UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Ramayana Morais de Medeiros Brito
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii NA ESTRUTURA DO TECIDO CEREBRAL E INFLUÊNCIA SOBRE A RESPOSTA
NEUROIMUNOPATOGÊNICA
Natal-RN Abril de 2019
RAMAYANA MORAIS DE MEDEIROS BRITO
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii NA ESTRUTURA DO TECIDO CEREBRAL E INFLUÊNCIA SOBRE A RESPOSTA
NEUROIMUNOPATOGÊNICA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito à obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária, na área de Parasitologia.
Orientação: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto Co-orientação: Draª. Ywlliane da Silva Rodrigues Meurer
Natal-RN Abril de 2019
RAMAYANA MORAIS DE MEDEIROS BRITO
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii NA ESTRUTURA DO TECIDO CEREBRAL E INFLUÊNCIA SOBRE A RESPOSTA
NEUROIMUNOPATOGÊNICA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito à obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária, na área de Parasitologia.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
Prof. Dr. André Talvani Pedrosa da Silva Universidade Federal de Ouro Preto – UFOP/MG
Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Brito, Ramayana Morais de Medeiros.
Avaliação dos efeitos da infecção por toxoplasma gondii na estrutura do tecido cerebral e influência sobre a resposta neuroimunopatogênica / Ramayana Morais de Medeiros Brito. - 2019.
90 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-Graduação em
Biologia Parasitária, Natal, RN, 2019.
Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto. Coorientadora: Profa. Dra. Ywlliane da Silva Rodrigues Meurer.
1. Parasitologia - Dissertação. 2. Toxoplasma gondii - Dissertação. 3. Neurotoxoplasmose - Dissertação. 4. Inflamação - Dissertação. I. Andrade Neto, Valter Ferreira de. II. Meurer, Ywlliane da Silva Rodrigues. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 576.8 Elaborado por Ana Cristina Cavalcanti Tinôco - CRB-15/262
Dedicatória
À minha “mãe-avó” Irene (In memoriam). Por ter me amado e cuidado desde os meus primeiros dias de vida. Por ter permanecido ao meu lado até seus últimos momentos. Por ter me ensinado o que é certo e o errado, por ter construído meu caráter e mostrado que a educação sempre vem em primeiro lugar. Por sempre confiar em mim e acreditar na minha capacidade. A senhora é a razão por eu ter chegado até aqui e será a força por trás de cada conquista minha.
Dedicatória
Ao meu orientador, Valter Andrade, por ter me recebido de braços abertos em seu laboratório e, junto com sua família, em sua vida. Por todo ensinamento, toda a confiança que depositou em mim, pelo carinho, paciência e amor à sua profissão de Educador. Obrigada por ter visto o entusiasmo nos meus olhos e ter apostado em mim. Foram dois anos espetaculares, de crescimento profissional e pessoal. Espero que possamos ter muitos anos pela frente para continuarmos fazendo ciência! Para mim será uma honra continuar pesquisando ao seu lado.
Obrigada por abrir meus olhos e minha mente para o maravilhoso mundo da Parasitologia.
Agradecimentos
Primeiramente a Deus, que permitiu que este trabalho conseguisse ser finalizado e, que por muitas vezes, concedeu a força necessária para me acalmar e seguir em frente.
À toda minha família. Obrigada pela educação, cuidados e confiança. Obrigada por nunca cortarem minhas asas e pelo apoio em todas as decisões e aventuras que decido enfrentar.
Minha tia Adriana Brito, que é minha inspiração e a pessoa que teve a maior influência na minha escolha pela Biologia. Por ter me mostrado que a Bioquímica não é um bicho de sete cabeças, mas sim fascinante! Por ter me mostrado que é importante e extremamente necessário ter garra e perseverança para seguir seus sonhos e suas metas. Por ser o maior exemplo de que estudar sempre valerá a pena.
Meu tio Auricélio, por sempre me dar suporte e apoio, por me incentivar a sempre ir adiante e nunca desiste. Por contribuir com minha educação da infância até os dias de hoje. Obrigada por ser esse exemplo de tio.
À Marci, por receber mais uma aluna do “proffy Valter” de braços abertos. Obrigada por sua amizade, descontração, obrigada pelo acolhimento e por sempre me receber calorosamente em sua casa. Você e Valter são exemplos a serem seguidos, pessoas fortes e batalhadoras. Agradeço a Deus por ter colocado vocês na minha vida!
À minha co-orientadora Ywlliane Meurer, por toda sua disposição em me ajudar nesse projeto, sua inteligência e paciência inabalável. Eu não teria conseguido ir em frente sem a sua ajuda! Sou eternamente grata.
À minha co-orientadora Andrea Lima de Sá, obrigada por toda contribuição no desenvolvimento, organização e idealização do projeto. Obrigada por sua animação diária e companhia durante as manhãs e tardes dedicadas aos experimentos.
À Andressa de Oliveira Maia, amiga, parceira, confidente, paciente. Sem dúvida alguma você é um dos maiores presentes que esse mestrado me trouxe. Sua força e determinação me deixam com muito orgulho de te chamar de amiga. Muito obrigada por tudo, por me aguentar chorando durante quase 2 horas no telefone, em pleno sábado, quando as coisas deram errado; por festejar comigo quando as coisas davam certo; por confiar em mim e por sempre poder confiar em você. Obrigada!!
À Marília Melo e Brenda Cardoso, minhas amigonyyyyyyys queridas! Não poderia ter pedido amigas melhores para conseguir sobreviver as disciplinas do mestrado. Vocês fizeram aquele primeiro ano passar de forma alegre e descontraída. Mesmo sabendo que nossos caminhos estão seguindo rumos diferentes, sei que nossa amizade consegue vencer barreiras! E que toda vez que nos encontramos, é como se nunca tivéssemos nos separado! Torço pelo
sucesso de cada uma, que consigam alcançar seus objetivos e sonhos! E que possamos sempre nos reunir para celebrar a vida com um bom vinho do lado!
À Brenna Marceliane de Melo Marcelino, minha “abiga irbã” que chegou para unificar as nações. Minha parceira de todos os momentos: acadêmicos e não acadêmicos. Obrigada por transformar os ares no dia-a-dia do laboratório, iluminando com sua energia contagiante onde quer que passe. Obrigada por sempre me ouvir, por me aguentar em todos os momentos. Obrigada por entrar na minha vida!!
À Isabela Maria Fortaleza Neves Bomfim, ou simplesmente “Bela”. Nossa história já vem de longa data. Desde os tempos da Bioquímica. Obrigada por permanecer na minha história e, mais do que nunca, por ser a pessoa com quem podemos contar de olhos fechados, faça chuva ou sol.
À Jorginho, também conhecido como “Jorge Lucas” (rsrs). A Parasitologia nos uniu. Eu espero que no futuro, você mantenha a promessa de dividir a disciplina de Parasitologia comigo, mas eu fico com a parte legal e você com Helmintologia (brincadeiraaaaaa, helminto é legal também). Obrigada por sua amizade, por sempre me incentivar a ir em frente; por confiar na minha capacidade e por topar sair de madrugada de casa para festas comigo e amanhecer o dia na rua. Obrigada por me fazer companhia nas madrugadas dedicadas à experimentos.
À Jully Anne, a rainha do Lab Helminto. Muitíssimo obrigada por toda sua ajuda, em todos momentos. Por me ajudar a bater placas, a cuidar dos camundongos. Obrigada por tudo, por sua descontração e bom humor, por sua disposição e por sempre estar preparada para o que der e vier!
À Mayara, Bia Martins, Beatriz, minhas parceiras do Fofocão! Sem vocês aquele corredor seria bem chato, heim? Apesar de vocês contribuírem para meus quilos mortais...kkk. Obrigada pela força que cada uma me deu durante esse período! Obrigada pelas resenhas, momentos de fofocas, confissões; por tudo!
Ao Prof. Paulo Marcos da Matta Guedes. Obrigada por todos os ensinamentos, conversas, por sua amizade e por me contaminar com seu entusiasmo e paixão pela ciência! Obrigada por ceder gentilmente o espaço do seu laboratório para que eu pudesse realizar alguns (muitos) experimentos e, acima disso, muito obrigada por todo incentivo e por depositar sua confiança em mim. Valeu, PG!
