DISCUSSÃO GERAL

O petróleo é uma das substâncias mais utilizadas na sociedade moderna. Ele não é só matéria prima de plásticos e outros produtos, mas também é combustível para a produção de energia, para a indústria, aquecimento e transporte. Os combustíveis derivados do petróleo fornecem mais da metade da energia consumida no planeta. A gasolina, querosene e óleo diesel são combustíveis para automóveis, caminhões, tratores, navios e aviões. O óleo combustível e o gás natural são usados para aquecimento de residências e prédios comerciais, bem como em gerador de eletricidade. Ainda, os produtos derivados do petróleo são materiais utilizados em fibras sintéticas para roupa e plástico, tintas, fertilizantes, inseticidas, sabões e borracha sintética. Portanto, o petróleo é fonte de matéria prima em uma infinidade de produtos da indústria moderna (Speight, 2014).

Devido à crescente demanda de utilização do petróleo, é inevitável a ocorrêcia de problemas inerentes à exploração e contaminação ambiental, tornando premente o desenvolvimento de pesquisas que permitam a viabilização de processos economica e ambientalmente sustentáveis. Atualmente, uma alternativa que tem se destacado, é a utilização dos surfactantes biológicos, ou biorssurfactantes, para aplicação em tecnologias como Microbial Ehnhanded Oil Recovery (MEOR) ou mesmo na biorremediação. Os biossurfactantes tem oferecido a possibilidade de subtituição dos surfactantes químicos, que são produzidos por fontes não renováveis.

O uso dos surfactantes tem crescido muito ao longo das últimas décadas, entretanto, é difícil determinar números exatos de produção em um mercado tão variado. No entanto, foi estimado que 8,8 kilotoneladas foram utilizadas em 1995 e esse número subiu para 13 kilotoneladas em 2008 (Marchant & Banat, 2012). Uma estimativa mostra que para a produção de 1 tonelada de surfactante químico são emitidas 4,27 toneladas de CO2 na atmostera (Petel et al. 1999). De acordo com a Agência de Proteção

Ambiental dos Estados Unidos, a combustão de um galão de gasolina produz aproximadamente 8,8 kg de CO2, sendo assim, a estimativa anual do uso de surfactantes químicos é equivalente à combustão de

3,6 bilhões de galões de gasolina. Se a produção de todo o surfactante químico fosse substituída pela produção de surfactante a partir de óleo vegetal, a emissão de CO2 cairia 37% (Patel, 2004). Entretanto,

152 destrua a vegetação nativa, uma vez que esta é essencial no ciclo do CO2 e manutenção da

biodiversidade (Danielson et al. 2009; Fitzherbert et al. 2008).

Frente ao cenário mundial de proteção ambiental e desenvolvimento sustentável, há uma grande necessidade de se recorrer a fontes alternativas para produção de surfactantes, e uma das possibilidades é a utilização de micro-organismos. Estes, por sua vez, tem a capacidade de produzir biossurfactante a partir de fonte renovável, produção independente de condições climáticas, possibilidade de utilização de matérias-primas regionais, maior rapidez na obtenção do produto acabado e produção em espaço relativamente pequeno (Parikhi & Madamwar, 2006). Entretanto, ainda existem algumas limitações na utilização dos biossurfactantes, uma vez que o baixo rendimento e o alto custo de produção inviabilizam o processo, sendo difícil a competição com os surfactantes de origem química (Marchant & Banat, 2012). Neste sentido, o processo do crescimento do micro-organismo é a chave para a redução do custo de produção, o qual pode empregar diferentes bactérias e substratos.

