Planejamento experimental e otimização da produção de
biossurfactantes nas linhagens Gordonia sp. CCMA-559 e Bacillus
80 1. INTRODUÇÃO
Muitos micro-organismos procariotos e eucariotos sintetizam uma variedade de moléculas anfifílicas com diferentes estruturas químicas. Esses compostos podem ser extracelulares ou ligados à membrana da célula. Neu (1996) separou os compostos ativos em superfície (CASs) em dois grupos: os CASs de baixo peso molecular, também chamados de biossurfactantes, e os de alto peso molecular, que compreendem os polissacarídeos, proteínas, lipopolissacarídios, lipoproteínas ou uma mistura complexa de biopolímeros. Como principais características, os CASs de baixo peso molecular são eficientes na redução da tensão superficial e os CASs de alto peso molecular são bons estabilizadores de emulsão (água-óleo), sendo também chamados de bioemulsificantes (Ron & Rosenberg, 2002).
Atualmente os biossurfactantes/bioemulsificantes tem ganho importância em aplicações de MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery), biorremediação, indústrias de alimentos e indústrias farmacêuticas devido às suas propriedades, como alta biodegradabilidade, baixa toxicidade, e estável em condições extremas de pH, temperatura e salinidade. Entretanto, a produção em larga-escala desses compostos ainda não é viável em função do baixo rendimento de produção e o alto custo de recuperação e purificação do composto. Neste sentido, algumas alternativas têm sido adotadas para tornar o processo mais economicamente atrativo, isto inclui o uso de matéria prima mais barata, otimização no processo de produção, obtenção e purificação e desenvolvimento de cepas mutantes e recombinantes.
A seleção de variáveis que interferem significativamente sobre a atividade de produção de biossurfactantes pode ser feita variando-se um fator por vez ou através de métodos estatísticos. O primeiro método é o procedimento experimental mais difundido e usual, e envolve o estudo de uma variável por vez, “one-at-a-time”, no qual é avaliada uma das variáveis estudadas em diferentes condições e as demais são fixadas. Este método negligencia possíveis interações entre os fatores por não explorar completamente o espaço experimental. Além disso, experimentos com todas as combinações de variáveis são praticamente impossíveis de reproduzir, levando em consideração, principalmente, o número de ensaios. Tais limitações podem ser eliminadas empregando-se planejamentos experimentais estatísticos que usam um número menor de medidas e exploram todo o espaço experimental (Montgomery, 2007).
Inicialmente, quando se conhece pouco do processo, o ideal é utilizar metodologias de triagem das condições de cultivo, entre elas o planejamento fatorial fracionado e o planejamento do tipo Plackett - Burman (P&B), que promove a seleção de variáveis com foco na redução do número de
81 ensaios (Rodrigues & Iemma 2009). Nesta primeira triagem, recomenda-se avaliar o resultado e estimar os efeitos principais de acordo com um modelo linear, e as variáveis que exibirem maior influência no processo são selecionadas para novos estudos e otimização. Nesta segunda fase, a mais bem sucedida técnica usada para análise e otimização das variáveis de um processo é conhecida por Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), que possibilita a avaliação dos efeitos de cada variável individualmente e de suas interações sobre uma dada resposta. Ao final, a metodologia de superfície de resposta pode ser empregada para obtenção de um modelo teórico e dedução das condições otimizadas (Rodrigues & Iemma, 2009). O planejamento estatístico de experimentos implica grande economia de tempo e custos devido à diminuição considerável do número de ensaios necessários ao estudo de um processo influenciado por diversas variáveis.
Neste contexto, a proposta desse capítulo foi a otimização do processo de produção de biossurfactantes utilizando a metogologia de planejamento experimental.
2. OBJETIVOS
Avaliar a produção de biossurfactante das linhagens selecionadas;
Selecionar as variáveis que interferem na produção de biossurfactante através do planejamento experimental do tipo Plackett–Burman;
Otimizar a produção do biossurfactante por meio do Delineamento Composto Central Rotacional – DCCR (software STATISTICA 7.0);
82 3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Linhagens bacterianas
As sete bactérias utilizadas neste estudo (Tabela 1) foram isoladas de sedimentos de manguezais contaminados com petróleo, localizados em Bertioga, no âmbito do Projeto Temático “Biodiversidade e Atividades Funcionais de Microrganismos de Manguezais do Estado de São Paulo” (Processo FAPESP n° 04/13910-6), coordenado pelo Dr. Itamar Soares de Melo. Estas bactérias são sabidamente produtoras de biossurfactante e fazem parte do acervo de pesquisa da Coleção de Micro-organismos de Importância Agrícola e Ambiental da Embrapa Meio Ambiente (Jaguariúna, SP).