À Renata Antonaci, Josélio Galvão, Celeste Melo, Antônia Cláudia Câmara e a todos os outros professores do PPgBP por contribuírem de forma ímpar para minha formação! Obrigada por serem professores humanos, que se preocupam com seus alunos. Obrigada por sempre buscarem a melhor forma de nos ajudar com qualquer problema, por serem pacientes e por amarem tanto o que fazem!
Ao Prof Jefferson, Profa. Rovena e Ywlliane (mais uma vez); Sara Sophia, Neliane, Luiz Eduardo e demais membros do Laboratório de Estudos Neuroquímicos (LENq), do Departamento de Fisiologia, por me ajudarem e permitirem que o trabalho com os encéfalos fosse realizado. Muito obrigada por
todo o apoio, carisma e dedicação! Esse trabalho realmente não teria sido concluído sem a parceria e disposição de vocês!
À Thais Perez, Wilo e Jucélia, que se tornaram pessoas tão presentes na minha vida. Muito obrigada pela amizade de vocês, por todos os momentos, conversas, conselhos, suporte, brincadeiras e confiança. Vocês tornam meus dias mais leves!!
À Sara Cardoso, minha amiga querida que me aguenta há tantos anos! Obrigada por sempre me apoiar, por confiar em mim e por estar sempre ao meu lado! Não sei o que seria de mim sem você!
À Dani, Alex, Liz e Arthur Soares, por todos os momentos que compartilhamos desde a graduação! Obrigada por permanecerem sempre ao meu lado!
Ao professor Ricardo Wagner de Almeida Vítor, Rosa, Gabi, Wagner, Tarcísio, Rhuana, Hugo e todas as outras pessoas maravilhosas que me receberam de braços abertos no Departamento de Parasitologia da UFMG! Foram momentos ótimos e que espero poder repetir em breve!
Ao professor André Talvani, Guilherme e Ana Menezes, do Laboratório de Imunobiologia da Inflamação, na Universidade Federal de Ouro Preto, por serem tão atenciosos, acolhedores e por tornarem minha estadia em Ouro Preto tão agradável!
À Professora Janeusa Souto por ter contribuído de forma tão espetacular na construção do meu conhecimento em imunologia. Por sua disposição para tirar minhas dúvidas, por seu bom humor e por nos possibilitar a realização de experimentos cruciais para o desenvolvimento desse projeto. Obrigada a Cássio Souza, por sua disposição, simpatia e toda ajuda nos imunoensaios!
A Rhoger Coletto, meu gauchinho querido! Que está fortemente presente na minha vida, mesmo morando do outro lado do país. Você é a pessoa que sei que se um dia eu precisar roubar um banco, você estará no carro com o motor ligado me esperando para fugirmos!
À Suely Chavante, minha ex-orientadora, por ter proporcionado meu início na vida científica, por ter me acolhido em seu laboratório quando eu ainda estava começando a graduação. Obrigada por me incentivar, obrigada pelos puxões de orelha tão importantes na minha formação, obrigada por todos os ensinamentos e por sua amizade! Minha gratidão a você é eterna!
Aos membros do Laboratório de Glicoconjugados Bioativos I, do departamento de Bioquímica, Laís, Mirela, Jeffy, Bárbara e todos os outros que compartilham comigo tantos momentos bons, mesmo depois da minha saída do Departamento. Vocês sempre serão meus GAGuinhos favoritos!
À Romulo Cavalcante, meu querido rominho, agradeço tanto a Deus por ter você no meu caminho, pela oportunidade de aprender tanta coisa com você durante meu tempo de Iniciação Científica. Obrigada por sua amizade, companheirismo, ajuda em momentos difíceis, sua disposição para desabafo e para um cafezinho a tarde.
À Nathalie Sena, Luanderson, Tamyres Queiroga e Dênis, membros do Laboratório de Imunoparasitologia. Obrigada pelos momentos de descontração, conversas fiadas, pela amizade desenvolvida ao longo desse período!
Aos alunos de Iniciação Científica, Fernanda Tereza, Alexandre Lazoski, Ana Luiza (vulgo Bilu), Joyce Hercília e Rafaela Krüger, por toda ajuda e dedicação no dia-a-dia do laboratório, descontração e amizade.
A Alessandro Feitosa, que cruzou meu caminho há alguns anos e virou minha vida de pernas para o ar. Você foi o responsável por me ensinar tanta coisa e me ajudar a amadurecer, me fez conhecer a vida e o significado de companheirismo e confiança. Mesmo com toda a distância e apesar de todos os apesares, obrigada por sua presença na minha vida. Obrigada por seu apoio incondicional, por acreditar na minha capacidade e por sempre me incentivar a ir em frente. Obrigada por ter cruzado meu caminho e por existir na minha vida.
Aos funcionários do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, que com sua animação diária e contagiante me ajudaram a vencer as dificuldades que surgiram ao longe desses dois anos.
A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.
Ao Presidente Lula e à Presidenta Dilma, pelos anos de investimento no Ensino Superior, por incentivar a pesquisa e por possibilitar que pessoas, como eu, do interior do Estado do Rio Grande do Norte (e de todos os outros estados do Brasil), pudessem ter acesso a um ensino superior público de qualidade.
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram
conquistadas do que parecia impossível” – Charles Chaplin.
RESUMO
O Toxoplasma gondii consegue modular o funcionamento do sistema imune do hospedeiro, estabelecendo uma infecção persistente e contribuindo para o desenvolvimento de alterações cerebrais, com repercussões comportamentais. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da infecção pelo T. gondii na estrutura do tecido cerebral e sua repercussão sobre a resposta neuroimunopatogênica. Para tanto, camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6 foram infectados com cistos da cepa ME49 e acompanhados durante 30 dias. Após esse período, foi realizada dosagem de anticorpos IgG anti-T. gondii e citocinas IFN-γ, IL-12, TNF-α, IL-10 e TGF-β. Os cérebros foram perfusionados e submetidos à imunohistoquímica para análise das redes perineuronais e dos cistos teciduais desenvolvidos. Os camundongos da linhagem C57BL/6 foram mais suscetíveis à infecção, exibindo maior perda de peso corporal e menor taxa de sobrevivência do que animais da linhagem Balb/c. Análise da produção de anticorpos IgG anti-T. gondii demonstrou que a linhagem C57BL/6 produziu níveis menores do que camundongos Balb/c. Enquanto os níveis séricos de IFN-γ mostraram-se elevados entre as linhagens, a produção de TNF-α e IL-12 foi mais elevada para a linhagem C57BL/6. Em contrapartida, a produção de TGF-β e IL-10 mostrou-se semelhante para as duas linhagens. A análise da distribuição de cistos pelo encéfalo demonstrou a maior suscetibilidade da linhagem C57BL/6 à invasão tecidual pelo parasito, evidenciada pelo número de cistos consideravelmente mais elevado do que o observado na linhagem Balb/c. Os camundongos da linhagem C57BL/6 exibiram maior comprometimento das redes perineuronais, exibindo uma perda de 65% da integridade estrutural do cérebro, enquanto a linhagem Balb/c exibiu uma redução de apenas 46%. Nossos resultados indicam que animais C57BL/6 são mais suscetíveis a infecção devido a elevada produção de citocinas inflamatórias (TNF-α e IL-12). Esse dado relaciona-se ao diferente padrão na distribuição dos cistos entre as linhagens, com C57BL/6 apresentando um número significativamente mais elevado, além de exibir um maior comprometimento da estrutura cerebral quando comparado a Balb/c. Neste contexto, torna-se possível estabelecer uma relação entre a resposta imune sistêmica com o desenvolvimento da patologia cerebral em camundongos suscetíveis (C57BL/6) e resistentes (Balb/c) à infecção.
