i DANIELA FERREIRA DOMINGOS
PROSPECÇÃO DE BIOSSURFACTANTES A PARTIR DE MICROBIOTA DE MANGUEZAIS
PROSPECTION OF BIOSURFACTANT FROM MANGROVE MICROBIOTA
CAMPINAS 2014
iii
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para a obtenção do título de Doutora em Genética e Biologia Molecular na Área de GENÉTICA DE MICROORGANISMOS.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology the area of GENETICS OF MICROORGANIMS.
v
vii ABSTRACT
Mangrove is an environment rich in microbial diversity, but little has been reported about it in Brazil, making the knoledge and exploitation of new microorganisms in mangroves an imperative issue. The prospection of microbial diversity in underexplored environments, such as mangroves, increses possibility of success in looking for new bioactive molecules, contributing to a more sustentable economy and environment. Although the cultivation techniques have been improved, allowing an increased number of yet uncultivated microorganisms to be able recuperated in vitro, our knowledge about their ecology is still insufficient to cultivate the marjority of them. Therefore, the metagenomic library have emerged as a powerful tool to more widely access the overall microbial diversity in an environment, enabling the functional analyses of genes and the discovery of new bioactive compounds, mainly uncultured-microorganisms. The aim of the current work was the prospection of biosurfactant from mangrove microbiota through a polifasica approach. For the independent-cultivation approach, a metagenomic library of high molecular weight was constructed from mangrove sediment contaminated with oil. The clones were subjected to functional and molecular screening to identify biosurfactant activity. Three clones with the potential to procuce biosurfactant were selected, and the fosmid sequencing for genetic chatacterization of the insert was carried out. Although the clones showed the ability to reduce the surface tension, genes that may involved in biosurfactant synthesis were not identified. The results showed that using the functional metagenomic to explore metabolic pathways of microbial communities can have great limitation when in the prospection of biosurctants when the operon are larger then 30-40 kb and the genome of wild bacteria contains sparse regulation elements. For the dependent-cultivation approach, two strains that produce biosurfactant were selected: Bacillus safensis CCMA-560 and Gordonia sp. CCMA-559. They were isolated and tested in previous study. The biosurfactant production was opmized through the Placktt-Burman design and the Central Composite Design. The pumilacidin produced by B. safensis CCMA-560 was chemically characterized, and the metabolic pathway that is responsible for its production was genetically characterized. This work was the first report the physiologic, genetic, and chemical analysis on the biosurfactant production by the B. safensis strain.
ix RESUMO
O manguezal é um ambiente rico em diversidade microbiana, entretanto existem poucos estudos sobre esse tema no Brasil, tornando imperativo o conhecimento e a exploração de novos micro-organismos e seus metabólitos neste ecossistema. A prospecção da diversidade microbiana em ambientes pouco explorados, como os manguezais, potencializa as chances de sucesso na busca por novas moléculas bioativas, contribuindo para o desenvolvimento econômico e ambiental mais sustentável. Entretanto, sabemos que embora as técnicas de cultivo tenham sido aprimoradas e tenham permitido a recuperação in vitro de um número crescente de micro-organismos ainda não cultivados, nosso conhecimento sobre sua ecologia permanece insuficiente para cultivar a maioria deles. Neste contexto, as bibliotecas metagenômicas surgem como uma ferramenta poderosa para acessar de maneira mais abrangente a diversidade microbiana total em um dado ambiente, permitindo a análise e exploração de genes funcionais de membros da microbiota, principalmente de micro-organismos não-cultivados, e a descoberta de novos compostos bioativos. O objetivo geral desse trabalho foi a prospecção de biossurfactantes a partir de microbiota de manguezal utilizando uma abordagem polifásica. Para a abordagem independente-de-cultivo, foi construída uma biblioteca metagenômica de alto peso molecular a partir de sedimento de manguezal contaminado com petróleo. Os clones obtidos foram submetidos à triagem funcional e molecular para compostos com atividade biossurfactante. Três clones potencialmente produtores foram selecionados e submetidos ao sequenciamento fosmidial para a caracterização gênica dos insertos. Embora os clones apresentassem uma redução na tensão superficial, não foram identificados genes que pudessem estar envolvidos na síntese de algum biossurfactante. Os resultados obtidos revelaram que o uso da metagenômica funcional para a exploração metabólica de uma comunidade microbiana pode oferecer grandes limitações quando se trata de prospecção de biossurfactantes, cujos operons são muitas vezes maiores que 30-40 kb e podem conter elementos de regulação esparsos no genoma da bactéria selvagem. Na abordagem dependente-de-cultivo, foram selecionadas duas linhagens produtoras de biossurfactantes, Bacillus safensis CCMA-560 e Gordonia sp. CCMA-559, isoladas e testadas em estudo prévio. Através de planejamento experimental do tipo Plackett-Burman e Delineamento Composto Central Rotacional foi otimizada a produção do biossurfactante por essas linhagens. A pumolicidina produzida pelo B. safensis CCMA-560 foi caracterizada quimicamente, bem como a via metabólica responsável por sua produção. Este foi o primeiro trabalho a reportar a análise fisiológica, genética e química da produção de biossurfactante por representantes da espécie B. safensis.