Neste trabalho, um dos objetivos foi otimizar a produção de biossurfactante para melhorar o rendimento e diminuir o custo de produção em escala laboratorial. A metodologia de planejamento Plackett - Burman (P&B) foi eficiente como método de triagem das melhores fontes de carbono e nitrogênio para a produção de biossurfactantes pelas linhagens estudadas, B. safensis CCMA-560 e Gordonia sp. CCMA-559, com redução da tensão superficial para 29,5 mN/m e 37,2 mN/m, respectivamente. A Gordonia sp. CCMA-557 aumentou ainda a capacidade emulsificante de 35% para 53%. Resultados similares aos observados nesse trabalho foram obtidos por Joshi e colaboradores (2008) quando estudaram a linhagem B. subtilis 20B. Com a utilização do planejamento experimental para a otimização da produção de biossurfactantes, essa linhagem passou a reduzir a tensão superficial para 29,2 mN/m. Outros estudos também foram realizados com espécies de Bacillus e todos demonstraram resultados bem sucedidos com a utilização de metodologias de planejamento experimental (Liu et al. 2012; Abdel-Mawgoud et al. 2008). Entretanto, em todos os estudos foi observado que a fonte de carbono que mais influencia positivamente a produção do biossurfactante é a glicose. No presente trabalho observamos que a glicose é um fator que interfere negativamente na produção, sendo o óleo de soja a melhor fonte de carbono a ser trabalhada. Sendo assim, como perspectiva futura para melhorar o custo de produção, um novo planejamento experimental para otimização poderá ser realizado com óleo residual de fritura, estratégia que já vem sendo utilizada por Halim et al. (2009). A utilização de resíduos industriais de baixo-custo como substrato para o crescimento dos micro-organismos é uma alternativa para reduzir significativamente o custo de

153 produção (Pacwa-Plociniczak et al. 2011). O principal desafio na utilização de resíduos é a obtenção do substrato com o equilíbrio apropriado para suportar o crescimento celular, bem como o rendimento adequado e consistente do produto final (Nitschke & Pastore, 2006). Fontes de nitrogênio também foram avaliadas neste trabalho, além de papel fundamental no crescimento celular, estas também se mostraram importantes na produção de biossurfactante pela linhagem B. safensis CCMA-560. É sugerido que a importância de fontes de nitrogênio na produção do biossurfactante por Bacillus spp. é devida à composição da molécula de lipopeptídios.

No planejamento experimental da linhagem de Gordonia sp. CCMA-559 foram obtidos bons resultados com relação à otimização das condições de crescimento para a produção de CASs. Além de obter as condições ideais de crescimento desse micro-organismo para a produção de CASs, também foi observado nitidamente que dependendo das condições de cultivo a linhagem tem resposta fisiológica diferente, produzindo biossurfactante ou bioemulsificante. Ao avaliar as fontes de carbono que influenciam a produção, observamos que o hexadecano responde positivamente, bem como o óleo de soja. A utilização do hexadecano para a produção de CASs por linhagens de Gordonia também foi realizada com sucesso por outros grupos de pesquisa, sendo observando o aumento na produção de CASs (Franzetti et al. 2009, Pagilla et al. 2002). Nos experimentos realizados, quando a concentração de hexadecano foi aumentada, a linhagem diminuiu a produção de biossurfactante e passou a produzir com maior eficiência um emulsificante. Franzetti e colaboradores também observaram a produção de dois tipos CASs pelA linhagem Gordonia sp. BS29, um que apresenta boa atividade emulsificante (exopolissacarídio) e um que apresenta boa atividade de biossurfactante (glicolipídio) (Franzetti et al. 2009a).

Também, podemos citar outra forma de melhoramento da produção dos biossurfactantantes, o melhoramento genético. Para isso, é fundamental o conhecimento detalhado das vias metabólicas e dos genes que estão envolvidos no processo. Os bioprocessos normalmente dependem de micro- organismos superprodutores, mesmo com a utilização de matéria prima de baixo custo, otimização nas condições de cultivo e métodos eficientes de recuperação do produto final, o processo só é viável se houver alto rendimento (Mukherjee et al. 2006). Mesmo conhecendo a importância de se estudar as vias metabólicas dos micro-organismos produtores de biossurfactantes, ainda há poucos estudos disponíveis na literatura, talvez devido à diversidade dessas vias, o que dificulta as análises. Os estudos concentram-se em espécies de B. subtilis, B. licheniformis e P. aeruginosa. Neste trabalho, foi estudada a via metabólica da produção de pumolicidina, lipopeptídio produzido por linhagens de B. safensis. Este

154 foi o primeiro trabalho de caracterização química e genética do biossurfactante produzido por essa espécie de Bacillus. Os dados fisiológicos, obtidos através do planejamento experimental, químicos e genéticos combinados fornecem informações importantes para estudos posteriores visando a produção do biossurfactante por micro-organismo recombinante com maior rendimento e melhores características químicas.