ABSTRACT
Toxoplasma gondii is able to manipulate the host's immune system to establish a persistent and efficient infection, contributing to the development of brain abnormalities with behavioural repercussions. In this context, the aim of this work was to evaluate the effects of T. gondii infection on the structure of brain tissue and its influence on the neuroimmunopathogenic response. C57BL/6 and Balb/c mice were infected with T. gondii ME49 strain tissue cysts and accompanied during 30 days. After this period, levels of antibody IgG anti-T. gondii and cytokines IFN-γ, IL-12, TNF-α, IL-10 e TGF-β were measured. After blood withdraw, mice were perfused and the brains submitted to immunohistochemistry for perineuronal nets and cyst quantification. Our results showed that C57BL/6 mice were more susceptible to infection than Balb/c animals, showing 40% and 100% survival, respectively. Increased body weight loss was also observed among infected C57BL/6 susceptible mice. Analysis of anti-T gondii IgG production demonstrated that C57BL/6 animals produce lower antibody levels than Balb/c mice. C57BL/6 mice showed high serum TNF-α and IL-12 production as well as TGF-β and IL-10 levels were similar between the two strains; C57BL/6 also had a higher number of cerebral cysts, with a higher occurrence of cysts in the caudal region of the brain when compared to Balb/c mice, which presented a more homogeneous cysts distribution. Immunohistochemistry analysis revealed greater loss of labeling for perineuronal networks in C57BL/6 animals when compared to Balb/c animals. These data raise a discussion about the ability of T. gondii influence the brain functioning and may be related to the development of neurological symptoms similar to those observed in well-known neuroinflammatory and neurodegenerative diseases. Our results indicate that C57BL/6 animals are more susceptible to infection due to high production of inflammatory cytokines (TNF-α and IL-12) and low production of regulatory cytokine (TGF-β). This data may be related to the different distribution pattern of cysts between the mice lineages, with C57BL/6 showing a significantly higher number besides showing a greater perineuronal networks impairment when compared to Balb/c.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Ciclo epidemiológico do Toxoplasma gondii 23
Figura 02 Ciclo biológico do Toxoplasma gondii 25
Figura 03 Mecanismo de invasão celular pelo Toxoplasma gondii 28
Figura 04 Via de ativação e produção de IL-12 e TNF-α após reconhecimento dos antígenos parasitários
29
Figura 05 Desenvolvimento da resposta pró-inflamatória e reguladora em resposta à infecção por Toxoplasma gondii
31
Figura 06 Possíveis mecanismos utilizados pelo Toxoplasma gondii para travessia de barreiras biológicas e invasão de sítios considerados imunoprivilegiados
34
Figura 07 Representação esquemática da estrutura das redes perineuronais 37
Figura 08 Representação esquemática da estrutura molecular dos proteoglicanos de condroitin sulfato
39
Figura 09 Representação esquemática da estrutura molecular dos PGCS da família das lecticanas, presentes nas redes perineuronais
39
Figura 10 Representação esquemática da localização da camada IV e organização do campo de barril do córtex somestésico primário
40
Figura 11 Esquema ilustrando a ordem das secções utilizadas para contagem das células e cistos
51
Figura 12 Média de perda de peso corporal durante 30 dias de infecção, em camundongos das linhagens Balb/c (A), C57Bl/6 (B)
54
Figura 13 Camundongos da linhagem C57BL/6 apresentaram maior mortalidade, com apenas 40% do grupo infectado chegando ao
Figura 14 Análise da produção de anticorpos IgG anti-T. gondii 30 dias após infecção, em camundongos das linhagens Balb/c e C57Bl/6
56
Figura 15 Comparação da produção de citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, IL-12 e TNF-α) em camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6
56
Figura 16 Comparação da produção de TGF-β e IL-10 entre camundongos infectados das linhagens Balb/c e C57BL/6.
59
Figura 17 Camundongos Balb/c apresentaram maior número de células WFA+ na região do S1BF quando comparados aos camundongos C57BL/6
60
Figura 18 Camundongos C57BL/6 infectados apresentaram menor número de neurônios WFA+ nas porções rostral, médio e caudal do encéfalo quando comparados aos camundongos Balb/c
61
Figura 19 Quantificação do número de cistos tissulares no encéfalo de camundongos Balb/c e C57BL/6
62
Figura 20 Diferença na distribuição de cistos nas regiões rostral, médio e caudal do encéfalo de camundongos infectados das linhagens Balb/c e C57BL/6
63
Figura 21 Quantificação do número de cistos tissulares no S1BF do encéfalo de camundongos Balb/c e C57BL/6
LISTA DE ABREVIATURAS
ACAN Agrecan
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida AMA-1 Antígeno apical de membrana 1
AMPA ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic, receptor para glutamato
APC Células apresentadoras de antígeno
ATP Trifosfato de adenosina
AVIDINA-HRP Avidina-horseradish peroxidase
BCAN Brevican
CD Célula dendrítica
CIITA Transativador de classe II
CTRL1 Controle 1
CTRL2 Controle 2
DMP Departamento de microbiologia e parasitologia ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática
ERN Espécies reativas de nitrogênio
ERK Quinase reguladora de sinal extracelular EROs Espécies reativas de oxigênio
GABA Ácido gama-aminobutírico
GAGs Glicosaminoglicanos
GAD67 Glutamato descarboxilase 67 GalNAc N-acetilgalactosamina
Gal Galactose
GlaA Ácido glicurônico
GATA3 Fator de transcrição para diferenciação de células Th2 GPI Glicosilfosfatidilinositol
GRA Proteínas dos grânulos densos
H2SO4 Ácido sulfúrico
HA Ácido hialurônico
HIV Vírus da imunodeficiência humana
HMGB1 High mobility group box 1 protein ICAM-1 Molécula de adesão intercelular 1
IFN-γ Interferon gamma
IgG Imunoglobulina G
IL Interleucina
IMC Complexo de membranas internas
IR Índice de reatividade
IRF-1 Fator de regulação do interferon-1
LABMAT Laboratório de biologia da malária e toxoplasmose MHC Complexo principal de histocompatibilidade
MIC Proteínas micronemais
MJ Junção motora
mL Mililitros
MMP Metaloproteinases de Matriz
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
MyD88 Proteína de diferenciação primaria mielóide 88
NCAN Neurocan
NF-κB Fator nuclear kappa b
NK Células natural killer
Nm Nanômetros
NMDAR N-methyl-D-aspartato, receptor para glutamato OPD O-phenylenediamine dihydrochloride
PBS Tampão fosfato salino
PECAM-1 Molécula de adesão de células endoteliais e plaquetárias Pg/mL Picogramas por mililitro
PGCS Proteoglicanos de condroitin sulfado RON/ROP Proteínas das roptrias
RPM Rotações por minuto
RRP Receptores de reconhecimento padrão
RPN Redes perineuronais
S1 Córtex somestésico primário
S1BF Campo de barril do córtex somestésico primário
SAG Antígenos de superfícies ancorados em GPI
SER Serina
SNC Sistema nervoso central
STAT Fator de transdução e ativação da transcrição T CD4+ Linfócitos T auxiliares
T CD8+ Linfócitos T citotóxicos
T-Bet Fator de transcrição para diferenciação de células Th1
Tg Grupos infectados com T. Gondii
TgESAs Antígenos excretados e secretados pelo T. Gondii TGF-β Fator de transformação do crescimento beta TgPRF Proteínas tipo profilina do T. Gondii
Th1 Linfócito T CD4+ da subpopulação 1
Th2 Linfócito T CD4+ da subpopulação 2
TLR Receptores do tipo toll
TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa Treg Linfócito T CD4+ regulador
VP Vacúolo parasitóforo
VCAN Versincan
XYL Xilose
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 22
1.1. Toxoplasmose e Toxoplasma gondii... 22
1.2. Interação parasito-hospedeiro... 26
1.3. Resposta imune à infecção pelo Toxoplasma gondii... 28
1.4. Neurotoxoplasmose... 33
1.5. Sistema Nervoso Central e Redes Perineuronais... 36
2. Objetivos... 44
2.1. Objetivo geral... 44
2.2. Objetivos específicos... 44
3. Metodologia... 46
3.1. Manutenção das cepas de Toxoplasma gondii... 46
3.2. Animais experimentais... 46
3.3. Imunoensaios... 47
3.3.1. Obtenção e preparação do soro... 47
3.3.2. Quantificação de IgG anti-T. gondii por ELISA... 47
3.3.3. Dosagem de citocinas... 48
3.4. Obtenção e Processamento do Tecido cerebral... 49
3.4.1. Perfusão, Craniotomia e microtomia... 49
3.4.2. Imunohistoquímica para Wisteria floribunda aglutinina (WFA)... 49
3.4.3. Montagem de lâminas... 50
3.4.4. Contagem de células e cistos tissulares no tecido cerebral 50 3.5. Análise Estatística... 51
4. Resultados... 54
4.1. Avaliação da Suscetibilidade de camundongos Balb/c e C57BL/6 à infecção pelo T. gondii... 54
4.2. Quantificação de citocinas pró-inflamatórias... 56
4.3. Quantificação de citocinas regulatórias... 58
4.4. Quantificação de células positivas para Wisteria floribunda (WFA+)... 59
4.5. Quantificação e análise da distribuição de cistos tissulares no
encéfalo de camundongos Balb/c e C57BL/6... 62
5. Discussão... 66
6. Conclusão... 75
1. INTRODUÇÃO
1.1. Toxoplasmose e o Toxoplasma gondii
A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída pelo mundo, com taxas de prevalência variando de 50 a 80%, conforme a região. No Brasil, essa taxa encontra-se acima de 50% entre a população (BICHARA et al., 2012; DUBEY et al., 2012; FILHO et al., 2012; FLEGR et al., 2014). A evolução clínica da toxoplasmose pode ser dividida em dois momentos: a infecção aguda, com um quadro oligossintomático que pode ser confundido facilmente com uma gripe ou outras doenças virais; e a infecção crônica, onde há o estabelecimento da resposta imune protetora, capaz de manter o parasito em estado quiescente enquanto o indivíduo for capaz de se manter imunologicamente competente, permanecendo assintomático ao longo de sua vida (LYONS; MCLEOD; ROBERTS, 2002; BUZONI-GATEL, WERTS, 2006).
