Durante o curso da infecção, o declínio do peso corporal dos animais infectados foi concomitante à apresentação de sinais clínicos, em associação com o período de ampla multiplicação parasitária, característica da fase aguda da infecção. O aumento na morbidade entre os camundongos suscetíveis infectados, acompanhado de elevada taxa de mortalidade, relaciona-se com a capacidade desses animais em desenvolver uma resposta imunológica forte suficiente para, além de desenvolver ação antiparasitária, comprometer a integridade tecidual do hospedeiro. A suscetibilidade de camundongos C57BL/6 à infecção por T. gondii é demonstrada por uma ativação pró-inflamatória elevada, estimulando o desenvolvimento de necrose tecidual a nível intestinal e contribuindo para redução de peso do animal (LIESENFELD, 2002; COHEN; DENKERS, 2015; HATTER et al., 2018). Em contrapartida, a infecção de camundongos resistentes, como é o caso da linhagem Balb/c, consegue estimular uma inflamação eficaz no controle da parasitemia, porém sem comprometer drasticamente o tecido hospedeiro, repercutindo na maior taxa de sobrevivência entre grupos infectados e um padrão de recuperação de peso mais eficiente (HATTER et al., 2018).
Chew e colaboradores (2012) demonstraram que a partir da segunda semana pós-infecção já é possível a identificação de cistos tissulares no cérebro de camundongos Balb/c infectados. Esse período marca o estabelecimento de uma resposta imunológica eficiente, capaz de iniciar o processo de cronificação. No modelo de infecção aqui desenvolvido, foi observado que a partir das duas semanas pós- infecção, os camundongos infectados Balb/c voltaram a apresentar um comportamento mais ativo e passaram a estabilizar o peso corporal, sem haver outros declínios. Por outro lado, essa melhora no quadro clínico para o C57BL/6, começou a ser observado de maneira sutil após 21 dias de infecção. Essa variação entre suscetibilidade e resistência à infecção tem sido demonstrada em vários trabalhos ao longo dos anos, relacionando o nível de patogenia desenvolvida a vários fatores como tamanho no inóculo, cepa, estágio e via de administração do parasito, linhagem do camundongo e padrão de resposta imune desenvolvida (ARAUJO et al., 1976; LIESENFELD, 2002; BEHNKE; DUBEY; SIBLEY, 2016; BRUNO SILVA DE OLIVEIRA et al., 2018; WATSON; DAVIS, 2019).
O paradigma entre suscetibilidade e resistência à infecção pelo T. gondii pode ser explicado por fatores ligados tanto ao hospedeiro quanto ao parasito. As características genéticas observadas entre as linhagens de camundongos estão relacionadas com a capacidade de estabelecer uma resposta antiparasitária eficiente. Foi demonstrado que a variação de haplótipos do MHC de classe I, entre as linhagens Balb/c e C57BL/6, está relacionada com a resistência e suscetibilidade à infecção pela cepa ME49 (BLANCHARD et al., 2008). Os camundongos Balb/c que expressam o haplótipo H2d conseguem desenvolver uma resposta imune mediada por células T CD8+ mais eficiente do que camundongos C57BL/6, que apresentam o haplótipo do tipo H2b. Como resultado dessa influência na ação efetora das células T CD8+, observa-se o estimulo na produção de IFN-γ, principal citocina envolvida no controle da replicação parasitária (RESENDE et al., 2008; WATSON; DAVIS, 2019).
Apesar de interessante, essa relação entre as características genéticas do hospedeiro e o desenvolvimento da resposta protetora, não é suficiente para explicar os mecanismos envolvidos nas diferenças de respostas estabelecidas durante quadros de infecção aguda e/ou crônica pelo T. gondii. Outro fator envolvido, extremamente importante, é a variabilidade genotípica existente entre as cepas do parasito que tem grande influência sobre mecanismos de funcionamento da célula hospedeira, sendo capaz de interferir na resposta protetora desenvolvida e, assim, modificar características previamente classificadas como de resistência ou suscetibilidade (FUX et al., 2003; XIAO; YOLKEN, 2015). A partir da invasão celular, sabe-se que o T. gondii consegue interferir em vários mecanismos celulares, seja a nível gênico ou metabólico. O parasito consegue modular a resposta celular a seu favor sem causar, na maioria das vezes, danos de iminência mórbida ao hospedeiro. Dessa forma, desenvolvendo uma infecção evolutivamente bem sucedida, em um processo de interação equilibrada parasito-hospedeiro (DENKERS, 2003; LALIBERTØ; CARRUTHERS, 2008; LAMBERT; BARRAGAN, 2010).