Linhagem Identificação Preliminar Fonte de isolamento Referência
CCMA-553 Sphingomomas paucimobilis
Sedimento de manguezal contaminado com
petróleo
Reyes, 2009 CCMA-557 Nocardia brasiliensis
CCMA-558 Pseudomonas mendocina CCMA-559 Gordonia rubripertincata CCMA-560 Sem identificação
CCMA-561 Achromobacter xylosoxidans CCMA-580 Pseudomonas stutzeri
3.2. Teste de emulsificação
Foi realizado o pré-inóculo em meio Caldo Nutriente e as culturas foram incubadas a 30° C por 24 horas sob agitação contínua de 150 rpm. Posteriomente, uma alíquota de 10 % (v/v) com absorbância ajustada para DO600 = 0,150 ± 0,030 foi utilizada como inóculo nos ensaios em meio mineral
(5 g extrato de levedura; 1 g (NH4)2SO4; 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4; 2,7 g NaCl; 0,6 g MgSO4 ∙7H2O, 1000
mL água destilada). Ao meio pronto foi adicionado 0,1 % (v/v) de solução de micronutrientes [10,95 g ZnSO4∙ 7H2O; 5 g FeSO4∙ 7H2O; 1,54 g MnSO4∙ 7H2O; 0,39 g CuSO4∙ 5H2O; 0,25 g Co(NO3)2 6H2O; 0,17 g
Na2B4O7 10H2O]) acrescido de 1% de glicose, seguido de incubação a 30° C por 96 horas sob agitação
contínua de 150 rpm. As linhagens CBMAI 602 e CBMAI 707 foram utilizadas como controles biológicos positivos, o Tween 80 como controle químico positivo, e como controle negativo foram utilizados o meio de cultura sem inóculo e água.
Em um tubo de ensaio com rosca (10 x 130 mm) foram adicionados 1 mL do sobrenadante da cultura livre de células e 1 mL de querosene. A solução foi homogeneizada vigorosamente em vórtex por 2 minutos e deixada em repouso por 24 horas à temperatura ambiente. Para avaliar a atividade
83 emulsificante, a altura da mistura foi mensurada bem como a altura da emulsão formada na interface. Os valores foram aplicados na fórmula (Pruthi & Cameotra, 1997):
E24 =
3.3. Avaliação da produção de biossurfactantes
As duas linhagens bacterianas, CCMA-559 (Gordonia sp.) e CCMA-560 (Bacillus safensis), foram reativadas em meio Ágar Nutriente e incubadas por 24 horas a 30°C. Posteriormente, uma única colônia foi inoculada em meio Caldo Nutriente e incubada novamente por 24 horas a 30°C. Após o crescimento, a cultura foi centrifugada e uma alíquota de 10 % (v/v) com absorbância ajustada para DO600 = 0,150 ±
0,030 foi utilizada como inóculo nos ensaios determinados com base no planejamento experimental.
3.3.1. Seleção de variáveis utilizando o planejamento experimental do tipo Plackett–Burman (P&B) no processo de produção de biossurfactantes
Inicialmente foi realizado um planejamento Plackett-Burman para avaliação de 12 variáveis (Tabela 2). Todas as diferentes variáveis foram preparadas em dois níveis, designados como -1 para o inferior e +1 para o superior. Três ensaios no ponto central foram acrescentados à matriz para a determinação do erro padrão durante a análise dos resultados.
84 As bactérias foram inoculadas em 50 mL de meio de cultura em frascos Erlenmeyer de 125 mL e incubadas a 30° C por 96 horas sob agitação contínua de 150 rpm. O pH do meio de cultura foi ajustado para 7,0 antes de autoclavar. A composição do meio de cultura bem como as concentrações neste primeiro P&B para a produção de biossurfactante está descrita na Tabela 3. Em todos os frascos, foi adicionado 0,01% de solução de elementos traços (0,625 g EDTA; 2,74 g ZnSO4; 1,25 g FeSO4.7H2O; 0,385
g MnSO4.7H2O; 0,098 g CuSO4.5H2O; 0,044g Na2B4O7.10H2O).