A manifestação clínica apresenta-se relacionada a grupos específicos de pacientes, como gestantes, fetos, neonatos e imunossuprimidos, sejam pacientes com doenças autoimunes, transplantados ou portadores de HIV/AIDS. Neste último exemplo, um quadro de imunocomprometimento em decorrência da co-infecção com o HIV, há um déficit no estabelecimento da resposta imune protetora, o que leva à reativação da infecção aguda e, como principal característica, o desenvolvimento de um quadro de encefalite toxoplásmica, com prevalência estimada entre 30 a 50% dos casos, manifestando-se através de dores de cabeça, desorientação, déficit de força nos membros (superiores e/ou inferiores), febre e até convulsões (PEREIRA-CHICCOLA; VIDAL; SU, 2009; WEISS; DUBEY, 2009; DE OLIVEIRA et al., 2016; WANG et al., 2017b).
A infecção tem como agente etiológico o Toxoplasma gondii, protozoário pertencente ao grupo Alveolata (SU et al., 2012; SWAPNA; PARKINSON, 2017), sendo um parasito intracelular obrigatório, capaz de invadir e multiplicar-se em qualquer célula nucleada de várias espécies de animais homeotérmicos (TENTER et al., 2000) e, mais recentemente, teve sua presença evidenciada em animais pecilotérmicos (NASIRI et al., 2016). Esses dados levantam questionamentos sobre a capacidade infectiva e a variabilidade de hospedeiros intermediários facultativos
e/ou acidentais, que atuam contribuindo para a distribuição do T. gondii entre espécies de animais em vários níveis tróficos (Figura 01), além de poder estimular a ocorrência de variações genotípicas entre diferentes cepas do parasito (ANDRADE et al., 2013; CLEMENTINO ANDRADE et al., 2013).
A capacidade do parasito em infectar diversas espécies de hospedeiros pode estimular a ocorrência de modificações em seu genoma; associada a uma vantagem biológica e, dessa forma, contribuir para uma variação na capacidade infectiva, diretamente relacionada a uma alta variabilidade genotípica. No hemisfério Norte, sua população está distribuída em três linhagens clonais principais, bem descritas, do Tipo I, II e III, as quais variam entre níveis de virulência distintos (HOWE; SIBLEY, 1995). Recentemente, além dessas três linhagens, foi identificada uma quarta linhagem Figura 01: Ciclo epidemiológico do Toxoplasma gondii. 1: Ingestão de cistos teciduais presentes na carne de roedores e/ou aves pelo hospedeiro definitivo (gatos e outros felídeos); 2, 3: liberação de oocistos pelo hospedeiro definitivo no ambiente, contaminação do solo, água e alimentos e consequente infecção dos hospedeiros intermediários; 4: transmissão do parasito por transfusões sanguíneas e passagem transplacentária. Imagem: WORTH; LYMBERY; THOMPSON, 2013.
1
2
3
clonal existente na América do Norte, presente principalmente entre animais silvestres (DUBEY et al., 2011; KHAN et al., 2011). Essa distribuição clonal limitada existente no hemisfério Norte é um fato que não se observa em países do hemisfério Sul, onde existe uma maior variação genética entre as cepas do parasito (SHWAB et al., 2014), não havendo uma dominância de genótipos específicos em países da América Latina, como o Brasil (WENDTE; GIBSON; GRIGG, 2011; CLEMENTINO ANDRADE et al., 2013; SHWAB et al., 2014; SILVA et al., 2014).Toda essa variabilidade genotípica se desdobra na interação do parasito com o seu hospedeiro, determinando seu nível de patogenicidade (SILVA et al., 2014; PINHEIRO et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2016).
O parasito apresenta um ciclo de vida heteroxeno facultativo, apresentando sua fase de reprodução gemetogônica e esporogônica no hospedeiro definitivo (gatos e outros felídeos) e a fase de reprodução no hospedeiro intermediário (humanos, outros mamíferos e aves), de padrão citocinético denominado endodiogenia, endopoligenia ou esquizogonia, dependendo do número de células filhas formadas e o tempo da divisão celular (HU et al., 2002). Durante a infecção do hospedeiro definitivo (Figura 02), após a ingestão da carne da presa infectada (seja roedores ou aves), ou pela ingestão de oocistos infectantes, ocorre a ruptura dos cistos tissulares/oocistos durante sua passagem pelo trato gastrintestinal levando à liberação dos parasitos que irão invadir as células epiteliais, onde irão passar pelo processo de esquizogonia. Os esquizontes resultantes invadem outras células e continuam o ciclo até sua transição para o processo de gametogênese, onde haverá o desenvolvimento do macrogameta (feminino) e microgameta (masculino). A formação do zigoto, momento importante na reorganização genotípica do parasito, precede a formação de oocistos diplóides que serão eliminados junto com as fezes do animal (DUBEY, 1998; TENTER et al., 2000). Após liberados no ambiente, esses oocistos passam pelo processo de esporogonia, onde o oocisto sofre meiose para produzir oito progênies haploides denominadas esporozoítos, confinadas em duas câmaras denominadas esporocisto (4 esporozoítos/esporocisto), tornando-se viáveis para infecção de outros hospedeiros através de sua ingestão (DUBEY, 1998; BLACK; BOOTHROYD, 2000; TENTER et al., 2000; BLADER; SAEIJ, 2009).
Na dinâmica de transmissão, o hospedeiro intermediário (ex.: humano) pode se infectar pela ingestão de oocistos infectantes presentes na água contaminada e, até mesmo, em alimentos como hortaliças. Além disso, o indivíduo também pode se infectar com cistos presentes em carnes que não foram devidamente preparadas.
Após ingestão de cistos tissulares e/ou oocistos, estes rompem conforme sua passagem pelo trato gastrintestinal e liberam os parasitos que irão invadir os enterócitos. Nesse momento, ocorrerá a diferenciação dos taquizoítos, que passarão a se multiplicar de forma rápida, por endodiogenia. Estes taquizoítos podem invadir qualquer célula nucleada, havendo uma preferência por células do sistema fagocítico mononuclear e, com a invasão dessas células, o parasito consegue se disseminar para vários tecidos do organismo hospedeiro, como retina, placenta, fibra muscular e cérebro (GUBBELS; WHITE; SZATANEK, 2008; COHEN; DENKERS, 2014; HARKER; UENO; LODOEN, 2015; SEVERANCE et al., 2016). Com a disseminação parasitária pelos tecidos e, subsequentemente, a ativação da resposta imune protetora, há mudança da forma de taquizoíto para bradizoíto, de multiplicação intra-vacuolar lenta, originando os cistos teciduais (LYONS; MCLEOD; ROBERTS, 2002).
Figura 02: Ciclo biológico do Toxoplasma gondii. O ciclo pode ser dividido em três momentos: no hospedeiro definitivo (rosa) que culmina na produção de oocistos que serão liberados nas fezes do felino infectado; no ambiente (verde), onde ocorre esporogonia e maturação dos oocistos, tornando-se infectantes; no hospedeiro intermediário (azul), com diferenciação de taquizoítos, na fase aguda, e cistos com bradizoítos durante a infecção crônica. Imagem adaptada de ROBERT-GANGEUX; DARDÉ, 2012.
