FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
CAIQUE MARTINS
Análise dos genes COL8A2 e SLC4A11 e da expansão intrônica
TGC no gene TCF4 em famílias portadoras da Distrofia
Endotelial Corneana de Fuchs
CAMPINAS 2016
CAIQUE MARTINS
Análise dos genes COL8A2 e SLC4A11 e da expansão intrônica
TGC no gene TCF4 em famílias portadoras da Distrofia Endotelial
Corneana de Fuchs
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências, área de concentração Clínica Médica.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Mônica Barbosa de Melo
CAMPINAS
2016
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO CAIQUE MARTINS, E ORIENTADO PELA PROFª. DRª. MÔNICA BARBOSA DE MELO
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
CAIQUE MARTINSORIENTADOR(A): PROF(A). DR(A). MÔNICA BARBOSA DE MELO
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A). MÔNICA BARBOSA DE MELO
2. PROF(A). DR(A). MANOELA MARQUES ORTEGA
3. PROF(A). DR(A). MÔNICA DE CASSIA ALVES DE PAULA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmico do aluno.
A minha mãe, por todo seu amor incondicional e por ter me dado a chance da vida, e a meu pai, por ser meu exemplo de vida e por ter me dado todas as condições para que eu chegasse aonde cheguei. Tudo que sou hoje, devo a eles.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, por ter me abençoado com muita saúde e conhecimento para que eu pudesse alcançar mais este objetivo em minha vida.
A Profa. Dra. Mônica Barbosa de Melo, pela oportunidade que permitiu meu desenvolvimento profissional, pela ajuda e orientação durante esses anos.
Ao Prof. Dr. José Paulo Cabral de Vasconcellos, pela ajuda nos assuntos clínicos. A Dra. Mariana Borges Oliveira, por toda colaboração na coleta de dados e pacientes. A Dra. Sueli Matilde da Silva Costa, por toda ajuda e dedicação dispendida ao estudo. A toda a equipe do laboratório, pelas dicas, ajudas e convivência agradável.
Introdução: A Distrofia Endotelial Corneana de Fuchs (FECD, do inglês Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy) é uma doença hereditária do endotélio corneano caracterizada por uma perda progressiva e lenta de células endoteliais da córnea, espessamento da membrana de Descemet e deposição extracelular de matriz (guttata). Com a progressão e consequente perda de células endoteliais, a remoção de fluidos é afetada, levando ao edema estromal, sendo o transplante de córnea o único tratamento definitivo. Diversos genes são associados à distrofia de Fuchs, entre eles, o COL8A2, o SLC4A11 e o TCF4. O gene COL8A2, codifica a cadeia alfa-2 do colágeno VIII, maior componente da membrana de Descemet e que está envolvido na diferenciação terminal do endotélio vascular. O SLC4A11 codifica uma proteína de membrana que desempenha uma importante função eletrogênica nas células endoteliais da córnea, atuando na regulação da homeostase deste tecido. Já o gene TFC4, codifica uma proteína conhecida ser fator de transcrição expresso no desenvolvimento endotelial da córnea. Além de ter múltiplos processamentos, este gene regula a expressão de outros fatores de transcrição também envolvidos na FECD, tornando evidente sua forte associação com a doença e fazendo do mesmo um provável gene candidato. Objetivos: Este estudo tem como
principal objetivo avaliar o padrão de segregação de possíveis mutações nos genes COL8A2 e SLCA11 em três famílias portadoras da FECD e também analisar a associação entre a repetição do trinucleotídeo intrônico TGC no gene TCF4 e a FECD nos indivíduos destas famílias, avaliando seu padrão de segregação. Métodos: Foram avaliados 39 indivíduos pertencentes a três famílias com histórico da FECD e, 100 indivíduos controle. Os genes COL8A2 e SLC4A11 foram avaliados através de sequenciamento de Sanger e análises de predição in silico. O microssatélite TGC no gene TCF4 foi analisado através do ensaio de STR. Resultados: A deleção rs113277027 no gene SLC4A11 foi detectada co-segregando com o fenótipo da doença na família 3. Essa deleção estava ausente na amostra controle analisada. Análises de predição in silico demonstraram que essa deleção pode induzir mudanças no transcrito mutante. Verificou-se também que, o microssatélite TGC no gene TCF4 foi encontrado apenas na família 1 (penetrância incompleta). Conclusões: Os resultados sugerem que a deleção c.1172-19_1172-18delTC (rs113277027) pode, ou não, impactar em fatores regulatórios de splicing do gene SLC4A11. É possível ainda que essa deleção seja um marcador de algum outro gene próximo, contribuindo para o fenótipo na família 3. Verificou-se também que, apesar da expansão do microssatélite TGC no gene TCF4 ter sido encontrada
em apenas uma família, sua forte relação com a FECD vem ganhando destaque na literatura. Entretanto, há necessidade de mais estudos para entender sua exata contribuição para a doença.
Introduction: Fuchs’ endothelial corneal dystrophy is a hereditary disease of the corneal
endothelium, which is characterized by the progressive and slow loss of corneal endothelial cells, thickening of Descemet’s membrane and extracellular matrix deposition (guttae). Due to the progression and consequent loss of endothelial cells, the removal of fluids is affected, leading to stromal edema. Corneal transplantation is the only definitive treatment for FECD. Several genes are associated with FECD, including COL8A2, SLC4A11 and TCF4. The COL8A2 gene, encodes the collagen VIII alpha-2 chain, the major component of Descemet's membrane, involved in the terminal differentiation of the vascular endothelium. The SLC4A11 gene encodes a membrane protein that plays an eletrogenic role in the corneal endothelial cell surface, regulating the corneal homeostasis. The last one but not less important, the TCF4 gene, encodes a protein that is a transcription factor expressed during the corneal endothelial development. The TCF4 transcript undergoes multiple alternative splicing and regulates other transcription factors involved in FECD, which makes the TCF4 gene a possible candidate gene. Purpose: The main aims of this study are to evaluate the segregation pattern of the possible mutations in the COL8A2 and SLC4A11 genes, and analyze the familial association between the TGC trinucleotide repeat expansions in the TCF4 gene and the disease in three families with FECD. Methods: We analyzed 39 individuals belonging to 3 families with FECD and 100 control subjects. We analyzed the COL8A2 and SLC4A11 genes through Sanger sequencing and by prediction programs in silico. The TGC microsatellite in the TCF4 gene was genotyped using the Short Tandem Repeat-Assay (STR-Assay). Results: We found the deletion rs113277027 in the SLC4A11 gene co-segregating with the trait in family 3, which was absent in our control subjects. In silico predictions allowed us to show that this mutation may induce changes in the mutant transcript. Additionally, STR analysis found the expanded alleles only in family 1 (incomplete penetrance) Conclusions: These findings suggest that this deletion may affect regulatory splicing factors. It is also possible that this deletion is a marker of some nearby gene, contributing to the phenotype in family 3. Despite the fact that the expansion is present in only one family, we showed a strong relationship between the TGC expansions with FECD. However, further studies are necessary to understand the exact contribution to the disorder.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Localização da córnea no globo ocular humano. Fonte: FRANCO, 2005. ...21