As alterações na resposta imunológica, desenvolvidas durante a infecção, representam o melhor exemplo de como o parasito consegue subverter o funcionamento celular, e do organismo, a seu favor (LALIBERTØ; CARRUTHERS, 2008; MELO; JENSEN; SAEIJ, 2011). A infecção de animais isogênicos e outbred permite uma análise da influência do parasito sobre essa resposta estabelecida, correlacionando-a com os sinais clínicos característicos de uma immunopatogenia
desenvolvida na fase aguda, e seu impacto no estabelecimento da infecção crônica (ARAUJO et al., 1976).
Em camundongos Balb/c, resistentes à infecção e com uma resposta pró- inflamatória mediada por células Th1, pouco eficiente, foi observada a produção elevada de IFN-γ, que pode ser relacionada com a ativação e estimulação de células da imunidade inata e/ou de linfócitos T CD8+. Conforme mostrado por Blanchard e colaboradores (2008), a influência da infecção no estimulo da ativação de células T citotóxicas se relaciona com a capacidade dessas células em limitar a parasitemia; reduzindo a quantidade de cistos durante a fase crônica. Tais fatos, podem explicar a similaridade nos níveis de IFN-γ observados entre os animais infectados da linhagem Balb/c e C57BL/6.
Notadamente, em um ambiente naturalmente mais inflamatório, a infecção de camundongos suscetíveis C57BL/6 revelou uma produção de IL-12 e TNF-α, consideravelmente, mais elevada do que Balb/c. A produção dessas citocinas é crucial no estabelecimento de uma resposta antiparasitária eficiente. Sendo assim, durante a manifestação aguda da infecção, espera-se uma atividade pró-inflamatória elevada em decorrência à intensa taxa de replicação parasitária. Por outro lado, o estimulo inflamatório intenso contribui para o desenvolvimento da imunopatologia mais grave, comprometendo a integridade tecidual do camundongo infectado e resultando em uma taxa de mortalidade elevada (FUX et al., 2003; IQBAL, 2016; WATANABE et al., 2018). Observando o perfil de citocinas apresentado pelos camundongos Balb/c infectados e, considerando a importância da IL-12 para a manutenção da resposta inflamatória mediada pela produção de IFN-y (ROBBEN et al., 2004; IQBAL, 2016), os níveis mais baixos de IL-12 detectados podem representar um indicativo do envolvimento de outras células inflamatórias no controle parasitário. Bem como a capacidade de modulação imune apresentada pelo parasito, uma vez que a variação nos níveis produzidos dessa citocina, pode atuar no controle da replicação parasitária (CAI; KASTELEIN; HUNTER, 2000; MELO; JENSEN; SAEIJ, 2011; IBRAHIM, NISHIKAWA, 2016). Além disso, baixos títulos de TNF-α refletem a maior resistência do camundongo Balb/c para o desenvolvimento da fisiopatologia mais insidiosa, já que esta citocina possui um papel fundamental no estabelecimento do quadro clínico observado durante uma inflamação aguda. Outro fator importante a ser considerado é a capacidade do parasito em comprometer a produção de TNF-α. Esta interferência
se dá na exposição da região gênica promotora, responsável pela expressão da citocina (IQBAL, 2016; LENG et al., 2018).