1.2. Interação parasito-hospedeiro
Para o sucesso da invasão, os parasitos desse grupo compartilham meios de locomoção dependente de substrato, conhecido como “gliding”, que se baseia em um intricado sistema motor entre a membrana plasmática do parasito e um complexo de membranas internas (IMC – do inglês inner membrane complex). Após o percurso pelo substrato e detecção da célula-alvo, há o ancoramento do parasito à superfície da célula e, para sua efetivação, é imprescindível a presença de moléculas, expressas na superfície, tanto do parasito quanto da célula hospedeira que atuarão em seu ancoramento, favorecendo assim, o processo de invasão (CARRUTHERS;
BOOTHROYD, 2007)(CARRUTHERS, 2002; SIBLEY; HÅKANSSON;
CARRUTHERS, 2004; CARRUTHERS; BOOTHROYD, 2007).
O processo de invasão da célula hospedeira (Figura 03) é composto por etapas distintas, sendo essencial a atuação das moléculas de superfície e organelas secretoras de proteínas, presentes na região apical do parasito, para a efetivação da invasão celular. As formas infectantes do T. gondii apresentam organelas citoplasmáticas que constituem o complexo apical, consistindo em roptrias, micronemas e grânulos densos (GRIMWOOD; SMITH, 1995, 1996; CARRUTHERS, 2002; SIBLEY; HÅKANSSON; CARRUTHERS, 2004). Os micronemas e as roptrias são os principais responsáveis pela secreção de proteínas que contribuirão para a invasão da célula-alvo e formação do vacúolo parasitóforo (VP) (SMITH, 1995; DOWSE; SOLDATI, 2004; SOLDATI; FOTH; COWMAN, 2004; SOLDATI; MEISSNER, 2004 SHARMA; CHITNIS, 2013).
Durante o contato inicial com a célula hospedeira, na membrana do parasito há a presença de antígenos de superfícies ancorados em GPI (SAG) que participam do reconhecimento da célula-alvo. As SAG são capazes de reconhecer receptores de superfície da célula e dar início ao ancoramento do parasito. Em seguida, ocorre à liberação do conteúdo proteico produzido pelos micronemas, as proteínas micronemais (MIC) e proteínas AMA1 (antígeno apical de membrana-1). As proteínas MIC estão envolvidas na ligação e penetração na célula-alvo, através do reconhecimento de vários componentes da matriz extracelular e da superfície da célula hospedeira, como proteoglicanos sulfatados (DUBREMETZ et al., 1998;
CARRUTHERS, 2002; DOWSE; SOLDATI, 2004; SOLDATI; FOTH; COWMAN, 2004; WALKER et al., 2013; BLADER et al., 2015).
Essas proteínas produzidas pelo parasito atuam de forma ativa na formação de um complexo motor, responsável por efetivar a invasão na célula hospedeira. Proteínas produzidas e liberadas pelas roptrias (RON – do inglês Rhoptry neck) interagem com AMA1 formando o complexo estável da junção motora (MJ – do inglês Moving Junction). A junção motora, que desempenha papel fundamental na invasão celular, é uma abertura na célula hospedeira através da qual o parasito interage e desliza antes de se estabelecer em um vacúolo parasitóforo (VP) recém-formado. Dois grupos de proteínas formam o complexo associado com a junção motora, a proteína micronemal AMA1 e as proteínas RON2, RON4 e RON5. Assim, o parasito empurra esse complexo em direção ao interior da célula, atravessando e induzindo um rearranjo das moléculas componentes do citoesqueleto e originando uma invaginação na membrana plasmática, formadora do VP. Enquanto isso, os grânulos densos secretam proteínas no interior do VP, modificando-o para a captura de nutrientes vindos da célula hospedeira (SMITH, 1995; CARRUTHERS, 2002; CARRUTHERS; BOOTHROYD, 2007; WALKER et al., 2013). As etapas finais da invasão se resumem ao fechamento e separação do VP da membrana plasmática da célula hospedeira (CARRUTHERS; BOOTHROYD, 2007).
Uma vez finalizado o processo de invasão celular, o parasito começa a se multiplicar por endodiogenia até o rompimento da célula hospedeira, liberando novos taquizoítos que irão reiniciar esse processo, circular pelos vasos sanguíneos e linfáticos até alcançar outros órgãos como placenta, cérebro e retina (JACOT; DAHER; SOLDATI-FAVRE, 2013; HARKER; UENO; LODOEN, 2015).
1.3. Resposta imune à infecção pelo Toxoplasma gondii
O T. gondii possui moléculas de superfície, como proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol (GPIs) e TgPRF (proteínas tipo profilina), que são reconhecidas Figura 03: Mecanismo de invasão celular pelo Toxoplasma gondii. 1: o contato inicial se dá pelo reconhecimento de receptores na superfície da célula hospedeira pelas moléculas SAG do parasito; 2 – 4: após reconhecimento, há formação da junção motora através da liberação das proteínas RON pelas roptrias, as quais se associam às moléculas AMA1 liberadas pelos micronemas. Essa interação forma uma região de ligação entre o parasito e a célula hospedeira. Em seguida, proteínas ROP são liberadas pelas roptrias e atuam na organização do vacúolo parasitóforo e outras permanecem em sua forma solúvel pelo citoplasma da célula; 5: o parasito inicia o processo de invasão, empurrando a região de interação AMA1-RON, criando uma invaginação na membrana e criando o vacúolo parasitóforo; 6 – 7: as etapas finais da invasão celular, fechamento e separação, ocorrem através da fissão da membrana do vacúolo parasitóforo com a membrana da célula (CARRUTHERS; BOOTHROYD, 2007). SAG: Antígeno de superfície; MIC: proteínas micronemais; AMA1: antígeno apical de membrana-1; RON, ROM, ROP: proteínas das roptrias.
por receptores de reconhecimento padrão (RRP) na superfície de células fagocitárias (Figura 04), como macrófagos e células dendríticas. A ativação dos receptores TLR2 e TLR4 em macrófagos, a partir do reconhecimento de antígenos do parasito, leva à produção de citocinas como IL-12 e TNF-α através de vias dependentes de MyD88 e NF-κB (Figura 04a) (POLLARD; KNOLL; MORDUE, 2009; PIFER; YAROVINSKY, 2011; YAROVINSKY, 2014). Além da via dependente de TLR, o T. gondii consegue ativar células dendríticas e macrófagos via CCR5. Esse mecanismo é possível graças a produção e liberação, pelo parasito, da Ciclofilina-18 (Figura 04b). Essa proteína é capaz de se ligar ao receptor de quimiocinas e de induzir a produção de IL-12 de maneira independente de MyD88 e NF-κB (DENKERS, 2003).
A ação da IL-12 é essencial para a diferenciação das células T CD4+ em sua subpopulação Th1 sendo, juntamente às células NK ativadas, responsáveis pela produção de IFN-γ. A sinergia entre IFN-γ, IL-12 e TNF-α leva à ativação de mais células fagocíticas resultando na produção de altos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERN), estando associada ao controle da replicação parasitária. Porém, quando há uma produção excessiva desses mediadores inflamatórios, podem-se gerar quadros de mudanças imunopatológicas induzidas pelo parasito durante a infecção, levando ao comprometimento do organismo hospedeiro (ALIBERTI; SERHAN; SHER, 2002; KASPER et al., 2004; COELHO-CASTELO et al., 2009; POLLARD; KNOLL; MORDUE, 2009; STURGE; YAROVINSKY, 2014).
Figura 04: Via de ativação e produção de IL-12 e TNF-α após reconhecimento dos antígenos parasitários. A: produção de IL-12 e TNF-α pela ativação de TLR, via MyD88 e NF-κB em células fagocitárias e leucócitos. B: ativação de células dendríticas e produção de IL-12 via ativação de CCR5. TLR: Receptores tipo Toll; MyD88: proteína de diferenciação primaria mielóide 88; NF-κB: fator nuclear κB; IL: interleucina. Imagens adaptada de Denkers, 2003.