Figura 2. Camadas da córnea humana. (A) Corte histológico transversal da córnea humana, mostrando as camadas que a compõe: a - epitélio, b - membrana de Bowman, c - estroma, d- membrana de Descemet e e - endotélio. Fonte: FRANCO, 2005. (B) Representação longitudinal das camadas presentes na córnea humana. Fonte: ADAPTADO de
http://cornealdystrophyfundation.org. ...22
Figura 3. Microscopia especular da córnea. Exame de microscopia especular de um indivíduo não afetado, revelando uma camada íntegra de células endoteliais (à esquerda), e de um indivíduo afetado pela FECD (à direita), revelando a presença de córnea guttata (manchas escuras), característica típica da Distrofia de Fuchs. ...24
Figura 4. Microscopia Especular da córnea. Progressão da córnea guttata na Distrofia de Fuchs. Fonte: ZOEGA et al., 2006. ...25
Figura 5: Heredograma. Representação das três famílias analisadas no estudo. Apenas os indivíduos enumerados em preto estavam disponíveis e foram analisados. Os números em vermelho correspondem à idade dos indivíduos. ...32
Figura 6. Segregação da deleção intrônica rs113277027 (c.1172-19_1172-18delTC) no gene SLC4A11 na família 3. (A): Eletroferograma do sequenciamento de Sanger de um indivíduo não afetado, sem a deleção. (B): Eletroferograma do sequenciamento de Sanger de um indivíduo com a FECD. Note a presença da deleção em heterozigose (área sublinhada em preto). Os números em azul presentes no heredograma correspondem à idade dos indivíduos. ...38
Figura 7. Histograma gerado pelo software SpliceAid2
splicing silencers (ISSs). Já as barras negativas, abaixo da linha correspondente ao pré-RNAm, representam proteínas regulatórias que se ligam a sequências que facilitam a definição de íntron, ou seja, intronic splicing enhancers (ISEs) e exonic splicing silencers (ESSs). As barras também possuem largura e altura variáveis, que estão relacionadas ao tamanho das sequências alvo e ao grau de afinidade de ligação, respectivamente. (A) NORMAL: No transcrito normal, sem a deleção, a Ribonucleoproteína heterogênea (hnRNP) PTB ou Proteína ligante do trato Polipirimidínico reconhece e se liga a seu sítio de ligação no pré-RNAm. (B) MUTANTE: Já no transcrito mutante, a deleção suprime este sítio de ligação da Ribonucleoproteína heterogênea PTB. ...40
Figura 8. Histograma gerado na predição in silico pelo software ESRs - exonic splicing regulatory elements (http://ibis.tau.ac.il/ssat/ESR.htm). A saber, local da deleção: realçado em azul em (A). Sequências TGCATC, CTCTCT e GGGA em laranja: sítios de ligação alvos das proteínas regulatórias SRp55, hnRNP-I (PTB) ou PTB e hnRNP-F, respectivamente. (A) Normal: No transcrito normal, sem a deleção, a Ribonucleoproteína heterogênea PTB se liga a seu sítio alvo no pré-RNAm. (B) Mutante: Com a deleção, note que a Ribonucleoproteína heterogênea PTB não se liga mais a seu sítio alvo (resultado similar ao encontrado pela análise anterior com o software SpliceAid2). ...41
Figura 9. Predição in silico pelo software Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org). Com a presença da deleção, circulada em vermelho, o programa revela uma possibilidade de alteração nas características da proteína traduzida e em sítios de splicing, porém classifica a alteração como um polimorfismo “provavelmente inofensivo”. A saber: “prob” significa a probabilidade de a predição estar correta. Valores próximos a 1 indicam uma alta segurança de predição. ...42
Figura 10. Análise representativa da técnica de STR para o microssatélite CTG18.1. Representação de um indivíduo afetado (A), indicando a presença de um alelo expandido (contendo 62 repetições) e (B) de um indivíduo não afetado... 43
Figura 11. Presença do microssatélite CTG18.1 nas famílias estudadas. Note que a expansão foi detectada apenas na família 1. ...44
Figura 12. Elementos e fatores indispensáveis para a regulação do processo de splicing do pré-RNAm. (A) Montagem do spliceossomo: Se inicia com a ligação da snRNP U1 ao sítio 5’ e dos fatores de splicing U2AF65 e U2AF35 ao trato Polipirimidínico e sítio 3’, respectivamente, formando o complexo E. Em seguida, a snRNP U2 se liga ao ponto de ramificação, formando o complexo A. Então, U4, U6 e U5 são recrutadas formando o complexo B. Em um último processo catalítico, rearranjos entre os componentes e interações com o pré-RNAm formam o complexo C. Fonte: ADAPTADO de SOLIS et al., 2008. (B): Elementos Cis e fatores Trans indispensáveis para a regulação do splicing: Sítio de splicing 5’S (GU) e 3’S (AG), Ponto de ramificação (representado por um nucleotídeo adenina), o trato Polipirimidínico – (Py)n (região rica em pirimidinas), sequências relacionadas à repressão (ISS e ESS) e ativação (ISE e ESE) de splicing. Ribonucleoproteínas heterogêneas (hnRNPs) e proteínas ricas em serina (SR proteins) também participam deste processo. Fonte: ADAPTADO de YEAP, NAMASIVAYAM, HO, 2014. ...46
Figura 13. Frequência da deleção rs113277027 em diferentes populações, segundo os bancos de dados Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) (A) e Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org) (B). Note a grande diferença de frequência da deleção nas diferentes populações. ...49
Figura 14. Mecanismo de formação de RNA foci. Sequestro de proteínas regulatórias ligantes de RNAm que interagem com regiões de repetição expandidas do pré-RNAm e induzem a formação de estruturas patogênicas conhecidas como RNA foci. Fonte: ADAPTADO de WALSH et al., 2015. ...50
Figura 15. RNA FISH (Técnica que permite a detecção e localização de moléculas de RNA alvos). Em (1) e (2) a co-localização em RNA foci de moléculas da proteína MBNL1 associadas à RNAm contendo expansão CUG em indivíduos com a FECD e com a expansão CTG18.1, indicando o sequestro desta proteína regulatória. Em (3), não foi detectado a formação destas estruturas patogênicas em indivíduos que não portavam a expansão
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Escala proposta por Krachmer e colaboradores para descrever e classificar a severidade da FECD. ...26
Tabela 2. Genes implicados na patogênese da Distrofia de Fuchs. ...27
Tabela 3. Sequência dos primers utilizados no rastreamento dos genes COL8A2 e SLC4A11. ...34
Tabela 4. Variantes previamente descritas identificadas, segundo o banco de dados Ensembl. ...37
A - Adenina
AGBL1 - ATP/GTP-Binding Protein-Like 1
BP - Branch Point ou Ponto de Ramificação
C - Citosina
CGAP - Cancer Genome Anatomy Project
COL8A1 - Collagen, Type VIII, Alpha 1
COL8A2 - Collagen, Type VIII, Alpha 2
dATP - Deoxyadenosine triphosphate
dCTP - Deoxycytidine triphosphate
dGTP - Deoxyguanosine triphosphate
DM1 - Distofia Miotônica 1
DMPK - Dystrophia Myotonica Protein Kinase
DNA - Deoxyribonucleic Acid ou Ácido Desoxirribonucleico
dTTP - Deoxythymidine triphosphate
EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid
ESE - Exonic Splicing Enhancer
ESRs - Exonic Splicing Regulation Elements
ESS - Exonic Splicing Silencer
EXAC - Exome Aggregation Consortium
FECD - Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy
FISH - Fluorescence In Situ Hibridization ou Hibridização In Situ por Fluorescência
G - Guanina
HCl - Ácido Clorídrico
hnRNP - Heterogeneous Nuclear Ribonucleoproteins ou Ribonucleoproteína Heterogênea
Nuclear
HPRD - Human Protein Reference Database
ISE - Intronic Splicing Enhancer
ISS - Intronic Splicing Silencer
K+ - Potássio
KCl - Cloreto de Potássio
MBNL1 - Muscleblind-like protein 1
MgCl - Cloreto de Magnésio
Na+ - Sódio
ng - Nanograma
OH- - Hidroxila
OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man
PCR - Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase
PIO - Pressão Intraocular
POLYPHEN - Polymorphism Phenotyping
PPT - Polypyrimidine tract ou Trato Polipirimidínico
PTBP1 - Polypyrimidine tract-binding protein 1 ou Proteína Ligante do Trato
Polipirimidínico
RNA - Ribonucleic Acid ou Ácido Ribonucleico
RNAm - Messenger Ribonucleic Acid ou Ácido Ribonucleico Mensageiro
ROS - Reactive Oxygen Species ou Espécies Reativas de Oxigênio
SIFT - Sorting Intolerant From Tolerant
SLC4A11 - Solute Carrier Family 4, Sodium Borate Transporter, Member 11
snRNP - Small Nuclear Ribonucleoprotein ou Pequena Ribonucleoproteína Nuclear
SR PROTEIN - Serine Protein ou Proteína rica em Serina STR - Short Tandem Repeat
T - Timina
TCF4 - Transcription Factor 4
U - Uracila
uL - Microlitro
ABSTRACT ...ix
LISTA DE FIGURAS ...xi
LISTA DE TABELAS ...xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xv
1. INTRODUÇÃO ... 19
1.1 Aspectos Gerais da FECD ... 19
1.2 Aspectos Epidemiológicos ... 20 1.3 Aspectos Histológicos ... 20 1.3.1 Epitélio ... 22 1.3.2 Membrana de Bowman ... 23 1.3.3 Estroma ... 23 1.3.4 Membrana de Descemet ... 23 1.3.5 Endotélio ... 24 1.4 Aspectos Clínicos ... 25
1.5 Aspectos Genéticos da FECD ... 27
2. OBJETIVO ... 30
2.1 Objetivo Geral ... 30
2.2 Objetivos Específicos ... 30
3. CASUÍSTICA E METODOLOGIA ... 30
3.1 Casuística ... 30
3.1.2 Grupo caso (Famílias). ... 31
3.1.2.1 Critérios de inclusão ... 31 3.1.2.2 Critérios de exclusão ... 32 3.1.3 Grupo controle ... 33 3.1.3.1 Critérios de inclusão ... 33 3.1.3.2 Critérios de exclusão ... 33 3.2 Metodologia ... 33 3.2.1 Exame Oftalmológico ... 33 3.2.2 Extração de DNA ... 33
3.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) – Análise dos genes COL8A2 e SLC4A11. ... 34
3.2.4 Reação de sequenciamento ... 35
3.2.5 Ensaio de STR - Short Tandem Repeat (STR) Assay ... 35
3.2.6 Análise in silico ... 36
3.2.7 Análise estatística ... 36
4. RESULTADOS ... 37
4.1 Rastreamento dos genes COL8A2 e SLC4A11 ... 37
4.1.2 Análises in silico ... 39
4.2 Ensaio de STR e análise do trinucleotídeo TGC no gene TCF4 ... 42
5. DISCUSSÃO ... 44 6. CONCLUSÕES ... 54 7. REFERÊNCIAS ... 54 8. ANEXOS ... 65 8.1 Anexo 1 ... 65 8.2 Anexo 2 ... 68 8.3 Anexo 3 ... 71 8.4 Anexo 4 ... 72
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Gerais da FECD
A Distrofia endotelial corneana de Fuchs (FECD, do inglês Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy), primeiramente descrita pelo oftalmologista australiano Ernst Fuchs em 1910, é uma doença hereditária comum do endotélio corneano, bilateral, de herança autossômica dominante na maioria dos casos, e é mais frequente entre o sexo feminino na proporção de 2,5-3:1, o que também sugere uma herança multifatorial1-4. Em 2008, a FECD foi a quarta maior indicação de transplante de córnea nos Estados Unidos, de acordo com a Associação do Banco de Olhos da América5.
A FECD é uma degeneração progressiva do endotélio corneano classificada em dois tipos, definidos pela idade de início6. A de início precoce, um subtipo raro da doença, começa já na primeira década de vida e progride na segunda e terceira décadas, e a de início tardio, forma clássica da doença, torna-se sintomática durante a quinta década de vida3,4,7,8. Dentre as características histológicas observadas, estão o espessamento da membrana de Descemet (membrana rica em colágeno secretada pelo endotélio corneano) e o desenvolvimento de excrescências endoteliais denominadas guttata. Ambas as características resultam da deposição anormal e excessiva de fibras colágenas do tipo VIII. O colágeno do tipo VIII é composto por duas cadeias polipeptídicas distintas, a alpha-1 (VIII) (COL8A1; OMIM #120251) e a alpha-2 (VIII) (COL8A2; OMIM #120252), é secretado pelo endotélio da córnea e forma uma estrutura extracelular subjacente ao endotélio corneano. Esse acúmulo de guttata é acompanhado por alterações morfológicas no padrão hexagonal e perda das células endoteliais da córnea, devido a sua falta de habilidade em se dividir. Consequentemente, ocorre o prejuízo da habilidade do endotélio em remover o excesso de fluido para fora do estroma da córnea, resultando em edema estromal e opacidade da córnea (perda da transparência normal), comprometendo a acuidade visual, sendo o transplante de córnea o único tratamento definitivo para a FECD9,10. Em casos mais graves, pode haver o rompimento de bolhas dolorosas na camada epitelial da córnea, resultante da descompensação (incapacidade funcional de restabelecer o equilíbrio) da função de bomba que o endotélio exerce, denominada ceratopatia bolhosa6,11.
A perda da densidade celular endotelial da córnea é uma característica marcante na distrofia de Fuchs e que também está associada ao aumento do processo de apoptose. Estudos recentes vêm sugerindo que o estresse oxidativo e a apoptose desempenham um papel fundamental, senão o principal, na fisiopatologia de FECD. As células endoteliais da córnea
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estão sujeitas ao estresse oxidativo devido à continua exposição à luz durante as atividades diárias e a sua alta taxa metabólica associada à manutenção da transparência da córnea. Estudos anteriores com córneas inteiras revelaram uma taxa significativa de apoptose não só no endotélio, mas também no epitélio e estroma de pacientes com Fuchs quando comparados com controles saúdaveis12, 13,14. Análises proteômicas reforçam esses achados, mostrando uma diminuição da expressão de moléculas antioxidantes no endotélio corneano de pacientes com Fuchs, principalmente de peroxirredoxinas. Estas moléculas têm função protetora, atuando na eliminação de espécies reativas de oxigênio (ROS, do inglês Reactive Oxygen Species), que são formadas como um produto natural do metabolismo do oxigênio e tem um importante papel na sinalização celular. Em condições de estresse, ocorre um grande aumento de ROS, conhecido como estresse oxidativo, causando danos a estruturas celulares, principalmente ao DNA14,15,16,18,19,20.
Diversos genes estão associados à FECD, entre eles, o COL8A2, SLC4A11 e o TCF4, os quais têm se mostrado fortes candidatos à patogênese da doença7,17, porém, o exato mecanismo fisiopatológico e os fatores envolvidos ainda não são completamente compreendidos, necessitando mais avanços para melhores compreensões.
1.2 Aspectos Epidemiológicos
Por se tratar de uma doença de início tardio na maioria dos casos, poucos estudos examinaram a prevalência da FECD em grande escala. Estima-se que a ocorrência da Distrofia corneana de Fuchs nos Estados Unidos seja de aproximadamente 5% na população acima dos 40 anos de idade e mais frequentemente encontrada em mulheres, que compõem aproximadamente 75% dos casos. Alguns estudos sugerem uma prevalência maior em países europeus em relação a outras regiões do mundo, variando entre 4,5 e 9,0%. Já em países asiáticos, a prevalência é estimada em 3,8 a 8,5%21- 27. No Brasil, não se tem dados da prevalência da Distrofia de Fuchs.
1.3 Aspectos Histológicos
A córnea é um tecido avascular e transparente da superfície do olho, com uma espessura central de aproximadamente 550 µm, que está diretamente exposta ao meio externo (Figura 1). É um dos tecidos mais sensíveis do corpo humano, densamente inervada por fibras sensoriais, e sua superfície anterior está em contato direto com as pálpebras, enquanto que sua porção posterior está em contato com o humor aquoso28,29.
Figura 1. Localização da córnea no globo ocular humano. Fonte: FRANCO, 2005.