Tabela 2. Matriz do planejamento experimental Plackett-Burman com 12 variáveis. Variáveis reais e variáveis codificadas (-1, 0 e +1). Nº Exp. F1 (%) F2 (%) F3 (%) F4 (%) F5 (%) F6 (%) F7 (g/L) F8 (g/L) F9 (g/L) F10 (g/L) F11 (g/L) F12 (%) 1 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 2(+1) 0(-1) 2 1(+1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 5(+)1 0(-1) 0(-1) 5(+1) 2(+1) 0(-1) 3(+1) 3 1(+1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 2(+1) 2(+1) 0(-1) 4 1(+1) 1(+1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 2(+1) 3(+1) 5 0(-1) 1(+1) 1(+1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 3(+1) 6 1(+1) 0(-1) 1(+1) 1(+1) 1(+1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 2(+1) 0(-1) 0(-1) 7 0(-1) 1(+1) 0(-1) 1(+1) 1(+1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 2(+1) 0(-1) 8 1(+1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 1(+1) 5(+1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 3(+1) 9 1(+1) 1(+1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 10 0(-1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 5(+1) 2(+1) 0(-1) 0(-1) 11 0(-1) 0(-1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 2(+1) 2(+1) 0(-1) 12 1(+1) 0(-1) 0(-1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 5(+1) 2(+1) 2(+1) 3(+1) 13 0(-1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 1(+1) 5(+1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 2(+1) 2(+1) 3(+1) 14 0(-1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 2(+1) 3(+1) 15 0(-1) 0(-1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 2(+1) 0(-1) 3(+1) 16 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 17(C) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 1(0) 1(0) 1,5(0) 18 (C) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 1(0) 1(0) 1,5(0) 19 (C) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 1(0) 1(0) 1,5(0)
85 Tabela 3. Componentes do meio de cultura utilizados nos experimentos de Plackett-Burman e suas determinadas concentrações Variáveis Constituintes do meio Unidade -1 0 +1 F1 Sacarose % 0 0,5 1 F2 Hexadecano % 0 0,5 1 F3 Glicerol % 0 0,5 1 F4 Óleo de soja % 0 0,5 1 F5 Glicose % 0 0,5 1 F6 Uréia g/L 0 2,5 5 F7 (NH4)2SO4 g/L 0 2,5 5 F8 Peptona g/L 0 2,5 5 F9 Ex. levedura g/L 0 2,5 5 F10 K2HPO4 g/L 0 1 2 F11 KHHPO4 g/L 0 1 2 F12 NaCl % 0 1,5 3
Na primeira triagem foi utilizada a redução da tensão superficial (tensiometria) como resposta. Para tal, foi analisada a tensão superficial do sobrenadante livre de células pelo método Du-Noi em tensiômetro K-20 EasyDine – Krüss. Os resultados foram analisados pelo software STATISTICA 8. O nível de significância de 10% (p <0,1) foi considerado para as variáveis que tiveram influência significativa na redução da tensão superficial.
3.4. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental do tipo DCCR
Após o planejamento P&B, as variáveis significativas foram selecionadas e utilizadas no Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), visando a otimização da produção de biossurfactante. Estes experimentos foram realizados para obter um modelo de segunda ordem, que poderá prever, ao final dos estudos, o melhoramento da produção de biossurfactante em função das diferentes variáveis estudadas. Todos os experimentos foram realizados em um estudo randomizado, e as distâncias dos pontos axiais foram calculadas pela equação:
α = (22)¼ ou α = (23)¼,
86 Os dados foram tratados com o auxílio do software STATISTICA 8 (2325 13th Street Oriente, Tulsa, OK, 74 104, EUA). A qualidade do ajuste da equação do modelo foi expressa pelo coeficiente de determinação R2, e sua significância estatística foi determinada pelo teste F (análise de variância - ANOVA). De acordo com os resultados do P&B, estratégias diferentes foram empregadas para cada isolado.