Buscando compensar e controlar a resposta inflamatória modulada pelo parasito, o sistema imune é capaz de estabelecer um equilíbrio imunológico (Figura 05) através da expressão de citocinas antagonistas às do perfil Th1. O fator de transformação do crescimento beta (TGF-β – do inglês Transforming Growth Factor β) e a IL-10 são exemplos de duas citocinas importantes para a regulação da resposta inflamatória.
O TGF-β consegue atuar regulando a resposta imune por estimular a diferenciação de células T reguladoras (Treg) e por interferir na proliferação e diferenciação das subpopulações Th1 e Th2. Essa citocina influencia a diferenciação de células Th1 através da inibição da expressão de STAT4, fator de transcrição ativado por IL-12, e, consequentemente, compromete a ativação de T-bet. Essa interferência desestabiliza a polarização Th1 e inibe a produção de IFN-γ necessária para manutenção de uma resposta pró-inflamatória adequada. Outra via de ação imunomoduladora do TGF-β é o silenciamento de GATA3 através da expressão do fator de transcrição Sox4, inibindo a diferenciação de células Th2. Esse controle sobre a ativação de células Th1 e Th2 permite a manutenção da homeostase e reparo tecidual frente à quadros inflamatórios em resposta a presença do patógeno invasor (JOHNSTON; ALEMI; HARUM, 2003; SANJABI; OH; LI, 2017).
A IL-10, conhecida por seu papel no controle de respostas inflamatórias, pode ser produzida por vários tipos celulares, incluindo macrófagos, células dendríticas, células Treg, Th2 e até mesmo por células do perfil Th1. A ação da IL-10 tem sido mostrada por sua capacidade em regular e limitar a expressão de citocinas pró- e anti-inflamatórias (como IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-4, IL-5). Dessa forma, conseguindo manter uma relação íntima entre sua produção e o desenvolvimento das respostas Th1/Th2, além de influenciar o estabelecimento do controle parasitário e da imunopatologia desenvolvida (ANDERSON et al., 2007; COUPER; BLOUNT; RILEY, 2008; MITCHELL et al., 2017).
Apesar da ação ativa do sistema imune em combater e controlar a infecção parasitária, sem comprometer a integridade tecidual, o Toxoplasma desenvolveu mecanismos que o tornam capaz de modular a resposta imune, afim de estabelecer uma infecção persistente e eficiente. Essa modulação imune é influenciada pela liberação de moléculas como os antígenos excretórios/secretórios (TgESAs – do inglês Excretory/secretory antigens) e proteínas produzidas pelas roptrias (ROP18, ROP16) e grânulos densos (GRA15, GRA6, GRA4) (MELO; JENSEN; SAEIJ, 2011).
A liberação de TgESAs é capaz de interferir na produção de citocinas pró- e anti-inflamatórias, reduzindo a produção de TNF-α e IL-1β e, em contrapartida, estimulando a produção de IL-10 (WANG et al., 2017a). No caso da liberação de proteínas do tipo ROP e GRA, o seu padrão de expressão varia de acordo com a cepa do parasito e, consequentemente, atua em padrões de modulação imune distintos. Para exemplificar, sabe-se que cepas de T. gondii classificadas como Tipo I, de alta virulência, expressam GRA15 em uma forma não funcional, impedindo a ativação de NF-κB e estimulando o desenvolvimento de uma infecção “silenciosa” com replicação parasitária descontrolada. Por outro lado, cepas do tipo II, de virulência intermediária, expressam GRA15 em sua forma ativa, capaz de atuar na ativação e translocação de NF-κB para o núcleo e desencadeando a transcrição de genes responsáveis pelo desenvolvimento de uma resposta pró-inflamatória eficiente, tornando possível sua conversão à forma de bradizoíto e formação de cistos teciduais. Essa diferença na expressão de proteínas e na ativação da resposta imune pelo T. gondii influencia sua capacidade de se propagar pelo organismo e de estabelecer uma infecção bem-sucedida, sem matar seu hospedeiro (MELO; JENSEN; SAEIJ, 2011).
Figura 05: Desenvolvimento da resposta pró-inflamatória e reguladora em resposta à infecção por Toxoplasma gondii. NK: células Natural Killer; Treg: células T reguladoras; APC: células apresentadoras de antígeno; Th0: células T CD4+ naïve; Th1: células T CD4+ da subpopulação Th1; MΦ: macrófagos. Setas pretas: estímulo da resposta inflamatória; linhas vermelhas: atividade imunorreguladora, inibindo ação pró-inflamatória.
É importante ressaltar que durante o estabelecimento da infecção, o T. gondii interfere de modo transiente com a expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC – do inglês Major Histocompatibility Complex) em macrófagos (LÜDER et al., 1998), em particular, com a expressão de MHC de classe II induzida por IFN-γ. Estudos mostram que o T. gondii bloqueia os níveis de mRNA induzidos por IFN-γ via CIITA (transativador de classe II) e, em menor extensão, o IRF-1 (fator de regulação do interferon-1), evitando assim a expressão gênica do MHC de classe II (LÜDER et al., 2001). Tal interferência pode assim diminuir a expansão dos linfócitos T CD4 + e suas funções efetoras durante o curso da toxoplasmose, sendo um dos interessantes mecanismos de escape do parasito.
Além da capacidade de modulação imunológica do parasito mencionada acima, outros mecanismos de evasão da resposta imune vêm sendo descritos, havendo estudos que mostram a influência da infecção na motilidade de células NK e CDs, levando a um padrão de hipermotilidade celular capaz de favorecer a migração do parasito através dos tecidos (HARKER; UENO; LODOEN, 2015; KANATANI et al., 2017). Adicionalmente ao aumento da motilidade das células infectadas, para garantir sua disseminação e capacidade de atravessar barreiras biológicas, o parasito consegue interferir na expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs), que são proteases capazes de degradar componentes da matriz extracelular (GEURTS; OPDENAKKER; VAN DEN STEEN, 2012). Havendo indícios do envolvimento da infecção com o aumento nos níveis de expressão das MMP-2, -8, -9, -10 e -12 e com o aumento na liberação de componentes da matriz extracelular, como elastina e fibronectina (CLARK et al., 2010; CHOU; LAI, 2011; WANG; LAI, 2013).
Estudos buscam esclarecer as vias de sinalização que culminam no estímulo da expressão das MMPs, com dados evidenciando o envolvimento de citocinas, como IL-23, no aumento da expressão de MMP-2 e, consequentemente, no desenvolvimento da imunopatologia intestinal logo após a infecção e o envolvimento da ativação de NF-kB, através da via de fosforilação de ERK1/2 (quinase regulada por sinal extracelular) induzida pelo T. gondii, na regulação da expressão das MMP2 e -9 (WANG; LU; LAI, 2013).
É possível que esse conjunto de alterações no nível de metaloproteinases possa ajudar o parasito a se disseminar mais eficientemente pelos tecidos do organismo hospedeiro e, ao mesmo tempo, contribuir para o comprometimento da
membrana basal, estimulando o recrutamento leucocitário que, atuando em conjunto, contribui para o dano tecidual e estabelecimento da imunopatologia local.
Tomando-se como base essas evidências, é notável a capacidade de manipulação do Toxoplasma sobre seu hospedeiro, a nível celular, de forma a tornar-se capaz de colonizar e garantir sua sobrevivência com o detornar-senvolvimento de uma infecção latente e duradoura em vários tecidos do organismo parasitado.
1.4. Neurotoxoplasmose
A chegada do Toxoplasma gondii no sistema nervoso central pode ser explicado por três mecanismos possíveis (Figura 06). No primeiro, parasitos circulando no ambiente extracelular conseguem atravessar barreiras biológicas através da passagem paracelular (Figura 06A), sendo um mecanismo mediado pela interação entre proteínas produzidas pelo parasito (MIC2) e receptores de superfície celular presentes no endotélio (ICAM-1) (BARRAGAN; BROSSIER; SIBLEY, 2005). O segundo mecanismo, a migração transcelular (Figura 06B), baseia-se na capacidade invasiva do parasito, sugerindo a travessia da barreira endotelial a partir da infecção de suas células. O último mecanismo sugerido, e mais discutido, é a capacidade do parasito atingir regiões consideradas imunoprivilegiadas através da invasão de células migratórias, como macrófagos, células dendríticas e leucócitos. Conhecida como Teoria do Cavalo de Tróia (Figura 06C), o T. gondii consegue interferir no perfil migratório dessas células, acompanhado do estímulo na expressão de receptores de superfície endotelial, sendo capaz de se propagar pelo organismo hospedeiro (BARRAGAN; BROSSIER; SIBLEY, 2005; LAMBERT; BARRAGAN, 2010; COURRET et al., 2016).