Como parte da camada externa do olho, ela tem função de barreira, conferindo resistência mecânica a fluidos e blindando o olho contra agentes patógenos microscópicos. Porém, ela ainda desempenha mais duas importantes funções: é o maior elemento refrativo do olho e sua hidratação regulada e a arquitetura precisa contribuem para sua transparência única, essencial para a transmissão da luz visível para a retina, permitindo assim uma visão perfeita28,29.
Do ponto de vista histológico, a córnea é composta por cinco camadas, da mais externa à mais interna, que são: epitélio, membrana de Bowman, estroma, membrana de Descemet e endotélio, como mostram as figuras 2a e 2b.
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Figura 2. Camadas da córnea humana. (A) Corte histológico transversal da córnea humana, mostrando as camadas que a compõem: a - epitélio, b - membrana de Bowman, c - estroma, d- membrana de Descemet e e - endotélio. Fonte: FRANCO, 2005. (B) Representação longitudinal das camadas presentes na córnea humana. Fonte: ADAPTADO de http://cornealdystrophyfundation.org.
1.3.1 Epitélio
O epitélio da córnea é composto por quatro a seis camadas não queratinizadas. Em humanos, mede aproximadamente 50 µm de espessura. As camadas epiteliais da superfície da córnea têm como principal função proteger as demais contra a entrada de patógenos. Essa função é realizada por meio de junções apertadas (tight junctions) que auxiliam na formação de uma superfície de barreira, fato que permite também a manutenção de um estrado de desidratação da córnea e auxilia em sua transparência única. O epitélio absorve também oxigênio e nutrientes celulares da lágrima (produzida pelas glândulas lacrimais nas pálpebras)
para as outras camadas da córnea 29,30,31,32. As células epiteliais basais se aderem à membrana basal (membrana de Bowman) e se interligam com o estroma corneano através de estruturas complexas conhecidas como hemidesmossomos e filamentos de ancoragem30.
1.3.2 Membrana de Bowman
A membrana de Bowman é uma camada acelular, que diminui em espessura com o passar dos anos, pois não tem a habilidade de se regenerar quando lesada. É composta por um arranjo aleatório de fibras colágenas e proteoglicanos. Seu papel fisiológico ainda permanece incerto. Sabe-se apenas que esta dá suporte ao epitélio corneano30,31.
1.3.3 Estroma
O estroma representa a maior camada da córnea, medindo aproximadamente 500 µm e é um dos tecidos mais inervados do corpo humano. Está organizado como uma rede de fibras colágenas do tipo I e V, com uma matriz extracelular composta por água, células estromais ou queratócitos, sais inorgânicos, proteoglicanos e glicoproteínas29,30,31,33. Seu arranjo regular único de fibras colágenas e queratócitos é um fator chave na transparência da córnea34, facilitando a passagem da luz através dessas estruturas e impedindo sua dispersão29. A não vascularização do estroma é extremamente necessária para auxiliar nessa transparência. Assim, distúrbios na matriz extracelular e excesso de hidratação, por exemplo, perturbam a transparência da córnea, resultando em diminuição da visão29,30,34.
1.3.4 Membrana de Descemet
A membrana de Descemet é uma membrana basal resistente, acelular e constituída por uma matriz extracelular composta por colágeno do tipo VIII, principal componente desta camada, e laminina29,30,31. É constituída por duas camadas: uma anterior, com bandas (lâminas constituídas por feixes de colágeno) e detectada durante o desenvolvimento fetal (por volta de 12 semanas de gestação), e uma posterior, sem bandas e secretada pelo endotélio da córnea após o nascimento29,30. Em pacientes com a FECD, há um espessamento anormal dessa membrana e a formação de excrescências endoteliais denominadas guttata35, (Figura 3). A guttata se desenvolve na região central da córnea nos estágios iniciais da doença, se espalhando para a periferia à medida que a doença progride12.
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Figura 3. Microscopia especular da córnea. Exame de microscopia especular de um indivíduo não afetado, revelando uma camada íntegra de células endoteliais (à esquerda), e de um indivíduo afetado pela FECD (à direita), revelando a presença de córnea guttata (manchas escuras), característica típica da Distrofia de Fuchs.
1.3.5 Endotélio
O endotélio é formado por uma única camada de células hexagonais que não possuem a capacidade de se regenerar in vivo. Possui uma densidade celular que varia de 3000-4000 células/mm2 no momento do nascimento até aproximadamente 2500 células/mm2 na idade adulta, devido a esta incapacidade em se regenerar. Na tentativa de compensar a perda e preencher os espaços deixados, as células restantes perdem seu padrão hexagonal, deslocando-se na direção da área lesionada, aumentando seu tamanho (polimegatismo) e alterando sua forma (pleomorfismo)12,29,30.
A principal função do endotélio é a regulação da hidratação das outras camadas da córnea31,34. A manutenção desse gradiente de hidratação depende de junções apertadas presentes e da função de bomba que esta camada exerce, associada principalmente à bomba sódio potássio (Na+/K+-ATPase) localizada nas membranas das células endoteliais da córnea. Por um lado, a bomba sódio-potássio permite a transferência de fluidos e eletrólitos do humor aquoso para a córnea avascular. Por outro lado, bombeia ativamente o fluido para fora da córnea e de volta para o humor aquoso, mantendo assim esse gradiente e, consequentemente, a transparência da córnea. A disfunção nesse mecanismo, devido principalmente à perda de densidade celular, resulta em acúmulo de fluidos no interior da
córnea e, consequentemente, em edema, característica observada em estágios avançados da doença30,36. Assim, o aumento da espessura da córnea, normalmente, indica alguma condição patológica do endotélio37.
1.4 Aspectos Clínicos
O desenvolvimento da doença varia de alterações endoteliais precoces, quando os pacientes ainda são assintomáticos, até as formas severas epiteliais, primeiramente, descritas por Ernest Fuchs, com uma progressão que geralmente começa no início da meia idade, frequentemente em mulheres, e que ocorre ao longo das décadas seguintes1,38,39.
Essas primeiras alterações endoteliais iniciais são representadas por poucas guttatas na região central da córnea em ambos os olhos, que aumentam em número e progridem para o restante da córnea ao longo do tempo38,39 (Figura 4).
Figura 4. Microscopia Especular da córnea. Progressão da córnea guttata na Distrofia de Fuchs. Fonte: ZOEGA et al., 2006.
Sem o histórico familiar da doença conhecido, a presença de guttata pode ser primeiramente descoberta como um achado casual em um exame oftalmológico de rotina. Já indivíduos com histórico familiar da doença, devem ser avaliados antes do desenvolvimento dos sintomas, especialmente se ambos os pais são afetados, pois no caso dessa dupla contribuição genética, pode ocorrer um aumento precoce da gravidade. Guttatas encontradas apenas na região periférica da córnea são achados normais resultantes do envelhecimento e são chamadas de corpúsculos de Hassal-Henle e nunca levam a um edema de córnea. Também podem ser formas secundárias de traumas, toxinas ou infecções e, assim, não são classificadas como FECD36.
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Para facilitar o diagnóstico e o entendimento da progressão da doença, foi designada, em 1979 por Krachmer e colaboradores, uma escala de classificação da FECD, a escala de classificação de Krachmer3 (Tabela 1).
As primeiras apresentações sintomáticas dos pacientes são indolores, podendo incluir a diminuição da acuidade visual, fotofobia, brilho intenso e halos ao redor das luzes, os quais são piores no período da manhã. Na córnea intacta, a regulação de sua hidratação depende de um equilíbrio na transferência de fluidos entre o epitélio e o endotélio40,41. Durante o sono, o fechamento das pálpebras e a subsequente diminuição da evaporação do filme lacrimal, aumenta o estresse sobre a camada endotelial, que deve acomodar a regulação do conteúdo de água da córnea. Devido a uma diminuição da função de bomba resultante da perda de células endoteliais da córnea, ocorre um desequilíbrio homeostático e o fluido fica incapaz de deixar efetivamente a córnea durante a noite, tornando a visão do paciente embaçada ao acordar. Esse padrão de alterações visuais pela manhã foi identificado na descrição inicial da doença por Ernest Fuchs, que examinou repetidamente um indivíduo durante várias horas do dia42-45.