xi
S
UMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………. 1
2. REVISÃO DA LITERATURA……….. 3
2.1. Importância ecológica do mangue……….. 3
2.2. Os biossurfactantes……… 6
2.3. Aplicação industrial dos biossurfactantes………. 10
2.3.1. Aplicação dos biossurfactantes em indústria de petróleo... 11
2.4. Metagenômica aplicada à Microbiologia... 14
2.5. Referências Bibliográficas... 16
3. APRESENTAÇÃO DA TESE... 21
CAPÍTULO 1 – Prospecção de biossurfactantes em biblioteca metagenômica de sedimento de manguezal... 23
1. Introdução... 24
2. Objetivos... 25
3. Material e métodos... 25
3.1. Coleta do sedimento de manguezal... 25
3.2. Extração de DNA de alto peso molecular de sedimento de manguezal... 26
3.2.1. Extração pelo kit PowerSoil® DNA Isolation (MoBio Laboratories, Inc.)... 26
3.2.2. Extração pelo kit PowerMax® Soil DNA Isolation (MoBio Laboratories, Inc.)... 26
3.2.3. Extração pelo método CTAB-SDS... 27
3.2.4. Extração por Freeze-Thaw... 27
3.3 Eletroforese... 28
3.4. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)……….. 28
3.5. PRC do gene RNAr 16S... 28
3.6. Construção da biblioteca metagenômica de sedimento do mangue... 29
3.6.1. Seleção de fragmentos de DNA de alto peso molecular... 29
3.6.2. Purificação dos fragmentos de DNA de alto peso molecular... 29
3.6.3. Reação de End-Repair... 30
3.6.4. Reação de ligação... 30
3.6.5. Empacotamento... 30
xii
3.6.7. Validação da biblioteca metagenômica... 31
3.6.8. Preservação dos clones... 32
3.7. Screening funcional dos clones... 32
3.7.1. Colapso da gota... 32
3.7.2. Colapso da gota modificado... 33
3.7.3. Tensiometria... 33
3.8. Screening molecular dos clones... 35
3.9. Sequenciamento dos fosmídios... 37
3.9.1. Extração do DNA fosmidial... 37
3.7.2. Sequenciamento plea tecnologia do Ion-Torrent... 37
3.9.3. Assembling das sequências... 37
3.9.4. Fechamento dos gaps... 38
3.9.5. Anotação dos genes... 38
4. Resultados e Discussão... 38
4.1. Construção da biblioteca metagenômica... 38
4.2. Screening funcional... 41
4.2.1. Colapso da gota... 41
4.2.2. Tensiomentria... 43
4.3. Screening molecular... 49
4.4. Sequenciamento dos fosmídios... 49
4.4.1. Montagem das sequências... 50
4.4.2. Características gerais dos fosmídios... 54
4.4.3. Anotação dos fosmídios... 57
4.4.3.1. Anotação do fosmídio A6... 57
4.4.3.2. Anotação do fosmídio F10... 63
4.4.3.3. Anotação do fosmídio H5... 70
5. Conclusões... 74
6. Referências Bibliográficas... 75
CAPÍTULO 2 - Planejamento experimental e otimização da produção de biossurfactantes nas linhagens Gordonia sp. CCMA-559 e Bacillus safensis CCMA-560 isoladas de manguezal contaminado com petróleo... 79
xiii
2. Objetivos... 81
3. Material e Métodos... 81
3.1. Linhagens bacterianas... 82
3.2. Teste de emulsificação... 82
3.3. Avaliação da produção de biossurfactantes... 83
3.3.1. Seleção de variáveis utilizando o planejamento experimental do tipo Plackett– Burman (P&B) no processo de produção de biossurfactantes... 83
3.4. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental do tipo DCCR... 85
3.4.1. Bacillus safensis CCMA-560... 86
3.4.2. Validação e cinética... 87
3.4.3. Gordonia sp. CCMA-559... 88
3.4.4. Validação e cinética... 89
4. Resultados e Discussão... 90
4.1. Teste de Emulsificação... 91
4.2. Avaliação da produção de biossurfactante... 92
4.2.1. Planejamento do tipo Plackett-Burman (P&B) ... 92
4.2.2. Bacillus safensis CCMA-560... 92
4.3. P&B de Gordonia sp. CCMA-559... 97
4.3.1. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental DCCR de Gordonia sp. CCMA-559... 98
5. Conclusões... 102
6. Referências Bibliográficas... 102
CAPÍTULO 3 - Draft Genome Sequence of the Biosurfactant-Producing Bacterium Gordonia amicalis Strain CCMA-559, Isolated from Petroleum-Impacted Sediment... 105
CAPÍTULO 4 - Draft Genome Genome Sequence of Bacillus pumilus CCMA-560, Isolated from an Oil-Contaminated Oil Swamp... 109
CAPÍTULO 5 - Genomic and chemical insights into biosurfactant production by the mangrove-derived strain Bacillus safensis CCMA 560... 111
4. DISCUSSÃO GERAL... 151
5. CONCLUSÃO GERAL... 159
xiv 7. ANEXOS... 163
xv
“It is not the strongest of the species that survives,
Nor the most intelligent that survives.
It is the one that is the most adaptable to change.”
xvii
Aos meus queridos pais Márcio e Rose, que me fizeram estudar por acreditarem que a única herança que os
pais realmente podem deixar aos seus filhos é a moral e os estudos.
Ao meu marido Felipe pelo apoio incondicional em todos os momentos, principalmente nos de incertezas,
muito comum em quem trilha novos caminhos.
xix AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Dra. Valéria Maia de Oliveira,
Pela dedicação, paciência e competência científica com que orientou ao longo desses anos, e também por contribuir para o meu crescimento profissional e pela confiança depositada no meu trabalho.