O desenvolvimento da neurotoxoplasmose representa a principal manifestação da infecção entre pacientes imunocomprometidos, estando presente em até 75% dos casos de pacientes com HIV/AIDS. A manifestação clínica varia de acordo com a localização e o número de lesões produzidas pelo parasito no cérebro, podendo se manifestar por dores de cabeça, febre, convulsões, confusão mental e comprometimento da função motora dos membros, sendo resultado de uma reativação da infecção aguda (MORISSET et al., 2008; DE OLIVEIRA et al., 2016; WANG et al., 2017b). Em quadros da infecção latente, em pacientes HIV+ que fazem uso da terapia antirretroviral, sinais de comprometimento cognitivo têm sido relacionados com a persistência da infecção e com o aumento no número de células T CD4+, levantando o questionamento sobre a influência da infecção crônica e neuroinflamação desenvolvida sobre as características cognitivas do paciente (BHARTI et al., 2016).
Figura 06: Possíveis mecanismos utilizados pelo Toxoplasma gondii para travessia de barreiras biológicas e invasão de sítios considerados imunoprivilegiados. A: invasão paracelular; B: invasão transcelular; C: invasão através de células infectadas.
A influência da toxoplasmose sobre o comportamento e capacidade cognitiva do hospedeiro infectado tem sido alvo de discussão nos últimos anos, com estudos sugerindo que a infecção crônica também consegue ter efeitos neuropatológicos em pacientes imunocompetentes. Isso se deve à presença dos cistos teciduais no cérebro e a manutenção de uma inflamação crônica, aumentando os riscos de modificações neurológicas (PARLOG et al., 2014; PARLOG; SCHLÜTER; DUNAY, 2015). Essa interferência cerebral, com consequências comportamentais, é sustentada pelos resultados obtidos por Berdoy e colaboradores (2000) que após analisarem o comportamento de ratos infectados pelo T. gondii, observaram que estes passaram a se tornar atraídos pelo odor do gato, seu predador natural. Essa alteração comportamental poderia ser justificada pela hipótese da manipulação, onde há o favorecimento da transmissão do parasito, presente no roedor, ao seu hospedeiro definitivo, o gato (FLEGR, 2013; FLEGR; KUBA, 2016).
A localização do cisto tem importância crucial em como o parasito afeta o seu hospedeiro. Foi demonstrado que a distribuição de cistos pelo cérebro é bastante variável, sendo encontrados em neurônios nas regiões do córtex, hipocampo, hipotálamo, amígdala e cerebelo (MELZER et al., 2010). Em concordância com esses dados, Gonzalez e colaboradores (2007) mostraram que a presença de cistos nas áreas límbicas do cérebro de ratos infectados estava relacionada com menores taxas de ansiedade e, em outro estudo, foi apresentado que um maior número de cistos na amigdala em camundongos estava relacionado com a perda da aversão à felinos (GIACOMINI et al., 2007).
Em humanos, o estabelecimento de uma relação entre a ocorrência da infecção por T. gondii e distúrbios neurológicos e psiquiátricos tem levantado muita discussão ao longo dos anos, com pesquisas abordando a relação entre a infecção e o estabelecimento de esquizofrenia, bipolaridade, agressão, impulsividade e depressão (COOK et al., 2015; STICH et al., 2015; ELSHEIKHA; ZHU, 2016; FLEGR; KUBA, 2016; MAHMOUD et al., 2016; DE BARROS et al., 2017).
A capacidade do Toxoplasma em manipular o comportamento do seu hospedeiro pode ser explicada a partir da interferência no funcionamento celular, uma vez que o parasito se mostra capaz de influenciar vias de metabolismo e produção de neurotransmissores (PRANDOVSZKY et al., 2011; GATKOWSKA et al., 2013). Foi demonstrado que a infecção consegue interferir na expressão de GAD67 (Glutamato Descarboxilase 67), enzima envolvida na síntese de GABA. Essa interferência
modifica a localização de GAD67 comprometendo a síntese do neurotransmissor e, consequentemente, diminuindo a sinalização GABAérgica e correlacionando-se com o aumento na ocorrência de convulsões em camundongos infectados (BROOKS et al., 2015).
Além de influenciar no metabolismo de neurotransmissores, a capacidade da infecção em estimular uma resposta neuroinflamatória local está associada tanto ao momento de chegada do parasito ao parênquima cerebral e consequente ativação da micróglia, quanto ao recrutamento de células imunes ativadas durante a inflamação sistêmica e sua produção de mediadores inflamatórios, desencadeados no início da infecção. Essa inflamação possui papel essencial no controle da replicação parasitária, porém, também é capaz de comprometer o tecido cerebral, através do comprometimento neuronal durante um quadro neurodegenerativo (PARLOG; SCHLÜTER; DUNAY, 2015; SA et al., 2015; ELSHEIKHA; ZHU, 2016). Neste cenário, a infecção se mostra capaz de influenciar a desestabilização da fisiologia sináptica e morfologia neuronal, através de modificações na expressão de proteínas presentes nos compartimentos pré e pós-sinápticos, além de comprometer a estrutura neuronal através da redução da complexidade dendrítica e estimular modificações na organização e morfologia das espinhas dendríticas em neurônios infectados (PARLOG et al., 2014). Toda essa alteração propiciada pelo parasito poderá induzir alterações distintas na composição sináptica, interferindo na regulação de um grande número de proteínas envolvidas na plasticidade sináptica, aprendizagem e risco de transtornos neuropsiquiátricos.
1.5. Sistema Nervoso Central e Redes Perineuronais
O Sistema Nervoso Central (SNC) é composto por uma vasta gama celular que inclui os neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Essas células possuem funções específicas que permitem a organização e o funcionamento ideal do tecido cerebral, auxiliando na transmissão e estabilização sináptica, na liberação e reciclagem de neurotransmissores e no fornecimento de metabólitos essenciais para a sobrevivência celular (ULLIAN et al., 2001; FIELDS, 2002; DOETSCH, 2003; KREFT et al., 2012; ZEISEL et al., 2015). Essas interações contribuem para o estabelecimento da homeostase cerebral, cuja manutenção se mostra dependente do equilíbrio entre
a ativação de células como micróglia e astrócitos. Entre esses tipos celulares, a micróglia quando ativada é responsável pela liberação de citocinas que possuem papel fundamental no controle da resposta neuroinflamatória, neuroproteção tecidual e manutenção da integridade da barreira hematoencefálica, proporcionando um ambiente adequado para o funcionamento cerebral ideal (FARINA; ALOISI; MEINL, 2007; WEISS et al., 2009; RON-HAREL; CARDON; SCHWARTZ, 2011; MICHELL-ROBINSON et al., 2015; BARRAGAN et al., 2015; KABBA et al., 2018).
Toda a organização e interação celular observada no SNC é influenciada pela presença de uma matriz extracelular complexa, se apresentando de forma especializada, ao redor de neurônios específicos e formando estruturas conhecidas como redes perineuronais (RPN) (Figura 07), conforme descritas em 1893 por Camillo Golgi (CELIO; BLUMCKE, 1994). As RPN são formadas, principalmente, por moléculas de proteoglicanos de condroitin sulfato (PGCS), ácido hialurônico (HA) e outras glicoproteínas. Entre todos os constituintes protéicos das RPN, os PGCS desempenham papel essencial na manutenção da estrutura citoarquitetônica cerebral (SHERMAN; BACK, 2008).
Figura 07: Representação esquemática da estrutura das redes perineuronais. Essas estruturas são formadas principalmente por proteoglicanos de condroitin sulfato, ácido hialurônico e outras glicoproteínas, ancoradas na membrana no neurônio. Imagem: QING-LONG et al., 2014.