Com a progressão da doença e o consequente comprometimento funcional da camada endotelial, ocorre retenção de líquidos no interior da córnea, resultando em edema e, em casos mais graves, no desenvolvimento de bolhas subepiteliais e epiteliais dolorosas (devido a intensa inervação da córnea). Estas, se não tratadas, podem progredir para a perda da sensibilidade da córnea, da acuidade visual, e finalmente, para o desenvolvimento de opacificação da córnea, comprometendo muito a acuidade visual destes pacientes, sendo o transplante de córnea o único tratamento definitivo para a FECD. Esse processo ainda pode ser exacerbado por um trauma, cirurgia, exposição tóxica ou infecção42-45.
Tabela 1. Escala proposta por Krachmer e colaboradores para descrever e classificar a severidade da FECD.
Escala de Krachmer (FECD)
Grau 0 Até onze guttatas na região central de cada córnea.
Grau 1 Doze ou mais guttatas não confluentes na córnea de pelo menos um dos olhos.
Grau 3 Uma zona larga superior de 2 a 5 mm de guttata confluente na região da córnea central.
Grau 4 Uma zona maior que 5 mm de largura de guttata confluente na região central da córnea.
Grau 5 Uma zona maior que 5 mm de largura de guttata confluente na região central da córnea, somado à edema estromal e/ou epitelial.
1.5 Aspectos Genéticos da FECD
A base genética da FECD é complexa e heterogênea, existindo casos esporádicos e familiares descritos em toda a literatura. Diferentes loci, no cromossomo 13pter-q12.13 (FECD2; OMIM #610158), cromossomo 9p22.1–p24.1 (FECD7; OMIM #613271), cromossomo 5q33.1–q35.2 (FECD5; OMIM #613269), e diversos genes têm sido implicados na patogênese da doença (Tabela 2). Entre esses, o collagen, type VIII, alpha 2 (COL8A2), associado à forma rara da doença (início precoce), e o solute carrier family 4, sodium borate transporter, member 11 (SLC4A11) e transcription fator 4 (TCF4), associados à forma clássica da doença (início tardio)4,46,47.
Tabela 2. Genes implicados na patogênese da Distrofia de Fuchs.
COL8A2 (MIM #120252) Cromossomo 1p34.3 (FECD1; OMIM #136800) TCF4 (OMIM #602272) Cromossomo 18q21.2 (FECD3; OMIM #613267) SLC4A11 (OMIM #610206) Cromossomo 20p13 (FECD4; OMIM #613268)
ZEB1 (OMIM #189909) Cromossomo 10p11.22 (FECD6; OMIM #613270 AGBL1 (OMIM #615496) Cromossomo 15q25.3 (FECD8; OMIM #615523) * Os termos que estão em negrito são os genes escolhidos para o estudo.
O gene COL8A2 (OMIM #120252), localizado no cromossomo 1p34.3 (FECD1; OMIM #136800), é composto por 2 éxons codificantes, totalizando 703 aminoácidos que codificam a cadeia alfa-2 do colágeno tipo VIII, o maior componente da membrana de Descemet. Está envolvido na diferenciação terminal do endotélio vascular, desempenhando um importante papel na manutenção da estrutura e integridade da parede dos vasos48. Diversos estudos mostram que mutações no domínio da tripla hélice da cadeia alfa-2 do
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colágeno VIII são identificadas como deletérias em membros afetados por FECD. Essas mutações levam a alterações consideráveis sobre a estabilidade da estrutura terciária do colágeno e, por conseguinte, na membrana de Descemet49,50,53. Outros estudos sugerem que esse tipo de colágeno também seja importante para a proliferação celular e migração durante o desenvolvimento do olho e recentemente o mesmo tem se mostrado fortemente associado com a espessura da córnea51,52.
Estudos em larga escala da patogênese da FECD em sua forma rara (início precoce) são escassos54, porém duas mutações raras, Q455K e L450W, são fortemente associadas à Fuchs de início precoce na literatura e análises de predição em programas especializados, como SIFT e PolyPhen, identificam essas mutações como deletérias na patogênese da FECD53,46.
BISWAS et al. relataram que a mutação p.Gln455Lys (Q455K) foi detectada em 3 famílias com Fuchs de início precoce no Norte da Inglaterra e Austrália, e MOK & colaboradores observaram esta mesma variante segregando em famílias da Coréia7,53. GOTTSCH et al. associaram a mutação p.Leu450Trp (L450W), com o fenótipo da doença de início precoce em famílias americanas, e relataram que pacientes afetados por essa mutação desenvolviam a forma grave da doença vários anos antes dos pacientes com a forma clássica da doença46.
O gene SLC4A11 (OMIM #610206), localizado no cromossomo 20p13 (FECD4; OMIM #613268), possui 20 éxons e codifica uma proteína de membrana, filogeneticamente identificada como um membro da família de proteínas transportadora de soluto 4 (SLC4), e atua no transporte eletrogênico de borato de sódio e íons Na+/OH-, na via condutora de água, além de participar do crescimento e proliferação celular55-58. Sua expressão ocorre na superfície basolateral de células endoteliais da córnea humana e mutações neste gene podem afetar a homeostase e, consequentemente, a manutenção do endotélio, característica observada em pacientes com a FECD59, 60.
VITHANA et al. sequenciaram o gene SLC4A11 em indivíduos afetados chineses e indianos, e identificaram as seguintes mutações que estavam ausentes em todos os controles: p.E399K (Glu399Lys), p.G709E (Gly709Glu), p.T754M (Thr754Met) e p.S33SfsX18 (c.99-100delTC)17.
Mutações adicionais foram identificadas em um estudo feito por RIAZUDDIN & colaboradores depois de sequenciar todas as regiões codificantes do gene SLC4A11 em 192 indivíduos afetados e 192 não afetados. As mutações p.E167D, p.R282P, p.Y526C, p.V575M,
p.G583D, p.G742R e p.G834S foram identificadas em afetados e estavam ausentes em todos os controles saudáveis, mostrando uma forte significância estatística desses achados4. Num estudo posterior, LIU & colaboradores demonstram em culturas de células endoteliais da córnea de humanos que a diminuição ou falta da função do gene SLC4A11 estava relacionada com um aumento do processo de apoptose observado nessas células quando comparados com células controle. Esse aumento vem sendo observado em pacientes com a FECD, sugerindo uma possível relação com a doença61.
O gene TCF4 (OMIM #602272), localizado no cromossomo 18q21.2 (FECD3; OMIM #613267), vem sendo considerado o maior contribuinte para a FECD47. Esse gene consiste em 20 éxons e codifica um fator de transcrição (E2-2) relacionado com a regulação gênica e expresso durante o desenvolvimento da córnea, estando envolvido na regulação do crescimento e diferenciação celular62,63. A transcrição do gene TCF4 sofre múltiplos processamentos, resultando na expressão de até 21 isoformas conhecidas até o momento. O papel e de que maneira elas são traduzidas para proteínas funcionais ainda não são completamente entendidos64. O gene TCF4 também regula o gene ZEB1 (10p11.22, OMIM #189909), outro fator de transcrição. Mutações no gene ZEB1 também são associadas a alguns casos da FECD, fazendo com que o gene TCF4 seja um excelente candidato na patogênese da FECD65.
