostra a tabela 4. Entretanto, essas variantes estavam presentes em ambos os grupos, afetados e não afetados, não tendo sido verificados, então, quaisquer padrões de segregação nas famílias analisadas.

Tabela 4. Variantes previamente descritas identificadas, segundo o banco de dados Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html). GENE COL8A2 SLC4A11 rs142307403 rs3810562 rs41281862 rs58757394 rs274754 rs3827075 rs41281858 rs34460295 rs274753 rs41281860 rs2281575 rs3803956 rs66899567 rs79346175 rs3803957 rs3827076 rs35495320 rs6139040 rs10048856 rs3810561 rs57985157 rs3803953 rs3803955

Além das variantes descritas acima, identificou-se a presença de uma deleção intrônica, c.1172-19_1172-18delTC (rs113277027), no gene SLC4A11, segundo o banco de dados Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) e Exome Aggregation Consortium

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(ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), co-segregando com o fenótipo da doença na família 3, como mostra a figura 6.

Para melhor compreender a alteração, foram incluídos e analisados por sequenciamento de Sanger 100 indivíduos controle, pertencentes a população brasileira, não aparentados e considerados saudáveis em termos oftalmológicos. No entanto, a deleção não foi observada na amostra controle analisada. Adicionalmente, foram realizadas análises in silico na tentativa de melhor entender o possível efeito desta deleção nos transcritos mutante.

Figura 6: Segregação da deleção intrônica rs113277027 (c.1172-19_1172-18delTC) no gene SLC4A11 na família 3. (A): Eletroferograma do sequenciamento de Sanger de um indivíduo não afetado, sem a deleção. (B): Eletroferograma do sequenciamento de Sanger de um indivíduo com a FECD. Note a presença da

deleção em heterozigose (área sublinhada em preto). Os números em azul presentes no heredograma correspondem à idade dos indivíduos.

4.1.2 Análises in silico para o gene SLC4A11

O primeiro software utilizado para uma melhor compreensão do possível efeito da deleção detectada no gene SLC4A11 na família 3 foi o SpliceAid2. Esta ferramenta prevê possíveis efeitos de mutações em nível de RNA, avaliando proteínas regulatórias ligantes de RNA, presentes na região da alteração analisada, que atuam na regulação de splicing do pré- RNAm. Este programa disponibiliza a análise tecido-específica das proteínas regulatórias coletadas a partir dos bancos de dados Human Protein Atlas, Human Protein Reference Database ou HPRD, Human Proteinpedia, Transcriptome Map e Cancer Genome Anatomy Project ou CGAP. Deste modo, realizou-se a análise restrita de fatores regulatórios de splicing atuantes no tecido da córnea.

Esta análise (Figura 7) revelou que a deleção suprime um sítio de ligação de uma ribonucleoproteína heterogênea (hnRNP) conhecida como proteína ligante do trato polipirimidínico – PTB ou PTBP1, do inglês Polypyrimidine tract binding protein.

As ribonucleoproteínas heterogêneas são um grupo de proteínas regulatórias muito importantes para a maturação do pré-RNAm, participando da regulação do splicing e montagem do spliceossomo82, sendo a PTB uma proteína conhecida por sua atividade repressora no processo de splicing, além de participar da clivagem do sítio poly(A) do pré- RNAm83. Já o trato polipirimidínico, é uma região intrônica, rica em pirimidinas, importante para a montagem do spliceossomo e, consequentemente, para o processo de splicing72.

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Figura 7. Histograma gerado pelo software SpliceAid2

(http://193.206.120.249/splicing_tissue.html). As barras positivas, acima da linha correspondente ao pré-RNAm, representam proteínas regulatórias que se ligam a sequências facilitadoras da definição de éxons, isto é, exonic splicing enhancers (ESEs) e intronic splicing silencers (ISSs). Já as barras negativas, abaixo da linha correspondente ao pré-RNAm, representam proteínas regulatórias que se ligam a sequências que facilitam a definição de íntron, ou seja, intronic splicing enhancers (ISEs) e exonic splicing silencers (ESSs). As barras também possuem largura e altura variáveis, que estão relacionadas ao tamanho das sequências alvo e ao grau de afinidade de ligação, respectivamente. (A) NORMAL: No transcrito normal, sem a deleção, a Ribonucleoproteína heterogênea (hnRNP) PTB ou Proteína ligante do trato Polipirimidínico reconhece e se liga a seu sítio de ligação no pré-RNAm. (B)

MUTANTE: Já no transcrito mutante, a deleção suprime este sítio de ligação da Ribonucleoproteína heterogênea PTB.

A segunda análise, realizada pelo software exonic splicing regulatory elements – ESRs e ilustrada na figura 8, demonstrou um resultado idêntico à análise obtida pelo software SpliceAid2, indicando também que a deleção suprime um sítio de ligação da mesma Ribonucleoproteína heterogênea PTB ou proteína ligante do trato Polipirimidínico.

Figura 8. Histograma gerado na predição in silico pelo software ESRs - exonic splicing regulatory elements (http://ibis.tau.ac.il/ssat/ESR.htm). A saber, local da deleção: realçado em azul em (A). Sequências TGCATC, CTCTCT e GGGA em laranja: sítios de ligação alvos das proteínas regulatórias SRp55, hnRNP-I (PTB) ou PTB e hnRNP-F, respectivamente. (A) Normal: No transcrito normal, sem a deleção, a Ribonucleoproteína heterogênea PTB se liga a seu sítio alvo no pré-RNAm. (B) Mutante: Com a deleção, note que a Ribonucleoproteína heterogênea PTB não se liga mais a seu sítio alvo (resultado similar ao encontrado pela análise anterior com o software SpliceAid2).

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Realizamos ainda uma terceira análise, agora com o software Mutation Taster (Figura 9). Este software revelou que a deleção pode causar mudanças em sítios de splicing e afetar características da proteína sintetizada, resultado similar às duas análises anteriores. Entretanto, o software classificou a deleção como um polimorfismo “provavelmente inofensivo” em causar doenças.

Figura 9. Predição in silico pelo software Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org). Com a presença da deleção, circulada em vermelho, o programa revela uma possibilidade de alteração nas características da proteína traduzida e em sítios de splicing, porém classifica a alteração como um polimorfismo “provavelmente inofensivo”. A saber: “prob” significa a probabilidade de a predição estar correta. Valores próximos a 1 indicam uma alta segurança de predição.