Ao meu co-orientador Dr. Itamar Soares de Melo, Por confiar em meu trabalho e as palavras de apoio.
Ao meu supervisor Dr. David J. Midgley,
Pela recepção, hospitalidade no CSIRO e incansável disposição em me apresentar à bioinformática.
À toda equipe do Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO – Animal, Food and Health Sciences, Sydney – Austrália) – Phil Hendry, Nai Tran-Din, Wang Han, Dongmei Li e Carly Rosewarne,
Pelos ensinamentos, infra-estrutura e os agradáveis momentos no laboratório.
À Profa. Dra. Vânia de Melo,
Por participar da minha qualificação com sugestões que foram fundamentais na continuidade deste trabalho.
À Dra. Andréia Fonseca de Faria,
Por ajudar nas análises químicas e discussão deste trabalho.
À Profa. Dra. Suzan Pantaroto Vasconcellos,
Pela paciência e disposição em responder meus infinitos emails de dúvidas e perguntas sobre técnicas. E também pela amizade adquirida ao longo desses anos.
À Profa. Dra. Rafaella Bonugli-Santos,
Pelo auxílio nas análises de planejamento experimental e discussão deste trabalho.
À Profa. Dra. Cynthia Canedo da Silva,
Por ensinar as técnicas de construção de bibliotecas metagenômicas.
A todos os membros da minha qualificação, pré-banca e banca,
Pela disponibilidade em participar de cada etapa e pelas críticas e sugestões.
Aos técnicos Milena, Éricka, Viviane e Túlio, Pelos ensinamentos e amizade.
À minha companheira dos biossurfactantes Bruna M. Dellagnezze,
xx À minha querida companheira de mangue e metagenômica Júlia R. Ottoni,
Pelos incontáveis favores, colaboração no meu trabalho, companheirismo no laboratório e amizade ao longo dos quatro anos de trabalho.
À minha querida amiga Samantha,
Pela amizade construída nos quatro anos trabalhando juntas, os almoços, momentos de descontração e desabafos.
À toda equipe DRM,
Pelos momentos de descontração, amizade e companheirismo nesses anos trabalhando juntos.
Aos meus queridos e amados pais Márcio e Rose,
Pelo amor infinito, apoio incondicional, por serem os meus verdadeiros mestres. Me ensinaram as coisas mais simples, porém não menos importantes, que é o caráter, responsabilidade e força de vontade para correr atrás dos meus objetivos.
Ao meu marido, amigo e companheiro Felipe,
Por estar sempre ao meu lado, por ter paciência e saber lidar com uma esposa doutoranda.
À minha querida vózinha Tereza, Pelas orações.
À toda a minha família,
Pelo apoio e palavras de incentivo.
À minha família australiana, Lyn e Emily,
Que me receberam tão bem em sua casa durante a minha estadia na Austrália.
À FAPESP,
Pela concessão da bolsa de doutorado.
Ao CPQBA,
Pela infa-estrutura.
À Deus,
Pela fé que tenho nele.
1
1. INTRODUÇÃO
A contaminação do solo e da água por petróleo e derivados é um problema de âmbito mundial. Nesse sentido, micro-organismos capazes de degradar hidrocarbonetos e, portanto, adaptados ao crescimento em ambientes contendo óleo, têm um importante papel no tratamento biológico desse tipo de poluição. Muitos desses micro-organismos produzem, através de suas vias metabólicas, biossurfactantes de natureza química diversificada e dos mais variados tamanhos moleculares. Algumas bactérias se destacam como eficientes produtoras de biossurfactantes, dentre elas estão Bacillus spp. (Cooper & Goldenberg, 1987), Halomonas spp. (Martínez-Checa et al. 2001), Volcaniella eurihalina (Calvo et al. 2002), Pseudomonas spp., Corynebacterium spp. e Acinetobacter spp. (Rahman et al. 2002). Portanto, os biossurfactantes de origem microbiana constituem hoje um tópico atual e importante nas pesquisas de biodegradação de petróleo, e oferecem enorme potencial de aplicação tecnológica em processos de biorremediação de áreas impactadas e de MEOR (Microbial Enhancement Oil Recovery), que visa aumentar a recuperação de óleos degradados a partir de reservatórios de petróleo.
Embora as pesquisas sobre comunidades microbianas e suas funções nos manguezais ainda sejam escassos, dados recentes levantados da literatura vêm demonstrando a grande diversidade microbiana presente neste ecossistema, sendo a grande maioria ainda não cultivada (Dias et al. 2009; Andreote et al. 2009; Taketani et al. 2010), e o potencial do seu arsenal enzimático para exploração na busca de novos biocatalisadores e metabólitos bioativos a serem empregados em processos industriais e biotecnológicos econômica e ambientalmente mais sustentáveis (Lin et al. 2007).
Nos últimos anos, várias iniciativas têm sido reportadas em âmbito mundial na tentativa de se conhecer e explorar metagenomas de ambientes diversos, incluindo ambientes extremos, como bacterioplâncton da Antártica, drenagem de minas ácidas, lagos salinos e hipersalinos, geizers do Parque Yellowstone, dentre outros. No Brasil, a bioprospecção genômica microbiana é uma estratégia inovadora na área de biotecnologia que poderá gerar grande impacto econômico para o setor industrial, como a indústria farmacêutica, de detergentes, química fina, e até mesmo de biocombustíveis.