3.4.1. Bacillus safensis CCMA-560
Com base nos efeitos do P&B, foi realizado um delineamento composto central rotacional (DCCR) 23 com 3 repetições no ponto central capaz de avaliar o efeito de três variáveis sobre as respostas (Tabela 3). Neste experimento foi estudada a influência dos fatores: concentração de peptona, extrato de levedura e óleo de soja (Tabela 4). O inóculo inicial de cada ensaio foi realizado de acordo com o item 2.3, sendo as demais condições de cultivo fixadas a 30° C, 96 horas e 150 rpm. Os fatores hexadecano, glicerol, glicose e uréia foram eliminados, pois os níveis -1 estudados foi de 0 g/L. Os demais elementos, bem como a sacarose, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4 e NaCl foram fixados no ponto
central.
Tabela 4. Matriz com as variáveis reais e codificadas do DCCR.
ENSAIOS Óleo de soja
(%) Peptona (g/L) Ex. Levedura (g/L) 1 1,2 (-1) 5,2 (-1) 5,2 (-1) 2 1,79 (1) 5,2 (-1) 5,2 (-1) 3 1,2 (-1) 5,79 (1) 5,2 (-1) 4 1,79 (1) 5,79 (1) 5,2 (-1) 5 1,2 (-1) 5,79 (1) 5,79 (1) 6 1,79 (1) 5,2 (-1) 5,79 (1) 7 1,2 (-1) 5,79 (1) 5,79 (1) 8 1,79 (1) 5,79 (1) 5,5 (1) 9 1 (-1,68) 5,5 (0) 5,5 (0) 10 2 (1,68) 5,5 (0) 5,5 (0) 11 1,5 (0) 5 (-1,68) 5,5 (0) 12 1,5 (0) 6 (1,68) 5,5 (0) 13 1,5 (0) 5,5 (0) 5 (-1,68) 14 1,5 (0) 5,5 (0) 6 (1,68) 15 1,5 (0) 5,5 (0) 5,5 (0) 16 1,5 (0) 5,5 (0) 5,5 (0) 17 1,5 (0) 5,5 (0) 5,5 (0)
87 Para avaliação da melhor resposta a ser usada na a análise do DCCR, foi realizada a quantificação do extrato bruto, bem como a tensiometria e o teste E24 (item 3.2 deste capítulo). A tensiometria sabidamente não seria a melhor resposta para análise, uma vez que quando chega ao ponto de saturação não é possível mais identificar se houve ou não maior produção de biossurfactante. Desta forma, a quantificação do extrato bruto e o teste E24 foram selecionados para analisar as respostas.
Obtenção do extrato bruto. O procedimento para a obtenção do extrato bruto foi realizado de acordo com Mnif et al. (2012), com modificações. Uma alíquota de 25 mL do sobrenadante livre de células foi acidificada utilizando HCl 6 N e incubada a 4°C por 24 horas. Após esse período, as amostras foram filtradas em papel filtro e secas a 80°C por 2 horas. A massa do extrato bruto foi calculada pela diferença entre o peso seco total e o peso seco do papel de filtro.
3.4.2. Validação e cinética
Com base na análise do DCCR foram derivadas as condições para a validação da produção de biossurfactante. Apesar dos experimentos não resultarem em condições estatisticamente significativas para a avaliação em nível de otimização (gráfico de superfície de resposta e curva de contorno), o resultado encontrado foi significante do ponto de vista da redução da tensão superficial, e o experimento foi validado com os dois ensaios que apresentaram maior significância nas análises matemáticas, ensaios 10 e 14 (Tabela 2.3). A validação foi realizada em triplicata seguindo as condições: 0,5% sacarose, 2% óleo de soja, 5 g/L (NH4)2SO4, 2 g/L K2HPO4, 1 g/L KH2PO4, 5,5% peptona, 5,5% extrato
de levedura e 3% NaCl, e a bactéria foi crescida em Erlenmeyer de 125 mL a 30 °C por 96 horas sob agitação contínua de 150 rpm. Para a avaliação da resposta foram utilizados a tensiometria e o teste E24.
A cinética foi utilizada para otimizar o melhor tempo de produção do biossurfactante. Para tal, os ensaios 10 e 14 foram reproduzidos em triplicatas e incubados por 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Após esse período, os frascos foram sacrificados e o teste de emulsificação E24 e a tensiometria foram avaliados como resposta para a cinética.