Interessantemente, diversos estudos vêm relatando a associação de um trinucleotídeo (TGC) intrônico no gene TCF4, primeiramente identificado e nomeado CTG18.1 por BRESCHEL & colaboradores em 1997, com a FECD. Alelos entre 10 e 37 repetições (CTG10-CTG37) eram considerados estáveis, sendo os alelos com maiores repetições, instáveis, e consequentemente com potencial para serem patogênicos66. WIEBEN & colaboradores em diversos estudos definiram um limite de até 50 repetições (TGC>50) como marcador para susceptibilidade da FECD, com uma sensibilidade e especificidade de 79% e 96%, respectivamente67. Já outros autores, assumem como limite repetições acima de 40 (TGC>40)64. Estudos subsequentes também replicaram a expansão do trinucleotídeo em pacientes com a FECD, encontrando associações significativas63,68,69. Dada a variedade de transcritos produzidos por múltiplos processamentos presentes no gene TCF4, alguns autores consideram a possibilidade de que essas expansões TGC alterem o início da transcrição ou algum sítio de processamento, modificando o nível de expressão de TCF4 ou levando a um processamento inapropriado, produzindo uma proteína pouco ou não-funcional67,70. A suscetibilidade descrita das células endoteliais da córnea na Distrofia de Fuchs ao estresse
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oxidativo também pode ser considerada, devido à possibilidade dessas repetições, ricas em citosina e guanina, levarem a célula a um dano oxidativo67. Entretanto, o exato papel dessas repetições instáveis na patogênese da doença ainda não é totalmente compreendido. Portanto, investigações mais aprofundadas seriam importantes não só para a FECD, mas para a compreensão da fisiopatologia de outras doenças associadas a regiões de repetições nucleotídicas.
Embora muito progresso tenha sido feito desde sua descrição pela primeira vez por Ernst Fuchs, as bases genéticas complexas e heterogêneas da FECD têm ainda impedido a elucidação exata da patogênese da doença, bem como a previsão de progressão e o surgimento de tratamentos não cirúrgicos eficazes. A identificação de genes relacionados, a colaboração de pesquisas em diferentes populações e a identificação de mais fatores biomoleculares subjacentes, representariam um avanço significativo na compreensão dos mecanismos genéticos e fisiopatológicos da doença bem como no surgimento de tratamentos não cirúrgicos eficazes.
2 OBJETIVO
2.1 Objetivo Geral
Caracterizar as bases genéticas e possíveis associações fenotípicas da Distrofia Endotelial Corneana de Fuchs (FECD).
2.2 Objetivos Específicos
1 Avaliar possíveis mutações nos genes COL8A2 e SLC4A11 em famílias portadoras da FECD atendidos pelo serviço de Oftalmologia do Hospital das Clínicas da Unicamp e seu padrão de segregação nessas famílias.
2 Analisar a associação entre a repetição do trinucleotídeo intrônico TGC no gene TCF4 e a FECD nos indivíduos afetados e não afetados destas famílias, avaliando seu padrão de segregação.
3 CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1 Casuística
Foram recrutados 39 indivíduos pertencentes a três famílias com o histórico da FECD. Adicionalmente, foram recrutados 100 indivíduos controles saudáveis em termos
oftalmológicos, provenientes do Ambulatório de Doenças Externas do Departamento de Oftalmologia, Hospital de Clínicas da UNICAMP.
O protocolo de pesquisa seguiu os princípios enunciados na Declaração de Helsinque, assim como as determinações do Comitê de Ética em Pesquisa da FCM – UNICAMP. Tanto pacientes como os indivíduos controles foram informados sobre os objetivos e métodos da pesquisa, tendo a escolha de aceitar ou não participar da mesma, sem constrangimento ou modificação da sua assistência médica. O termo de consentimento (Anexos 1 e 2) foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNICAMP (Anexo 3).
3.1.2 Grupo Caso (Famílias) 3.1.2.1 Critérios de Inclusão:
Foram recrutados 39 indivíduos pertencentes a três famílias, com histórico da FECD confirmada por meio de microscopia especular. Na família 1, composta por quatro gerações, 18 indivíduos estavam disponíveis para o estudo, sendo 11 afetados e sete não afetados. Já na família 2, 15 indivíduos compreendendo três gerações estavam disponíveis e foram analisados, dos quais cinco eram afetados e 10 não afetados. Na família 3, composta por seis indivíduos representando duas gerações, todos os familiares, quatro indivíduos afetados e dois não afetados, foram analisados. Apenas os indivíduos com alteração bilateral foram denominados afetados. Os familiares sem nenhum sinal e sintoma da FECD, foram denominados não afetados (Figura 5).
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Figura 5. Heredograma. Representação das três famílias analisadas no estudo. Apenas os indivíduos enumerados em preto estavam disponíveis e foram analisados. Os números em vermelho correspondem à idade dos indivíduos analisados.
3.1.2.2 Critérios de Exclusão:
1. Cirurgia ocular prévia em qualquer olho
3. Afecções oculares ou sistêmicas de caráter inflamatório ou autoimune incluindo uveíte, olho seco grave, diabetes ou doenças reumatológicas
3.1.3 Grupo Controle
3.1.3.1 Critérios de Inclusão:
Para a melhor compreensão de alterações em que foi verificado segregação familiar, foram avaliados 100 indivíduos, saudáveis em termos oftalmológicos, de uma amostra da população brasileira atendidos no Ambulatório de Doenças Externas do Departamento de Oftalmologia, Hospital de Clínicas da UNICAMP, segundo os seguintes critérios:
1. Indivíduos acima de 50 anos
2. Microscopia especular sem evidência de guttata corneana
3. Pressão intraocular (PIO) com valores considerados normais em ambos os olhos
3.1.3.2 Critérios de Exclusão:
1. Histórico familiar de doença da córnea 2. Histórico familiar de cegueira
3. Afecções oculares ou sistêmicas de caráter inflamatório ou autoimune incluindo uveíte, olho seco grave, diabetes e doenças reumatológicas
3.2 Métodos
3.2.1 Exame Oftalmológico
Os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a exame oftalmológico, incluindo: 1. Biomicroscopia do segmento anterior realizada em lâmpada de fenda;
2. Medida da espessura central da córnea por meio de Paquimetria Ultrassônica; 3. Microscopia especular, permitindo a análise qualitativa e quantitativa da camada
endotelial da córnea.
Além do exame oftalmológico, foram coletados dados sobre sexo e idade de ambos os grupos.
3.2.2 Extração de DNA
Foram colhidos 10 ml de sangue periférico em frasco estéril, com EDTA 10% como anticoagulante, de todos os indivíduos submetidos ao estudo. O DNA foi extraído pelo método fenol/clorofórmio.
34
3.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) – Análise dos genes COL8A2 e SLC4A11 As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram padronizadas utilizando-se os seguintes reagentes: um par de primer para cada região determinada (sense e anti-sense) a partir da sequência registrada no “Genbank” sob o número NG_017016, tampão da enzima 10X [Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, gelatina 0,01%]; MgCl2 50 mM; mistura de nucleotídios 10mM (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), Taq DNA polimerase (InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) na concentração de 5U/µl, somados a 50ng de DNA genômico e água deionizada estéril, completando o volume para 25 µl.
Posteriormente, as amostras foram amplificadas por meio de aparelho termociclador (APPLIED BIOSYSTEMS VERITI™ 96-WELL THERMAL CYCLER, Forster City, CA, EUA), segundo as condições: desnaturação inicial de 5 minutos a 95ºC; seguida por 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a XºC, onde X é a temperatura de anelamento específica para cada par de primers, e 45 segundos a 72ºC. A extensão final foi de 7 minutos a 72ºC. A tabela 3 detalha todos os primers, tanto para o gene COL8A2 quanto para o gene SLC4A11, utilizados no presente estudo. Finalmente, os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese e visualizados com auxílio da luz ultravioleta em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídeo.