Neste contexto, o presente trabalho empregou uma abordagem polifásica, baseada na investigação de bactérias cultivadas e de clones derivados de bibliotecas metagenômicas, para
2 exploração do vasto potencial biocatalítico de micro-organismos de áreas de manguezais. Este ecossistema apresenta, em geral, condições de alta salinidade, anóxia, escassez de nutrientes, oscilações de pH, entre outras condições adversas, e pressupõe a presença de uma microbiota adaptada a crescer e proliferar sob estas condições, oferecendo assim arsenais enzimáticos únicos e versáteis com grande potencial em processos e tecnologias sustentáveis, uma tendência global atualmente.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Importância ecológica do manguezal
O manguezal é um sistema ecológico particular que ocorre em zonas litorâneas tropicais. É localizado em terrenos baixos, planos e em regiões estuarinas, às margens de lagunas ou ao longo de rios e de canais naturais, em áreas encharcadas, salobras e calmas, com influência das marés; porém, não atingido pela ação direta das ondas. Nesses locais, a força das marés é branda e a velocidade das correntes é baixa, favorecendo a intensa deposição de sedimentos finos e de matéria orgânica. A palavra manguezal vem de mangue, que é a principal vegetação que constitui esse ecossistema. No Brasil, a vegetação dos manguezais é representada pelos gêneros Rhizophora, Laguncularia e Avicennia. O gênero Rhizophora compreende o mangue vermelho, R. mangle (Família Rhizophoraceae). O mangue branco é representado pela Laguncularia racemosa (Família Combretaceae) e o mangue negro é representado pelas espécies Avicennia germinans e Avicennia shaueriana (Família Verbenaceae) (Gamero, 2001; Cury, 2002).
O ecossistema de manguezais é amplamente distribuído entre as zonas tropicais e subtropicais, cobrindo aproximadamente 60 a 75% da linha costeira mundial (Figura 1). Brasil, Indonésia e Austrália são os países com maior abundância de manguezais. Todos os países latino-americanos, tanto na costa do oceano Atlântico como no Pacífico, possuem mangues que cobrem uma área total de 40.000 km2 (Holguin & Bashan, 2007).
4
Figura 1. Distribuição mundial do ecossistema de manguezal. (Fonte:
http://www.thefishsite.com/articles/612/current-status-of-south-east-asian-mangrove-ecosystems)
O Brasil é um dos países com maior área de manguezal do mundo, com aproximadamente 20.000 km2, e esse ecossistema é encontrado ao longo de todo o litoral brasileiro, desde o extremo norte, no Amapá, até o sul de Santa Catarina, na foz do rio Araraguá (Cury, 2002; Holguin & Bashan, 2007). A região da Baixada Santista, no Estado de São Paulo, que compreende os municípios de Bertioga, Cubatão, Guarujá, Itanhaém, Mongaguá, Peruíbe, Praia Grande, Santos e São Vicente, possui uma das maiores concentrações de manguezal do estado, correspondendo à área de 125 km2.
Por ser um elo entre os ambientes marinho, terrestre e de água doce, caracteriza-se por um grande acúmulo de sedimentos e detritos trazidos pelos rios e pelo mar, originando assim um substrato pouco compactado, alagadiço, rico em matéria orgânica, pouco oxigenado e com salinidade variando de 5 a 30% (Rossi & Mattos, 2002).
Embora o manguezal seja rico em matéria orgânica e altamente produtivo, é um ambiente pobre em alguns nutrientes, principalmente fósforo e nitrogênio (Alongi 1988; Vázquez et al. 2000; Holguin & Basham, 2007). Este paradoxo pode ser explicado em função da ciclagem de nutrientes altamente eficiente que se mantém dentro desse ecossistema, através da qual nutrientes essenciais são mantidos e novos nutrientes são gerados a partir da decomposição das folhas mortas do mangue. Evidências sugerem que há uma estreita relação entre micro-organismos-plantas-nutrientes que funciona como um mecanismo para conservar os nutrientes escassos. Uma alta taxa de suprimento
5 desses nutrientes está relacionada à atividade bacteriana, que em manguezais tropicais e subtropicais transforma a vegetação morta em fontes de nitrogênio, fósforo e outros nutrientes que podem ser usados pelas plantas (Bashan & Holguin, 2002). Nesse contexto, as bactérias estão envolvidas em processos de transformação (como amonificação, nitrificação e denitrificação), assim como são responsáveis pela maior parte do fluxo de carbono em sedimentos de manguezais tropicais (Holguin et al. 2001). Nestes, 91% da biomassa microbiana é composta por bactérias e fungos, enquanto algas e protozoários representam somente 7% e 2%, respectivamente (Alongi, 1988).