88 3.4.3. Gordonia sp. CCMA-559
De acordo com os efeitos observados no planejamento P&B, foi realizado um delineamento composto central rotacional (DCCR) 23 com 3 repetições no ponto central capaz de avaliar o efeito de três variáveis sobre as respostas (Tabela 5). Neste experimento foi estudada a influência dos fatores concentração de hexadecano, óleo de soja e peptona (Tabela 6). O inóculo inicial de cada ensaio foi realizado de acordo com o item 3.3, sendo as demais condições de cultivo fixadas a 30° C, 96 horas, 150 rpm. Os fatores sacarose, glicerol, uréia, (NH4)2SO4 e KH2PO4 foram eliminados, pois os níveis -1
estudados foram de 0 g/L. Os demais elementos, bem como a glicose, extrato de levedura, K2HPO4, e
NaCl foram fixados.
Tabela 5. Matriz com as variáveis reais e codificadas do DCCR (23).
ENSAIOS Hexadecano (%) Óleo de soja (%) Peptona (g/L) 1 1,2 (-1) 1,2 (-1) 5,2 (-1) 2 1,79 (1) 1,2 (-1) 5,2 (-1) 3 1,2 (-1) 1,79 (1) 5,2 (-1) 4 1,79 (1) 1,79 (1) 5,2 (-1) 5 1,2 (-1) 1,79 (1) 5,79 (1) 6 1,79 (1) 1,2 (-1) 5,79 (1) 7 1,2 (-1) 1,2 (1) 5,79 (1) 8 1,79 (1) 1,79 (1) 5,79 (1) 9 1 (-1,68) 1,5 (0) 5,5 (0) 10 2 (1,68) 1,5 (0) 5,5 (0) 11 1,5 (0) 1 (-1,68) 5,5 (0) 12 1,5 (0) 2 (1,68) 5,5 (0) 13 1,5 (0) 1,5 (0) 5 (-1,68) 14 1,5 (0) 1,5 (0) 6 (1,68) 15 1,5 (0) 1,5 (0) 5,5 (0) 16 1,5 (0) 1,5 (0) 5,5 (0) 17 1,5 (0) 1,5 (0) 5,5 (0)
Para avaliação da resposta do DCCR, foi realizado o teste de espalhamento do óleo, bem como a tensiometria e o teste E24 com hexadecano, óleo diesel e querosene.
89
Teste de espalhamento do óleo. O método de espalhamento do óleo foi realizado de acordo com Youssef et al. (2004). Em uma placa de Petri (150 x 30 mm) foram adicionados 100 mL de água deionizada e 30 μL de petróleo bruto foram depositados na superfície da água de modo a formar uma fina película de óleo. Uma gota de 10 μL do sobrenadante da cultura livre de células foi cuidadosamente depositada sobre a película de óleo. Para verificar a atividade do biossurfactante foi realizada a medida do diâmetro do halo claro formado no filme de óleo. Ainda não há disponível surfactante comercial produzido por espécies de Gordonia para que seja feita a curva padrão e o cálculo da concentração. Entretanto, o teste se mostrou bastante eficiente para essa análise.
Embora alcançando resultados satisfatórios com o DCCR 23, não foi possível gerar o gráfico de superfície. Então, um novo planejamento do tipo DCCR 22 com três repetições no ponto central foi realizado a fim de avaliar o efeito de duas variáveis, o hexadecano e a peptona (Tabela 6). O óleo de soja foi fixado na menor concentração (1%), e a glicose, extrato de levedura, K2HPO4, e NaCl foram mantidas.