Tabela 3. Sequências dos primers utilizados no rastreamento dos genes COL8A2 e SLC4A11
Gene Primer (5' – 3') Éxon
Sense (Forward) Antisense (Reverse)
COL8A2 AGGAGGTGGCTTATGCAGAC ATGACCTGAAGGTGGAGTGG 1 COL8A2 CAAACCCCATCTTCCATGAG TGGGCACCTGGTTTTCC 2 COL8A2 CCCCTCAGGCATTACTATCC TCCCACACCGTCTACTCCAG 2 COL8A2 AGCTGGCTTAGGCAAACCTG GAGCCCCAAGTCACCTTTC 2 COL8A2 TCCTGGAGTAGACGGTGTGG GCCTGGTTCCCCCTTCAG 2 COL8A2 GGGGCAGAAAGGTGACTTG TGTGGCCATTGTAGAGAGTCC 2 COL8A2 CTCTCTACAATGGCCACAGC GTTATGTGGGGCAGAGCAAG 2 SLC4A11 CCCAATTGTTCTCCCTTTTG TCTAGCTTCCCGAAGAGTGG 1-2 SLC4A11 AGCTGCCTTCCTCGCCTATG TCCCTGTTGAGCTGCTCCTG 3-4 SLC4A11 TCCAGGAGCAGCTCAACAG AGTGCTCCAGCCCTCTTCTC 5-6 SLC4A11 CGTCCCATTTGCTCTTCTTT GTTTCTGACACACCCACAGG 7 SLC4A11 ATGGGGAGAGCACCTTCAC GAAGTCCAAGGGGTACAAGG 8 SLC4A11 CTTGGTGCATCAGAGACAGC GATGGGAGAGAGGGTTTGC 8-9 SLC4A11 GAAGGAACGCAGCACAGTCTC GCTATGGTCTTCTGCACGTCTG 9-10-11 SLC4A11 CCATTGGTGATTCTGCTGAC TCATCAGAGTGGGTGTGGTC 11-12 SLC4A11 CTCAAGGCTTGGGATCTGG CTTGAGCCAGTCCTATGTGC 13
SLC4A11 CAGAGATGGGACAGGGACAG CAGTCGGACAGGATCTCTCG 14 SLC4A11 CTCAGCCTCCTCATCATGC ATCGCAAAGGGGCTCTC 15 SLC4A11 CGGGAAATCGAGAGTGAGTT CGTCTCCTTCACGTTCACAA 16-17 SLC4A11 CTTAGTGGAGGAGCGTGTGG ACCCTCCGGATGTAGTGTG 18 SLC4A11 CTGGCCACATGGGACATAG CTAGGCAGGACCCCTCCTC 18-19 SLC4A11 CCACTGCCTTCTCTCTGACC AAATCCATCCTGCTCAGTCC 20
3.2.4 Sequenciamento de DNA
Os produtos da PCR foram purificados com 1 µl das enzimas exonuclease I e fosfatase alcalina “ExoSAP-IT” (Amersham Life Sciences, Uppsala, Sweden) e incubados a 37ºC por 15 minutos seguido de 80ºC por 15 minutos. Para a reação de sequenciamento foi utilizado 1 µl do produto purificado para um volume final de reação de 10 µL, contendo 1 µL de “Big Dye Terminator Ready Reaction v3.0” (ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems Foster City, CA, USA), 4 µL do tampão de sequenciamento 5X (Applied Biosystems Foster City, CA, USA) e 5 pmol de um dos primers (“sense” ou “antisense”) utilizados na PCR, sendo o volume final completado com água deionizada estéril. As condições das reações de sequenciamento foram: 25 ciclos a 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 5 segundos e 60ºC por 4 minutos. Após esta reação, as amostras foram novamente purificadas para eliminação dos nucleotídeos não incorporados, eluídas em 10 µL de Formamida Hi-DiTM (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA), colocadas em gelo e submetidas à eletroforese no sequenciador automático de DNA “ABI PRISM 3500” (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA).
As sequências genômicas foram analisadas com o auxílio dos softwares gratuitos CodonCode Aligner v6.0.2 e CLC Sequence Viewer 6.8.1 e submetidas a buscas por similaridade, utilizando-se o “algoritmo de buscas” BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
3.2.5 Ensaio de STR – Short Tandem Repeat (STR) Assay
A análise do microssatélite TGC no gene TCF4 foi realizada através de PCR em duplicata para cada amostra, utilizando-se um primer sense, marcado com 6-carboxyfluorescein na extremidade 5’ (FAM-5’ CAGATGAGTTTGGTGTAAGATG 3’) e um primer anti-sense não marcado (5’ ACAAGCAGAAAGGGGGCTGCAA 3’), tampão da enzima 10X [Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, gelatina 0,01%]; MgCl2 50 mM; mistura de nucleotídios 10mM (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), Platinum Taq DNA Polimerase
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(InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) na concentração de 5U/µl, somados a 4 µl de DNA genômico a 50ng/µl e água deionizada estéril, completando o volume para 15 µl. As condições de ciclagem foram: Desnaturação inicial por 5 minutos a 94ºC, seguida por 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 61ºC, e 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi de 5 minutos a 72ºC. Aos produtos de uma das PCRs foram adicionados Formamida Hi-DiTM (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA) e o padrão interno de peso molecular GeneScan™ 600 LIZ® (Foster City, CA, USA), e levados ao sequenciador automático “ABI PRISM 3500” (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA). Os perfis eletroforéticos foram analisados utilizando o software GeneiousTM (Biomatters Limited). Foi considerado como alelo expandido repetições iguais ou maiores do que 40 TGCs64,68,69, um valor de corte ligeiramente maior do que as 37 repetições relatadas por BRESCHEL et al.66 como limiar da estabilidade alélica neste lócus.
Para validação do ensaio STR, realizou-se a separação dos produtos da duplicata das PCRs em gel de agarose 3%. Cortou-se o gel no local exato das bandas com o auxílio de luz ultravioleta e realizou-se a purificação com o Kit WIZARD® SV GEL AND PCR CLEAN-UP
SYSTEM (Promega, Madison, WI, USA). Em seguida, estes produtos foram analisados por Sequenciamento de Sanger no sequenciador automático “ABI PRISM 3500” (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA) e os resultados foram comparados com os fragmentos analisados pelo software GeneiousTM (Biomatters Limited).
3.2.6 Análises in silico
Foram realizadas análises in silico por meio de três programas que avaliam alterações em sítios de splicing, SpliceAid2 (http://193.206.120.249/splicing_tissue.html), Exonic splicing regulatory elements ou ESRs (http://ibis.tau.ac.il/ssat/ESR.htm) e Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org). Os dois primeiros analisam possíveis efeitos de mutações em nível de RNA, avaliando se sítios de proteínas regulatórias que determinam padrões de splicing do pré-RNAm atuantes na região da alteração são afetados. Já o terceiro software, não só estima o impacto da variante analisada no(a) gene/proteína, como também avalia o potencial efeito da alteração em causar doenças, classificando-a.
Foram realizados os testes exato de Fisher para variáveis categóricas (gênero) e o teste t de Student para variáveis contínuas (idade) com o intuito de avaliar a diferença da média entre os dois grupos. Considerou-se estatisticamente significativo valor de p < 0,05.
4 RESULTADOS
Foram avaliados um total de 39 indivíduos, compreendendo 20 indivíduos afetados e 19 não afetados, pertencentes a três famílias com histórico da FECD. Vinte e dois pacientes eram mulheres e 17 homens, com uma predominância de mulheres entre os indivíduos afetados (13 versus 7, p = 0,34). A média de idade dos indivíduos afetados foi de 52,4 + 16,55 comparado com 41,52 + 22,96 dos familiares não afetados (p = 0,09).
4.1 Rastreamento dos genes COL8A2 e SLC4A11
Foram identificadas no estudo 23 alterações previamente descritas, como mostra a tabela 4. Entretanto, essas variantes estavam presentes em ambos os grupos, afetados e não afetados, não tendo sido verificados, então, quaisquer padrões de segregação nas famílias analisadas.