A outra linhagem bacteriana que despertou interesse ao longo desse trabalho foi Gordonia sp. CCMA-559. O gênero Gordonia tem sido amplamente estudado e tem gerado interesse na comunidade científica devido ao grande potencial de biorremediação e biodegradação (Yoon et al. 2000). Muitas espécies de Gordonia apresentam a capacidade de degradar ou modificar hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, compostos aromáticos halogenados, poli-isopreno, xileno, entre outros. A incorporação das cadeias alifáticas longas dos ácidos micólicos na parede celular está associada com a hidrofobicidade e adesão de superfície, e pode ter um papel importante na degradação de poluentes hidrofóbicos (Bendinger et al. 1993). Esse gênero de bactérias também tem a habilidade de degradar outros compostos xenobióticos, como butil-éter, metil-butil-éter, alcanos cíclicos e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (Kastner et al. 1998, Hernandez-Perez et al. 2001).

A capacidade de biodegradação de compostos insolúveis e hidrofóbicos está geralmente associada com a produção de (CASs) pelo micro-organismo (Banat et al. 2000). A importância dos CASs na degradação de poluentes ocorre devido a: (i) o biossurfactante, tal como o ácido micólico, causa a aderência da célula microbiana em fases hidrofóbicas em sistemas bifásicos (Nazina et al. 2003); (ii) os surfactantes promovem o acesso do micro-organismo a fontes hidrofóbicas através da redução da tensão superficial (Fiechter, 1992); e (iii) os CASs dispersam os compostos hidrofóbicos, aumentanto a área de superfície para o ataque microbiano (Finnerty, 1994). A produção de CASs tem sido relatada em diversas espécies de Gordonia, sendo que, em geral, G. amarae é a mais estuda. Tendo em vista a capacidade de espécies de Gordonia produzirem CASs e apresentarem alta capacidade de degradação, isso foi abordado neste trabalho. Embora os dados do sequenciamento do genoma tenham sido apresentados neste trabalho, dificuldades foram encontradas para a caracterização genética da via metabólica em função da escassez de informações sobre as bases genéticas da produção de biossurfactantes por micro-organismos similares nas bases de dados. Entretanto, essa espécie de micro- organismo tem fornecido dados promissores de produção de enzimas, degradação de hidrocarbonetos (dados não mostrados) e produção de CASs.

155 Além da abordagem dependente-de-cultivo (cultivo, avaliação e otimização da produção de biossurfactante e genômica), também foi utilizada neste trabalho a abordagem independente-de-cultivo (metagenômica) para a prospecção de biossurfactantes a partir de sedimentos de manguezais. Esta etapa teve início com a construção de uma biblioteca fosmidial de DNA com alto peso molecular (25-40 kb) visando a subsequente triagem de vias metabólicas completas de biossurfactantes, uma vez que essas normalmente estão localizadas em grandes operons. Muitos trabalhos empregaram essa abordagem para a prospecção de enzimas, como esterases (Henne et al. 2000; Rondon et al. 2000), proteases (Gupta et al. 2002), quitinases (Cottreel et al. 1999) e celulases (Rees et al. 2002, Kim et al. 2013), resultando na detecção e caracterização genética e/ou química das mesmas. Um dos fatores que contribuem para isso, é que normalmente essas enzimas são codificadas por genes pequenos, os quais independem da regulação por genes localizados em outra região do genoma, diferente do que ocorre com os biossurfactantes. Do pouco que é conhecido da genética dos biossurfactantes, podemos afirmar que as vias metabólicas são muito complexas, sendo reguladas por genes externos ao operon, ou ainda sendo expressas de acordo com o ambiente que o micro-organismo se encontra (Nakano et al. 1988, Ochsner et al. 1994, Rahim et al. 2001, Nakar& Gutnik 2003). Aliado a isto, a grande diversidade química dos biossurfactantes compromete as metodologias para o screening, dificultando ainda mais o sucesso dessa abordagem.

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