Tabela 6. Matriz com as variáveis reais e codificadas do DCCR (22)
ENSAIOS Hexadecano (%) Peptona (g/L) 1 1,65 (-1) 5,65 (-1) 2 2,35 (1) 5,65 (-1) 3 1,65 (-1) 6,35 (1) 4 2,35 (1) 6,35 (1) 5 1,5 (-1,41) 6 (0) 6 2,5 (1,41) 6 (0) 7 2 (0) 5,5 (-1,41) 8 2 (0) 6,5 (1,41) 9 2 (0) 6 (0) 10 2 (0) 6 (0) 11 2 (0) 6 (0) 3.4.4. Validação e cinética
Com base na superfície de resposta foram derivadas as condições para a validação da produção de biossurfactante pela linhagem de Gordonia sp. CCMA-559. Foi realizado o inóculo conforme descrito no item 3.3 em Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 ml do meio líquido preparado com 2,5% de hexadecano, 6 g/L de peptona, 1% de óleo de soja, 0,5% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, 2 g/L de K2HPO4 e 3% de NaCl, ao meio pronto foi acrescentado 0,01% de elemento traço. Todos os ensaios
90 A cinética foi utilizada concomitantemente ao ensaio de validação com o objetivo de avaliar o melhor tempo de produção do biossurfactante. Para tal, os ensaios foram incubados por 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Após esse período, os frascos foram sacrificados.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Teste de Emulsificação
Das sete linhagens analisadas neste estudo, duas apresentaram melhores resultados, a CCMA- 560 e a CCMA-559, com 30 e 35% de emulsificação, respectivamente. Embora as linhagens testadas tenham apresentado valores abaixo de 50%, que indica boa atividade, houve uma alteração bem visível na interface entre o sobrenadante da linhagem e o querosene. Uma emulsão esbranquiçada e micro- bolhas puderam ser observadas (Figura 1), diferente do controle negativo (água), sugerindo a atividade emulsificante. (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c (A) (B) (C)
Figura 1. Teste de emulsificação das linhagens isoladas de mangue. Os itens (a), (b) e (c) são representados pelo controle negativo (água), controle positivo (Tween 80) e a linhagens em estudo, respectivamente. (A) CCMA 560; (B) CCMA 580; (C) CCMA 561; (D) CCMA 559; (E) CCMA 556; (F) CCMA 553 e (G) CCMA 557.
91 4.2. Avaliação da produção de biossurfactante
4.2.1. Planejamento do tipo Plackett-Burman (P&B)
Visando obter os melhores resultados para a produção de biossurfactantes, a avaliação das condições fisico-químicas do processo pode ser considerada como um fator relevante. Neste sentido, o uso de abordagens estatísticas tem sido amplamente empregado. Assim, o objetivo desta etapa foi a seleção de componentes do meio de cultura com efeito positivo sobre a produção de biossurfactante pelos isolados, verificada através dos valores de tensiometria. A estratégia utilizada foi um planejamento experimental do tipo Plackett-Burman, recomendada quando se deseja avaliar um grande número de fatores através de uma triagem experimental com foco na redução do número de ensaios (Rodrigues & Iemma, 2005).
Foram avaliadas inicialmente 12 variáveis, dentre elas cinco fontes de carbono (sacarose, glicose, glicerol, óleo de soja e hexadecano), quatro fontes de nitrogênio (uréia, (NH4)2SO4, extrato de levedura e
peptona) e três fontes de sais (NaCl, K2HPO4 e KH2PO4). Os valores centrais dos níveis estudados (PC),
bem como os constituintes do meio são dados disponíveis na literatura (Sanket et al. 2007; Franzetti et al. 2009; Onwosi & Odibo 2012).
4.2.2. Bacillus safensis CCMA-560
No planejamento do tipo P&B a linhagem CCMA-560 de B. safensis apresentou melhor resposta (tensiometria) no ensaio em que o óleo de soja, a peptona e o extrato de levedura foram utilizados (Anexo 1). A linhagem reduziu a TS (tensão superficial) a 29,5 mN/m.
A análise estatística do cálculo do efeito e o erro padrão (Anexo 2) identificaram as variáveis óleo de soja, extrato de levedura e peptona como significativas no processo em um nível de significância de 10% (p < 0,1), todos com efeito positivo, ou seja, o aumento da resposta pode ser alcançado trabalhando com concentrações maiores das três variáveis. Neste sentido, no delineamento do próximo ensaio visando a otimização, os efeitos das variáveis significativas foram considerados (Figura 2) e novos valores foram delimitados, levando em consideração o ensaio com a maior redução da tensão superficial e seu efeito positivo. As variáveis não significativas: sacarose, K2HPO4, KH2PO4 e NaCl foram fixadas, com
base no ensaio com a maior redução da tensão superficial (Tabela 4, ensaio 14). Além disso, as variáveis não significativas com efeito negativo (hexadecano, glicerol, glicose e uréia) foram retiradas, uma vez que o valor mínimo avaliado foi zero. Assim, três variáveis foram selecionadas para o estudo numa nova
92 faixa: óleo de soja, extrato de levedura e peptona, permitindo a otimização da produção de biossurfactante através de um Delineamento Composto Central Rotacional – DCCR do tipo 23.