Tabela 4. Variantes previamente descritas identificadas, segundo o banco de dados Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html). GENE COL8A2 SLC4A11 rs142307403 rs3810562 rs41281862 rs58757394 rs274754 rs3827075 rs41281858 rs34460295 rs274753 rs41281860 rs2281575 rs3803956 rs66899567 rs79346175 rs3803957 rs3827076 rs35495320 rs6139040 rs10048856 rs3810561 rs57985157 rs3803953 rs3803955
Além das variantes descritas acima, identificou-se a presença de uma deleção intrônica, c.1172-19_1172-18delTC (rs113277027), no gene SLC4A11, segundo o banco de dados Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) e Exome Aggregation Consortium
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(ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), co-segregando com o fenótipo da doença na família 3, como mostra a figura 6.
Para melhor compreender a alteração, foram incluídos e analisados por sequenciamento de Sanger 100 indivíduos controle, pertencentes a população brasileira, não aparentados e considerados saudáveis em termos oftalmológicos. No entanto, a deleção não foi observada na amostra controle analisada. Adicionalmente, foram realizadas análises in silico na tentativa de melhor entender o possível efeito desta deleção nos transcritos mutante.
Figura 6: Segregação da deleção intrônica rs113277027 (c.1172-19_1172-18delTC) no gene SLC4A11 na família 3. (A): Eletroferograma do sequenciamento de Sanger de um indivíduo não afetado, sem a deleção. (B): Eletroferograma do sequenciamento de Sanger de um indivíduo com a FECD. Note a presença da
deleção em heterozigose (área sublinhada em preto). Os números em azul presentes no heredograma correspondem à idade dos indivíduos.
4.1.2 Análises in silico para o gene SLC4A11
O primeiro software utilizado para uma melhor compreensão do possível efeito da deleção detectada no gene SLC4A11 na família 3 foi o SpliceAid2. Esta ferramenta prevê possíveis efeitos de mutações em nível de RNA, avaliando proteínas regulatórias ligantes de RNA, presentes na região da alteração analisada, que atuam na regulação de splicing do pré-RNAm. Este programa disponibiliza a análise tecido-específica das proteínas regulatórias coletadas a partir dos bancos de dados Human Protein Atlas, Human Protein Reference Database ou HPRD, Human Proteinpedia, Transcriptome Map e Cancer Genome Anatomy Project ou CGAP. Deste modo, realizou-se a análise restrita de fatores regulatórios de splicing atuantes no tecido da córnea.
Esta análise (Figura 7) revelou que a deleção suprime um sítio de ligação de uma ribonucleoproteína heterogênea (hnRNP) conhecida como proteína ligante do trato polipirimidínico – PTB ou PTBP1, do inglês Polypyrimidine tract binding protein.
As ribonucleoproteínas heterogêneas são um grupo de proteínas regulatórias muito importantes para a maturação do pré-RNAm, participando da regulação do splicing e montagem do spliceossomo82, sendo a PTB uma proteína conhecida por sua atividade repressora no processo de splicing, além de participar da clivagem do sítio poly(A) do pré-RNAm83. Já o trato polipirimidínico, é uma região intrônica, rica em pirimidinas, importante para a montagem do spliceossomo e, consequentemente, para o processo de splicing72.
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Figura 7. Histograma gerado pelo software SpliceAid2
(http://193.206.120.249/splicing_tissue.html). As barras positivas, acima da linha correspondente ao pré-RNAm, representam proteínas regulatórias que se ligam a sequências facilitadoras da definição de éxons, isto é, exonic splicing enhancers (ESEs) e intronic splicing silencers (ISSs). Já as barras negativas, abaixo da linha correspondente ao pré-RNAm, representam proteínas regulatórias que se ligam a sequências que facilitam a definição de íntron, ou seja, intronic splicing enhancers (ISEs) e exonic splicing silencers (ESSs). As barras também possuem largura e altura variáveis, que estão relacionadas ao tamanho das sequências alvo e ao grau de afinidade de ligação, respectivamente. (A) NORMAL: No transcrito normal, sem a deleção, a Ribonucleoproteína heterogênea (hnRNP) PTB ou Proteína ligante do trato Polipirimidínico reconhece e se liga a seu sítio de ligação no pré-RNAm. (B)
MUTANTE: Já no transcrito mutante, a deleção suprime este sítio de ligação da Ribonucleoproteína heterogênea PTB.
A segunda análise, realizada pelo software exonic splicing regulatory elements – ESRs e ilustrada na figura 8, demonstrou um resultado idêntico à análise obtida pelo software SpliceAid2, indicando também que a deleção suprime um sítio de ligação da mesma Ribonucleoproteína heterogênea PTB ou proteína ligante do trato Polipirimidínico.
Figura 8. Histograma gerado na predição in silico pelo software ESRs - exonic splicing regulatory elements (http://ibis.tau.ac.il/ssat/ESR.htm). A saber, local da deleção: realçado em azul em (A). Sequências TGCATC, CTCTCT e GGGA em laranja: sítios de ligação alvos das proteínas regulatórias SRp55, hnRNP-I (PTB) ou PTB e hnRNP-F, respectivamente. (A) Normal: No transcrito normal, sem a deleção, a Ribonucleoproteína heterogênea PTB se liga a seu sítio alvo no pré-RNAm. (B) Mutante: Com a deleção, note que a Ribonucleoproteína heterogênea PTB não se liga mais a seu sítio alvo (resultado similar ao encontrado pela análise anterior com o software SpliceAid2).
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Realizamos ainda uma terceira análise, agora com o software Mutation Taster (Figura 9). Este software revelou que a deleção pode causar mudanças em sítios de splicing e afetar características da proteína sintetizada, resultado similar às duas análises anteriores. Entretanto, o software classificou a deleção como um polimorfismo “provavelmente inofensivo” em causar doenças.
Figura 9. Predição in silico pelo software Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org). Com a presença da deleção, circulada em vermelho, o programa revela uma possibilidade de alteração nas características da proteína traduzida e em sítios de splicing, porém classifica a alteração como um polimorfismo “provavelmente inofensivo”. A saber: “prob” significa a probabilidade de a predição estar correta. Valores próximos a 1 indicam uma alta segurança de predição.
O ensaio de STR foi capaz de detectar todos os alelos dos indivíduos analisados no estudo (Figura 10). Com o intuito de validar a técnica de STR, realizou-se o sequenciamento de Sanger.
Figura 10. Análise representativa da técnica de STR para o microssatélite CTG18.1. Representação de um indivíduo afetado (A), indicando a presença de um alelo expandido (contendo 62 repetições) e (B) de um indivíduo não afetado.
Foi observado a presença da expansão no gene TCF4 apenas na família 1. Oito dos nove indivíduos com a expansão apresentam a FECD, caracterizando uma penetrância (em genética, corresponde a proporção de indivíduos que portam um particular alelo ou genótipo e também expressam o traço associado – fenótipo) incompleta, porém alta, de 88,89%, com alelos contendo entre 61 a 69 repetições da trinca TGC. O único indivíduo não afetado e que portava a expansão continha alelos com 16/66 repetições. Três familiares afetados não portavam a expansão, e tinham alelos com 16/17, 16/33 e 11/33 repetições. A figura 11 demonstra o heredograma contendo a genotipagem para este microssatélite em todos indivíduos analisados do estudo. Adicionalmente, a sensibilidade (capacidade da expansão em identificar corretamente um indivíduo afetado) e a especificidade (capacidade da expansão em identificar e excluir corretamente um indivíduo não afetado) do teste para a família onde houve a presença da expansão foi de 72,7% e 85,7%, respectivamente.
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Não foi observado a presença da expansão nas famílias 2 e 3, não sendo possível então calcular a sensibilidade e a especificidade do teste para estes grupos.
Figura 11. Presença do microssatélite CTG18.1 nas famílias estudadas. Note que a expansão foi detectada apenas na família 1.