Do ponto de vista ecológico, os manguezais apresentam condições propícias para alimentação, proteção e reprodução de muitas espécies de animais aquáticos, que necessitam dessas áreas para se reproduzirem durante o seu ciclo biológico e desenvolverem diferentes fases larvais das suas respectivas proles (Correia, 2005). Por essas características, os manguezais são considerados áreas de preservação permanente e verdadeiros santuários ecológicos, abrigando a maior biodiversidade em termos de reprodução de espécies. Mesmo sendo uma Área de Preservação Permanente (Lei 4771 de 15 de setembro de 1965 do código florestal), os manguezais têm sofrido diversas ações antrópicas, com a finalidade de exploração econômica, agrícola, de pesca predatória e depósito de lixo, dentre outras. Foi observado que nos últimos 20 anos, aproximadamente 50% dos manguezais existentes no mundo vêm sendo destruídos por diversos fatores, como exploração de madeira, cultivo de crustáceos e o desenvolvimento urbano. Holguin et al. (2007) sugerem que pela taxa anual de destruição os manguezais desaparecerão em aproximadamente 50 anos. Segundo Oliveira & Ribeiro Netto (1989), no litoral sudeste, os manguezais ainda existentes são frequentemente atingidos por vazamentos de petróleo, dejetos, metais pesados, esgotos, depósito de lixo urbano-industrial e desmatamento para a implantação de indústrias e domicílios. Ainda, os manguezais do estado de São Paulo vêm sofrendo grande depreciação, sendo alvo de constante pressão sócio-econômica, dentre elas a construção de aterros para edificação de marinas, condomínios náuticos e loteamentos, e o depósito de dejetos, esgotos e produtos químicos diversos.
Embora as pesquisas sobre comunidades microbianas e suas funções nos manguezais ainda sejam escassos, dados recentes levantados da literatura vêm demonstrando a grande diversidade microbiana presente neste ecossistema, e o potencial do seu arsenal enzimático para exploração na busca de novos biocatalisadores e metabólitos bioativos a serem empregados em processos industriais e biotecnológicos economica e ambientalmente mais sustentáveis (Dias et al. 2009; Andreote et al. 2009; Taketani et al. 2010; Andreote et al. 2012)
6 2.2. Os biossurfactantes
Compostos bioativos são metabólitos sintetizados pelas células que apresentam inúmeras atividades tanto na célula produtora como em organismos alvos. Atualmente, existe um grande interesse por conhecer novos metabólitos que consigam atender a necessidades básicas, como vencer a resistência de patógenos aos antibióticos clínicos, superar a resistência de células cancerígenas aos diversos tratamentos quimioterápicos, assim como desenvolver novos medicamentos capazes de bloquear a produção de colesterol, osteoporose e doenças respiratórias. Na indústria de papel, de etanol de segunda geração, na produção de plásticos biodegradáveis, detergentes e emulsificantes, a obtenção de enzimas com atividades diferenciadas também é uma prioridade (Xu, 2006).
Até hoje, a grande maioria de moléculas utilizadas pelo homem foi descoberta a partir de micro-organismos do solo e, eventualmente, de plantas e micro-organismos associados (endofíticos) (Anderson & Wellington, 2001). O conhecimento sobre certos tipos de habitat, como manguezais, é quase nulo. Estudos iniciais mostram uma população de micro-organismos muito bem adaptada a suas condições peculiares, mas desconhecida quanto ao seu potencial de produção de compostos bioativos (Andreote et al. 2012).
Entre os vários metabólitos bioativos produzidos por bactérias, os biossurfactantes e os bioemulsificantes são de grande importância devido à diversidade estrutural e funcional e aplicações industriais (Banat et al. 2000; Rodrigues et al. 2006).
Os surfactantes, tanto de origem biológica quanto de origem química, são compostos anfifílicos que se acumulam na interface, tendo como característica principal a diminuição da tensão superficial e interfacial. Os emulsificantes pertencem a uma sub-classe dos surfactantes que têm como característica a emulsificação, ou seja, o processo que agrega estruturas em forma de micelas. Devido a essas propriedades, os surfactantes estabilizam dispersões de um líquido em outro, como por exemplo, emulsões óleo-água (Ron & Rosenberg, 2001; van Hamme et al. 2006).
Os micro-organismos são responsáveis pela produção de grande variedade de biossurfactantes, como glicolipídios, lipopeptídios e lipoproteínas, ácidos graxos, lipídios neutros, fosfolipídios e biossurfactantes poliméricos. Devido à grande variedade de biosurfactentes produzidos por micro-organismos, estes compostos foram classificados de acordo com sua composição química, peso molecular, propriedades fisico-químicas e modo de ação. De maneira mais ampla, os biossurfactantes são divididos em duas classes: os de baixo peso molecular e os de alto peso molecular (Rosenberg & Ron, 1999; Pacwa-Plociniczak et al. 2011), descritos abaixo.
7 Biossurfactantes de baixo peso molecular
Os biossurfactantes de baixo peso molecular são geralmente os glicolipídios, fosfolipídios e os lipopeptídios. A característica principal dessa classe de surfactantes é que eles são extremamente eficientes na redução da tensão superficial, entretanto não são bons emulsificantes.
Dentre os glicolipídios, o ramnolipídio é amplamente estudado. Ele é comumente produzido por Pseudomonas aeruginosa e composto por uma ou duas unidades de ramnose ligadas por uma ou duas caudas de ácido hidroxidodecanóico, sendo que o tamanho dessa cauda pode variar de 8 a 16 carbonos. A bactéria Burkholderia plantarii também é conhecida por produzir um ramnolipídio incomum, contendo três caudas de ácido hidroxidodecanóico (Hörmann et al. 2010). Os ramnolipídios são eficientes na na redução da tensão superficial, e confere vantagem ao micro-organismo uma vez que possuem uma ampla atividade antimicrobiana (van Delden et al. 1998).