Embora as condições que afetam a síntese de biossurfactantes tenham sido extensivamente estudadas, principalmente nas espécies B. subtilis, B. amyloliquefaciens e B. licheniformis (Joshi et al. 2007, Liu et al. 2012, Najafi et al. 2012), ainda existem poucos estudos mostrando que o óleo vegetal é uma boa fonte de carbono para a produção de biossurfactantes. Já em linhagens de Pseudomonas aeruginosa, esta fonte foi utilizada com sucesso (Benincasa et al. 2002; Nitschke et al. 2010) e os ramnolipídios são estimulados por ponte de carbono hidrofóbicas (Abbasi et al. 2013). Das e colaboradores (2009) estudaram óleos vegetais (óleo de mostarda, girassol e arroz) como fonte de carbono para a produção de biossurfactante em B. circulans e não obtiveram sucesso na produção. Entretanto, no presente trabalho, os ensaios de P&B mostraram que o óleo de soja influenciou positivamente (efeito = 12) na produção do biossurfactante por B. safensis CCMA-560 com alta probabilidade estatística (p = 0,009). Por outro lado, muitos trabalhos mostram o efeito positivos do uso de glicose (Mukherjee et al. 2008, Najafi et al. 2010, Mnif et al. 2012), e neste trabalho esta fonte de carbono teve efeito negativo na produção (efeito = -0,25).
De acordo com estudos já realizados, a limitação de nitrogênio acarreta o aumento na produção de biossurfactante em micro-organismos como P. aeruginosa (Ramana & Karant, 1989), Candida tropicalis (Singh et al. 1990) e Nocardia sp. (Kosaric et al. 1990). Matsufuji e colaboradores aumentaram
-4.00000 -2.00000 0.00000 2.00000 4.00000 6.00000 8.00000 10.00000 12.00000 14.00000 Efei to m N /m
Compostos do meio de cultura
Bacillus safensis CCMA-560 *
Figura 2. Efeito de cada variável estudada na matriz. *Variáveis que apresentaram melhor resposta (significância estatística) no P&B.
93 significativamente a produção de ramnolipídio por P. aeruginosa quando cultivaram o micro-organismo sob limitação de nitrogênio na proporção 18:1 (C:N) (Matsufuji et al. 1997). Neste trabalho, as fontes de nitrogênio utilizadas no meio de cultura apresentaram efeito positivo na produção de biossurfactante, a peptona apresentou efeito de 6,03 e o extrato de levedura de 6,25. Diferente dos micro-organismos citados acima, há relatos na literatura que o nitrogênio age positivamente na produção de biossurfactantes em espécies de Bacillus (Najafi et al. 2010; Liu et al. 2012). Isso sugere que além do nitrogênio ter papel importante no crescimento e metabolismo dos micro-organismos, ele é um importante constituinte da porção peptídica da molécula de lipopeptídio, tipo de biossurfactante produzido por espécies de Bacillus.
4.2.3. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental DCCR de B. safensis CCMA-560
Após a realização do P&B para a linhagem CCMA-560, conforme a análise das variáveis e do efeito (item 4.2.2), três variáveis foram selecionadas para o estudo numa nova faixa: óleo de soja, extrato de levedura e peptona. Para a variável óleo de soja um valor intermediário de 1 a 2% foi testado, uma vez que no P&B foi estudado de 0 a 1%. Já para o extrato de levedura e para a peptona, a faixa selecionada foi de 5 a 6 g/L. Os resultados mostram que a resposta da tensão superficial não teve variação significativa. A tensão superficial diminui gradativamente com o aumento da concentração de biossurfactante. Mas em determinada concentração, conhecida por concentração micelar crítica (CMC), a diminuição é cessada. Quando é atingido o CMC, a tensão superficial permanece constante, mesmo que a concentração de biossurfactante seja aumentada (Butt et al. 2004). Portanto, embora muitos estudos tenham sido realizados somente com a análise da tensão superficial (Sanket et al. 2007, Khopade et al. 2012, Liu et al. 2012, Mnif et al. 2012), este trabalho mostrou que a estratégia de