O condroitin sulfato faz parte da família dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs), sendo heteropolissacarídeos lineares e formados por unidades dissacarídicas repetidas consistindo em um açúcar aminado (N-acetilgalactosamina - GalNAc) e um açúcar não aminado (Ácido glicurônico - GlcA), capazes de formar proteoglicanos a partir de ligações do tipo β1-3 e/ou β1-4 entre resíduos de galactose (Galβ1-3Gal) e xilose (Galβ1-4Xyl) ligados, através de ligações O-glicosídicas, à porção de serina (Galβ1-3Galβ1-4Xyl-β1-O-Ser) do core proteico (Figura 08) (PERLIN, MACKIE, 1971; VOLPI, 2005; GHANDI, MANCERA, 2008; MIKAMI; KITAGAWA, 2013).
Na estrutura dos proteoglicanos, as moléculas de GlcA e GalNAc podem sofrer ação de enzimas do tipo sulfotransferases, capazes de adicionar sulfatação em regiões específicas, como a adição de sulfato no carbono 4 e 6 dos resíduos de GalNAc, formando as regiões sulfatadas A e C, respectivamente, do Condroitin Sulfato (KWOK et al., 2012; MIKAMI; KITAGAWA, 2013). Com base nesse padrão de sulfatação, discute-se a capacidade de interação entre os PGCS e outras moléculas constituintes da matriz extracelular, seu envolvimento na interação célula-célula e célula-patógeno.
Os PGCS associados nas RPN pertencem à família das lecticanas, havendo a presença de agrecan (ACAN), neurocan (NCAN), brevican (BCAN) e versican (VCAN), sendo capazes de interagir com cadeias de HA (Figura 09) na superfície celular e têm essa interação estabilizada por proteínas de ligação (CARULLI et al., 2006; POZZI; YURCHENCO; IOZZO, 2017).
As RPN são organizadas e encontradas ao redor de regiões sinápticas de neurônios presentes em áreas como córtex, núcleo cerebelar profundo, hipocampo e Figura 08: Representação esquemática da estrutura molecular dos proteoglicanos de condroitin sulfato. Essas moléculas são formadas por unidades repetidas de dissacarídeos sulfatados, ligados a um core proteico. Imagem adaptada de SHERMAN; BACK, 2007.
Figura 09: Representação esquemática da estrutura molecular dos PGCS da família das lecticanas, presentes nas redes perineuronais. A proporção das cadeias de condroitin sulfato varia de acordo com a célula onde está sendo produzida e a região cerebral. Imagem adaptada de SHERMAN; BACK, 2007. 7. Co re P ro te ico
medula espinhal. Em áreas corticais primárias, como córtex somestésico, auditivo e visual, existe um padrão de distribuição de RPN que, durante o desenvolvimento pós-natal, acumulam-se ao redor de neurônios excitatórios e interneurônios inibitórios (NAKAMURA et al., 2009; UENO et al., 2018).
A região que compreende o córtex somestésico primário (S1) (Figura 10) é responsável, principalmente, pelo processamento de informações sensoriais e seu desenvolvimento é regulado por um balanço entre fatores genéticos e atividade neuronal. Em modelos murinos, o funcionamento do S1 é conectado às vibrissas no focinho do roedor, formando um mapa de “barris” (S1BF). Essa região tem uma estrutura laminar, organizada em 6 camadas distintas (de I a VI), apresentando neurônios excitatórios (glutamatérgicos) e interneurônios inibitórios (GABAérgicos) (PETERSEN, 2007; SCHUBERT et al., 2007; QI; FELDMEYER, 2016).
Na camada IV do S1BF existe elevada densidade de redes perineuronais, principalmente ao redor dos neurônios piramidais excitatórios e interneurônios inibitórios, apontando para a influência dessas estruturas sobre o equilíbrio entre excitação e inibição neuronal (QING-LONG; QIAN; XIAO-HUI, 2014).
A síntese das RPN atinge níveis máximos durante o período de desenvolvimento cerebral, tornando-se negativamente regulados na fase adulta Figura 10: Representação esquemática da localização da camada IV e organização do campo de barril do córtex somestésico primário. Imagens adaptadas de SCHUBERT et al., 2007; PETERSEN, 2007.
(CARULLI et al., 2006; WANG; FAWCETT, 2012). Havendo uma relação inversamente proporcional entre a consolidação das redes e o nível de plasticidade neuronal, essas estruturas conseguem atuar como barreiras físicas à formação de novas sinapses e, também, capazes de fornecer suporte para moléculas que restringem modificações sinápticas (SHERMAN; BACK, 2008; QING-LONG; QIAN; XIAO-HUI, 2014). Além do papel na regulação da plasticidade neuronal, as RPN mostraram-se capazes de atuar restringindo a mobilidade de receptores AMPA; neuroproteção em quadros de estresse oxidativo e na manutenção do armazenamento da memória de medo e visual (RHODES; FAWCETT, 2004; McRAE et al., 2007; HYLIN et al., 2013; SORG et al., 2016; THOMPSON et al., 2017).
Demonstrou-se, através de modelos murinos de estudo de memória, que a presença de RPN em torno de neurônios na região da amígdala pode contribuir para a proteção da memória do medo em camundongos adultos. Por outro lado, a depleção de PGCS presentes nessas redes leva à perda dessas memórias (GOGOLLA et al., 2009) e também se relaciona com o aumento da mobilidade e surgimento de protrusões na região apical das espinhas dendríticas, estando envolvida com a dinâmica de modelamento das estruturas neuronais (LEVY; OMAR; KOLESKE, 2014; SENKOV et al, 2014). Outros estudos mostraram que a remoção das RPN em interneurônios aumentou o nível de excitabilidade neuronal e que alterações na composição dessas estruturas podem estar ligadas ao desenvolvimento de doenças no SNC, como Alzheimer, Esquizofrenia, Epilepsia e Esclerose Múltipla ( DITYATEV et al., 2007; PANTAZOPOULOS et al., 2015; DE LUCA; PAPA, 2016).
Vários fatores podem influenciar a estrutura das RPN, estando suscetíveis às modificações geradas por MMPs em consequência de trauma e/ou inflamação. Pode-se supor que o dePode-senvolvimento dessas redes e sua suscetibilidade à degeneração através de mecanismos inflamatórios desencadeados por inúmeros fatores podem contribuir para o comprometimento sináptico e plasticidade presente no SNC (GOGOLLA et al., 2009; WANG, FAWCETT, 2012; PARLOG; SCHLÜTER; DUNAY, 2015; KUMAR et al., 2016). Neste contexto, muitas doenças classificadas como neurodegenerativas apresentam quadros de comprometimento do tecido cerebral, como resultado de uma resposta inflamatória exacerbada e, dessa forma, pode-se especular sobre sua participação nos mecanismos de quebra das redes perineuronais e comprometimento da estrutura citoarquitetônica cerebral.
Em quadros de trauma cerebral, a ativação da micróglia para seu perfil M1 (pró-inflamatório) está diretamente envolvida com o estresse oxidativo desencadeado, principalmente pelo estímulo na expressão do complexo enzimático NOX2, responsável pela produção de espécies reativas de oxigênio, correlacionando-se com comprometimento de células neuronais e neurodegeneração, juntamente com o comprometimento de função motora em quadros pós-TBI (Traumatic Brain Injury) (KUMAR et al., 2016). Além do estresse oxidativo desenvolvido, pacientes com quadros de trauma cerebral grave apresentaram variações nos níveis de quimiocinas e citocinas, tanto de perfil Th1 quanto Th2, estando relacionado com um pior prognóstico e fortalecendo a relação entre o desenvolvimento da inflamação e o comprometimento cerebral (DI BATTISTA et al., 2016). Além do envolvimento dos perfis Th1 e Th2, foi demonstrado a importância da resposta Th17 no comprometimento da integridade cerebral, em quadros de Esclerose Múltipla, onde a produção de IL-17 e expressão dos receptores para IL-22 mostraram-se envolvidas no processo neuroinflamatório e aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica (KEBIR et al., 2007).
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliação dos efeitos da infecção experimental por Toxoplasma gondii na estrutura do tecido cerebral e sua interferência na resposta neuroimunopatogênica em modelo murino de resistência e suscetibilidade.
2.2. Objetivos específicos
Determinar o grau de suscetibilidade e resistência dos camundongos C57BL/6 e Balb/c frente à infecção por T. gondii.
Avaliar os efeitos da infecção sobre a resposta inflamatória em camundongos resistentes e suscetíveis.
Verificar se há diferença no parasitismo de diferentes regiões do cérebro em camundongos suscetíveis e resistentes.