Outro grupo bastante estudado dentro da classe dos biossurfactantes de baixo peso molecular são os lipopeptídios, tendo como principal representante a surfactina, embora a itaurina e a liquesina também façam parte dessa classe. Esses compostos são produzidos por espécies de Bacillus como metabólito secundário através da via não-ribossomal (NRPS). A biossíntese desses compostos envolve um complexo multienzimático conhecido por peptídio sintase. A surfactina é o biossurfactante mais estudado dessa classe. É um lipopeptídio cíclico com uma cadeia fechada e uma cauda de ácido graxo produzido por Bacillus subtilis e tem sido reportado como o biossurfactante mais eficiente descrito até hoje (Nakano et al. 1992).
Biossurfactantes de alto peso molecular
Os surfactantes de alto peso molecular são produzidos por grande número de espécies bacterianas e são compostos de polissacarídios, proteínas, lipopolissacarídios, lipoproteínas ou uma mistura complexa desses biopolímeros. Essa classe de biossurfactantes não é tão efetiva na redução da tensão supercial, mas são muito eficientes na estabilização de emulsões. Esses bioemulsificantes apresentam uma considerável especificidade por determinados substratos. Por exemplo, alguns emulsificam eficientemente hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, entretanto não emulsificam compostos alifáticos puros, em outros casos, pode acontecer a emulsificação apenas de hidrocarbonetos de alto peso molecular (Ron & Rosenberg, 1999).
Nesse grupo, os bioemulsans produzidos por diferentes espécies de Acinetobacter são os mais estudados. Dentre eles, está o emulsan que é produzido por A. calcoaceticus RAG-1, que é um complexo
8 aniônico de heteropolissacarídio e proteínas. O emulsan é um emulsificante eficaz em baixas concentrações e possui uma especificidade por substrato – ele não emulsifica hidrocarbonetos alifáticos, aromáticos ou cíclicos puros, entretanto, ele emulsifica eficientemente hidrocarbonetos com a mistura de todos os compostos citados anteriormente (Ron & Rosenberg, 2001).
O alasan e o dispersan são bioemulsificantes produzidos por A. radioresistens e A. calcoaceticus A2 (Navon-Venezia et al. 1995), respectivamente. Ambos são complexos de polissacarídios aniônicos com massa molecular maior que 50 kDa (Ron & Rosenberg, 2001).
Genes envolvidos na síntese dos biossurfactantes
Embora as técnicas de biologia molecular tenham sido aprimoradas, ainda existem poucos estudos disponíveis na literatura elucidando as vias metabólicas responsáveis pela síntese de biossurfactante. O que se sabe é que existe uma enorme variedade funcional e estrutural envolvida neste processo. Na literatura existem estudos em nível molecular somente de dois biosurfactantes, os ramnolipídios e as surfactinas (Hsieh et al. 2004; Reis et al. 2011). Ambos são controlados por quorum sensing, ou seja, um sistema de comunicação bacteriana caracterizado pela secreção de moléculas sinalizadoras – autoindutores – dentro de uma população bacteriana as quais são responsáveis por comportamentos coordenados. O quorum sensing é um sistema regulatório encontrado na maioria das espécies bacterianas que controla diversos fatores e funções biológicas, como virulência, formação de biofilmes, bioluminescência e conjugação bacteriana (Williams & Camara, 2009).
A síntese de ramnolipídio em Pseudomonas aeruginosa é codificada pelo operon rhIAB (rhlA, rhlB, rhlR, rhlI) e alguns genes adicionais também são requeridos. Um desses genes é o rhlG (Campos-Garcia et al. 1998) que é homólogo ao gene fabG que codifica uma proteína transportadora redutase, necessária na síntese de ácidos graxos. Em P. aeruginosa são produzidos dois principais tipos de ramnolipídios: o monoramnolipídio, ramnosil-β-hidróxidecanoil-β-hidróxidecanoato (Rha-C10-C10) e o
diramnolipídio, ramnosil-ramnosil-β-hidróxidecanoil-β-hidróxidecanoato (Rha-Rha-C10-C10) (Deziel et al.
2003). A biossíntese do ramnolipídio ocorre através de reações sequenciais catalisadas pela enzima ramnosiltransferase. Os monoramnolipídios são sintetizados pela ação da ramnosiltransferase-1, a partir da timidina-difosfo-ramnose agindo como o dador e 3-hidroxi-decanoil-3-hidroxidecanoato agindo como o receptor. Os diramnolipídios são sintetizados pela ramnosiltransferase-2 a partir de timidina-difosfato-ramnose e mono-ramnolipídios. A produção desse biossurfactante ocorre durante a fase estácionaria de crescimento e está relacionada à limitação de nitrogênio para a célula. Estudos revelam que a regulação dos genes responsáveis pela biossíntese é feita pelo sistema de quorum sensing (Ochsner & Reiser,
9 1995). Existem dois sistemas convencionais de quorum sensing bem elucidados em P. aeruginosa, o las e o rhl. A sintases LasI e RhlI produzem homoserina lactona do tipo 3OC12-HSL e C4-HSL, respectivamente, que juntamente com seus reguladores transcripcionais, LasR e RHlR, regulam a transcrição de 5-10% de todo o genoma da P. aeruginosa (Dekimpe & Deziel, 2009). Um terceiro sistema de quorum sensing é formado pelo fator transcripcional PqsR, também chamado de MvfR (Cao et al, 2001), que é responsável por ativar o cluster de genes phnAB e pqsABCDE, ambos requeridos na produção de 4-hidroxi-2-alquilquinolonas (HAQs) e Pseudomonas quinolona sinal (PQS), esses genes influenciam a produção de alastase, piocianina, lectina e ramnolipídio (Diziel et al. 2005). A produção de ramnolipídio por P. aeruginosa tem se mostrado diretamente relacionada com o sistema de quorum sensing regulado pelo fator transcripcional RhlR. O RhlR age como um ativador do sistema rhlAB quando forma um complexo com C4-HSL e como repressor na ausência de um autoindutor. O gene rhlR é conhecido por ter quatro diferentes formas de transcrição (Medina et al, 2003a, Medina et al, 2003b). Em condições favoráveis, ou seja, em meio rico, a expressão do RhlR é dependente do LasR; entretanto, em condições de limitação de fosfato, a expressão do RhlR é regulada por múltiplos promotores através de diferentes ativadores transcripcionais, incluindo VfR, RhlR e o fator sigma σ54 (Jensen et al. 2006). Além disso, nos últimos anos têm sido relatados outros sistemas de quorum sensing que influenciam direta ou indiretamente a produção de biossurfactantes (Reis et al. 2011).