O desenvolvimento de uma resposta pró-inflamatória se correlaciona com a expressão de citocinas de perfil antagonista, podendo agir, tanto favorecendo a replicação parasitária durante a manifestação aguda, quanto estimulando os mecanismos de reparo tecidual e manutenção da homeostase do organismo infectado (COUPER; BLOUNT; RILEY, 2008; IQBAL, 2016). Nesse estudo, a relação entre a produção de IL-12 e IL-10 pode refletir a interferência do desenvolvimento de uma resposta pró-inflamatória sobre o estabelecimento de mecanismos regulatórios; favorecendo o parasito durante a infecção. Isso pode ser explicado pela capacidade da IL-12 em influenciar positivamente a produção de IL-10 em linfócitos Th1 sob reestimulação (CHANG et al., 2007). Sendo assim, durante um processo infeccioso, os níveis elevados de IL-10 podem refletir essa interação entre respostas imunológicas antagonistas, podendo ajudar o parasito a se estabelecer no organismo hospedeiro durante os momentos iniciais da infecção, sendo um mecanismo de adaptação utilizado pelo parasito numa co-evolução com seus hospedeiros (SCHMID-HEMPEL, 2009). Em seguida, a resposta anti-inflamatória pode passar a estimular mecanismos de reparo tecidual e combate ao desenvolvimento da imunopatologia local, com o estabelecimento da infecção crônica (WILSON et al., 2005; COUPER; BLOUNT; RILEY, 2008; JEONG et al., 2016).
Outro ponto importante a ser levado em consideração é a relação entre a proteção e o comprometimento tecidual do hospedeiro durante um processo infeccioso. Tal fato se traduz no equilíbrio, entre a produção de citocinas imunorregulatórias, como TGF-β, e o estabelecimento da resposta antiparasitária. A produção dessa citocina é crucial para a diferenciação de células Treg, essenciais para manutenção da tolerância imunológica frente a infecções (SANJABI; OH; LI, 2017). Nesse trabalho, os níveis de TGF-β podem evidenciar a capacidade dessa citocina regulatória em interferir na produção de mediadores pró-inflamatórios e, em um contexto de imunomodulação, não se pode descartar a influência dos antígenos parasitários no estabelecimento dessa resposta, modulando o equilíbrio das moléculas estimuladoras e inibitórias das vias de sinalização (ZARE-BIDAKI et al., 2016; QIU et al., 2016; MARCHIORO et al., 2018).
Com isso, o parasito pode usar os efeitos inibitórios do TGF-β para escapar das respostas imunes induzindo sua regulação positiva (ZARE-BIDAKI et al., 2016). As
variações na interação entre perfil pró- e anti-inflamatório durante a infecção, apontam para a capacidade imunorreguladora do parasito em estimular um ambiente favorável a seu desenvolvimento e colonização de outros tecidos durante o quadro agudo, ao mesmo tempo que consegue influenciar os mecanismos necessários para evitar um comprometimento tecidual exacerbado que culmine em sua cronificação e permanência no hospedeiro; seu objetivo enquanto parasito.
O envolvimento desse ambiente inflamatório no estabelecimento da patologia cerebral reflete-se em como o parasito consegue interferir na expressão de receptores de membrana e enzimas, facilitando sua disseminação e passagem por barreiras epiteliais (CLARK et al., 2010; CHOU; LAI, 2011; WANG; LAI, 2013; SA et al., 2015). A ativação endotelial desencadeada a partir do estabelecimento da infecção, com aumento na expressão de receptores de membrana, como ICAM-1 e PECAM-1, contribui para o extravasamento de células infectadas, favorecendo a invasão do tecido cerebral pelo parasito (UENO et al., 2015; HARKER; UENO; LODOEN, 2015; WATANABE et al., 2018; KANATANI et al., 2017).
A diferença na distribuição de cistos no encéfalo entre as linhagens, observada nesse trabalho, reflete a influência das características genotípicas e padrão de ativação imune observado no modelo de resistência e suscetibilidade à infecção. A característica de resistência à infecção pela cepa ME49 apresentada pelos camundongos Balb/c, pode ser observada pelo número de cistos significativamente mais reduzido do que aquele apresentado por camundongos suscetíveis C57BL/6. Adicionalmente a diferença no número de cistos, Brown e colaboradores (1995) mostraram que os camundongos resistentes apresentaram nível de encefalite toxoplásmica mais reduzido, com menor infiltrado de células inflamatórias e, como possível consequência, menores títulos de citocinas pró-inflamatórias.