Em Bacillus subtilis a síntese de surfactina é regulada pelo operon SrfA, este com aproximadamente 25 kb. A biossíntese da surfactina também está diretamente relacionada ao quorum sensing. O operon SrfA é composto pelos genes srfAA, srfAB, srfAC e srfAD. O gene srfAA exerce uma função importante na biossíntese da surfactina, essa região do operon serve como template para enzima, enquanto o gene sfp localizado na região downstream do operon srfA codifica a enzima 4’-fosfopantoteinil transferase. Essa região contem o promotor srfA e duas ORFs, srfAA e srfAB, que codificam as enzimas surfactina sintase I e II (Tsuge et al. 2001; Hsieh et al. 2004). A srfAA codifica três aminoácidos com sítio ativo para Glu, Val e Leu, enquanto o srfAB sintetiza peptídios contendo domínios ativos em Val, Asp e D-Leu. O gene srfC contem região ativa para Leu e codifica a enzima tioesterase do tipo I que é responsável pela modificação terminal do peptídio. O terceiro locus dentro do operon srfA corresponde ao gene srfAB que é requerido para a síntese da surfactina. O gene srfB também é necessário para a expressão do srfA-lacZ e ele regula positivamente o operon srfA (Nakano & Zuber 1989; D’Souza et al. 1993). A biossíntese da surfactina é dependente dos níveis de transcrição do ComA (SrfAB), que em seguida é estimulada por SrfD e inicia do processo de síntese da surfactina. Entretanto, o mecanismo de liberação da surfactina no meio ainda é desconhecido. Existe uma suposição que pode
10 ocorrer uma difusão passiva da surfactina através da membrana da célula. Uma vez que a densidade celular atinge um nível alto, a proteína ComX que está acumulada no meio interage com as ligações de histidina quinase (ComP) e ComA age como regulador de resposta. Além disso, após a fosforilação de ComP, este fornece uma molécula de fosfato para a proteína ComA que então se liga ao promotor de srfA e a transcrição é iniciada (Nakano & Zuber 1989; Steller et al. 2004). O fator estimulante de competência (CSF) também é um peptídio sinal que influencia a expressão de srf. O CSF é transportado através da membrana e interage com pelo menos dois diferentes receptores intracelulares, dependendo de sua concentração. Além de todas as proteínas, ComR e SinR também estão envolvidas na expressão de sfrA (Cosmina et al. 1993; D’Souza et al. 1993).
Os biossurfactantes poliméricos de alto peso molecular são mais complexos do que os de baixo peso molecular. A síntese desses heteropolissacarídeos requer um grande número de genes e sua organização genética torna-se mais complexa do que os outros tipos. O bioemulsificante desta categoria mais bem estudado é um tipo produzido por Acinetobacter calcoaceticus BD4. Os genes responsáveis pela produção deste estão organizados em um conjunto de genes com tamanho em torno de 60 kb e a biossíntese do EPS é mediada por proteínas do tipo Ptk (proteína tirosina quinase) (Ron & Rosenberg, 2001).
2.3. Aplicação industrial dos biossurfactantes
Os surfactantes pertencem a uma classe de produtos químicos muito versátil, resultando em diversas aplicações industriais (Singh et al. 2007; Makkar et al. 2011). Van Bogaert e colaboradores estimaram que em 2007 a produção mundial de biossurfactante foi em torno de 10 milhões de toneladas (van Bogaert et al, 2007). No ano de 2000, a produção mundial de surfactantes totalizou entre 17 a 19 milhões de toneladas, com um crescimento previsto entre 3 a 4% por ano. Isso ocorre devido à crescente demanda em detergentes, setor que utiliza mais de 50% da produção de surfactantes. Entre os principais setores que utilizam surfactantes estão incluídos os detergentes para uso doméstico, produtos para uso pessoal (cosméticos, sabonetes, creme dentais), indústrias têxtil e petrolífera.