A distribuição homogênea dos cistos entre as regiões encefálicas estudadas nesse trabalho vai de acordo com dados que expõem a ausência de tropismo por áreas cerebrais especificas (BERENREITEROVÁ et al., 2011; GATKOWSKA; WIECZOREK, 2012; SCHLÜTER; BARRAGAN, 2019). Apesar dessa distribuição aleatória dos cistos cerebrais, foi observado um número significativamente maior de cistos na porção mais caudal do encéfalo de camundongos C57BL/6 suscetíveis. Este achado pode estar relacionado com elevado infiltrado celular, acompanhando os principais pontos de vascularização e extravasamento das ramificações capilares durante a infecção aguda inicial (SCHLUTER; BARRAGAN, 2019).
O desenvolvimento da infecção crônica e o estabelecimento de uma neuroinflamação persistente, levando à quebra da homeostase e funcionamento cerebral passa a ser refletido nas alterações em receptores sinápticos e, consequentemente, na desregulação de neurotransmissores. O comprometimento do funcionamento cerebral induzido pelo T. gondii relaciona-se com a interferência no comportamento sináptico, através de modificações na expressão de enzimas e receptores de membrana. A presença dos cistos mostrou-se associada com modificações na taxa de expressão da enzima GAD67, levando a sua superexpressão e, consequentemente, influenciando a neurotransmissão GABAérgica. Com base nisso, supõe-se que o aumento na expressão dessa enzima poderia estar atuando de forma compensatória, buscando restabelecer terminais nervosos GABAérgicos em áreas onde a transmissão foi comprometida (TORRES et al., 2018).
Além da localização dos cistos no cérebro, outro ponto interessante é a capacidade do parasito em estimular a redução das redes perineuronais (RPN), como um indicativo dos efeitos indiretos da infecção sobre a estrutura cerebral, através do desenvolvimento de uma neuroinflamação crônica. Quando comparada aos camundongos Balb/c, a linhagem C57BL/6 apresentou maior redução das RPN, o que pode estar relacionado com o elevado nível de inflamação observado nessa linhagem murina, uma vez que um dos principais fatores capazes de comprometer a estabilidade das redes é o estabelecimento de uma neuroinflamação exacerbada, com o desenvolvimento de um ambiente pró-inflamatório rico em espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e MMPs ativas (YAO; LEONARD; REDDY, 2006) (DWIR et al., 2009; CABUNGCAL et al., 2013; WANG et al., 2014; DO; CUENOD; HENSCH, 2015; MORISHITA et al., 2015). Sendo assim, a relação entre a neurotoxoplasmose e doenças de cunho neuropsiquiátrico pode ser estabelecida conforme os padrões de neuroinflamação desenvolvidos no encéfalo, e o comprometimento dessas estruturas está intimamente relacionado com quadros de injúria cerebral, seja por trauma ou doenças neurodegenerativas (RAMESH; MACLEAN; PHILIPP, 2013).
Foi mostrado que a infecção por T. gondii estimula a produção de MMP-9 pela via dependente de Erk1-2/NF-κB, em astrócitos e micróglia ativados. Essa ativação se mostrou crucial para o controle da infecção no SNC e, juntamente com a presença de células T CD8+, estimula a produção de IFN-γ e TNF-α (SEIPEL et al., 2010; LU; LAI, 2013; LANDRITH et al., 2017).
O ambiente inflamatório exacerbado, como o observado nos camundongos C57BL/6, no parênquima cerebral contribui para degradação de componentes da matriz extracelular e estimulação da migração leucocitária em direção aos focos de replicação parasitária (LU; LAI, 2012; LIU; HUANG; LU, 2018). Essa capacidade de combater o parasito desempenhada pelo astrócito e micróglia, não é observada no neurônio que é incapaz de eliminar o parasito, não respondendo a ação do IFN-γ (SCHLÜTER et al., 2001; HIDANO et al., 2016). Baseando-se nesses dados, estudos apontam para a preferência do T. gondii por neurônios e, além disso, para o desenvolvimento de cistos nas projeções neuronais afastadas do corpo celular. Esse cenário estimula o comprometimento neuronal durante a infecção crônica, podendo ser evidenciado pela redução do número celular e aumento da apoptose neuronal em consequência da redução no fluxo sanguíneo cerebral e angiogênese, além do aumento da neuroinflamação estimulada pelo parasito (CABRAL et al., 2016; ESTATO et al., 2018; TORRES et al., 2018; WANG et al., 2018).
Padrões semelhantes de inflamação que estimulam a quebra das RPN podem ser observados em pacientes com Alzheimer, Esclerose Múltipla, Epilepsia e Acidente Vascular Cerebral Isquêmico (AVCI) (ZOPPO, 2010; DE LUCA; PAPA, 2016; PANTAZOPOULOS; BERRETTA, 2016; POTTER et al., 2016). Em casos de AVCI, a integridade da unidade vascular é afetada pela atividade de MMPs produzidas por células inflamatórias infiltradas e residentes, que são ativadas principalmente em resposta à liberação de moléculas sinalizadoras de morte celular, como HSP70, ATP e, principalmente, HMGB1 (do inglês – High Mobility Group Box 1 protein). Essa proteína é capaz de ser reconhecida por TLR2 e 4, levando à amplificação da resposta pró-inflamatória responsável por atuar degradando componentes das RPN (JIANG et al., 2005; DZYUBENKO et al., 2018; DZYUBENKO; MANRIQUE-CASTANO; KLEINSCHNITZ, 2018).
Outra semelhança que existe entre o estabelecimento da infecção cerebral pelo T. gondii e a patogenia desencadeada em doenças neuropsiquiátricas, está na alteração dos receptores de neurotransmissores presentes nos neurônios afetados. Estudos mostraram significante redução das redes perineuronais em pacientes diagnosticados com Esquizofrenia e Transtorno Bipolar. Essa desestruturação dos componentes de matriz contribui para a desestabilização da conectividade sináptica e funcionamento cerebral (BERRETTA et al., 2015; PANTAZOPOULOS; BERRETTA, 2016; ENWRIGHT et al., 2016), além de levar ao aumento da mobilidade de
receptores AMPA, alterando a capacidade de despolarização da célula e comprometendo o equilíbrio inibitório/excitatório neuronal (FRISCHKNECHT et al., 2009).
No caso da infecção cerebral, a análise de camundongos cronicamente infectados pelo T. gondii mostrou que a presença dos cistos no cérebro estimula a produção de autoanticorpos anti-NMDAR, podendo contribuir para a etiologia de sintomas psicóticos, uma vez que a redução na atividade desse receptor está associada com o estabelecimento de sinais esquizofrênicos, através de mudanças comportamentais observadas relacionadas à atividade locomotora e exploratória reduzidas (WAXMAN; LYNCH, 2005; LI et al., 2013; SNYDER; GAO, 2013).
Todos esses dados passam a fortalecer a teoria da capacidade de interferência do T. gondii no funcionamento cerebral, passando a ser fortemente relacionada com o estabelecimento de desordens neurológicas e psiquiátricas (ELSHEIKHA; ZHU, 2016; FLEGR; KUBA, 2016; MAHMOUD et al., 2016; ESTATO et al., 2018; HWANG et al., 2018; LANG et al., 2018; MCFARLAND et al., 2018; TYEBJI et al., 2019).
Neste contexto, torna-se possível estabelecer uma relação entre o perfil de resposta imunológica sistêmica desencadeada, e modulada pela presença do T. gondii, com o desenvolvimento da patologia cerebral em camundongos imunologicamente suscetíveis (C57BL/6) e resistentes (Balb/c) à infecção. Dessa forma, pode-se supor que o desenvolvimento de uma inflamação exacerbada a nível sistêmico pode estar influenciando a homeostase cerebral, induzindo à quebra da barreira hematoencefálica e, ao mesmo tempo, contribuindo para a chegada de um número maior de células infectadas e estabelecimento de uma quantidade maior de cistos tissulares ao longo do encéfalo.