Os lipopeptídios cíclicos produzidos por espécies de Bacillus são muito utilizados como antibióticos. Entre eles, o mais importante é a surfactina por sua diversidade e aplicação na indústria de petróleo. A surfactina produzida por B. subtilis (98% pureza) é vendida pela empresa Sigma-Aldrich a um valor de aproximadamente 295 dólares um frasco com 10 mg. Os ramnolipídios produzidos por P. aeruginosa são comercializados pela empresa Jeneil Biotech Inc., EUA, e são utilizados principalmente
11 na agricultura como fungicida e como aditivos para melhorar a atividade de biorremediação. Algumas linhagens bacterianas já estão sendo utilizadas nas indústrias para a produção de biossurfactante, com a principal finalidade de uso na biorremediação de áreas contaminadas por óleo. Dentre as linhagens utilizadas estão: P. aeruginosa S2 para a produção de ramnolipídio utilizado em biorremediação (Chen et al. 2007), B. subtilis ZW-3 para a produção de surfactina com aplicações na indústria farmacêutica, cosmética, alimentícia, proteção ambiental e recuperação de petróleo (Wang et al. 2008), Micrococcus luteus BN56 que produz trealose tetraester para ser utilizado em biorremediação (Tuleva et al. 2009), dentre outras. O aprimoramento nos procedimentos de produção e a tecnologia tem ajudado no processo de obtenção do biossurfactante (Makkar et al. 2011).
A maioria de todo o surfactante atualmente em uso é produzida quimicamente, sendo derivado do petróleo. Entretanto, na última década, a produção de surfactantes por micro-organismos tem sido objeto de muitos estudos. Os surfactantes microbianos apresentam algumas vantagens de obtenção quando comparados aos surfactantes sintéticos. Dentre elas, podemos citar: grande versatilidade dos micro-organismos para sintetizar polissacarídeos neutros ou com cargas, com uma grande variedade de composição e propriedades funcionais, fonte de produção renovável e inesgotável, produção independente de condições climáticas, possibilidade de utilização de resíduos industriais como matérias-primas, maior rapidez na obtenção do produto acabado e produção em espaço relativamente pequeno. Além disso, apresentam maior uniformidade em suas propriedades físico-químicas, devido à especificidade do micro-organismo utilizado e à possibilidade de um rígido controle dos parâmetros de cultivo, como pH, temperatura, taxa de aeração, velocidade de agitação, tempo de crescimento do micro-organismo e composição do meio de cultura. Outro aspecto positivo é a possibilidade de manipular geneticamente os micro-organismos, produzindo polissacarídeos em maior quantidade e de melhores propriedades funcionais (Mukherjee et al. 2006; Cameotra & Makkar, 2010).
2.3.1. Aplicação do biossurfactante em indústria de petróleo Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR)
As tecnologias atuais de recuperação de petróleo recuperam no máximo 40-45% do óleo presente no reservatório. Em geral, os métodos tradicionais de recuperação envolvem duas etapas: a recuperação primária, que é o resultado da pressão natural da terra sobre a formação petrolífera, e a recuperação secundária, que envolve a estimulação de poços de petróleo pela injeção de fluidos, o que contribui para melhorar o fluxo de petróleo e gás à cabeça do poço (Sen, 2008). No entanto, mesmo
12 com a aplicação da recuperação secundária estima-se que dois terços do óleo residual permaneçam retidos no reservatório. No intuito de minimizar as perdas econômicas, outras medidas vêm sendo adotadas para este fim, como a recuperação terciária, a qual inclui o uso de métodos químicos, tais como injeção de polímeros, surfactantes e fluidos alcalinos, e até mesmo recursos térmicos, como injeção de vapor ou combustão in situ (Brown, 2010). Quando é feita a injeção de água como fluido, o processo é chamado water-flooding. A injeção de gás natural, a qual é uma opção dispendiosa, é chamada de pressure maintenance. Outras técnicas físicas e mecânicas também são utlizadas nese processo, como a utilização de bombas. Enquanto o processo primário recupera 5-10% de pretróleo, a eficiência da recuperação secundária é em torno de 10-40%. Com a intenção de melhorar ainda mais a recuperação do petróleo, algumas tecnologias vêm sendo desenvolvidas e aprimoradas, como a recuperação avançada utilizando micro-organismos - Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR).
Os pioneiros a estudarem e proporem essa tecnologia foi um grupo de pesquisa americano conduzido por Claude ZoBell na década de 30. Nas décadas de 60 e 70, muitos países do leste europeu, como Hungria e Polônia, realizaram ensaios de campo utilizando MEOR, e esses ensaios foram baseados na injeção de consórcios de bactérias facultativas e anaeróbias, selecionadas com base em sua capacidade de gerar grandes quantidades de gases, ácidos, solventes, polímeros, surfactantes e biomassa. Em meados da década de 80, iniciaram muitos estudos de aplicação de MEOR, sendo que uma infinidade de indústrias petrolíferas começou a utilizar consórcios bacterianos para injeção nos poços de petróleo. A tecnologia se mostrou muito promissora, mas também se mostrou ineficaz em alguns casos (Brown, 2010; Volk & Liu, 2010).
Existem três estratégias diferentes para a utilização de MEOR: i) produção do biossurfactante em reatores e posterior aplicação no reservatório; ii) injeção de micro-organismos exógenos para a produção de biossurfactante in situ e iii) injeção de nutrientes no reservatório para estimular a microbiota a produzir biossurfactantes (Singh et al. 2007). O maior obstáculo para implementação da tecnologia de MEOR no caso da injeção de micro-organismos nos reservatórios tem sido a dificuldade de isolamento e/ou manipulação genética de micro-organismos que sobrevivam em ambientes extremos, bem como alta pressão, temperaturas acima de 85°C, pH extremo e alta salinidade (Sen, 2008; Brown, 2010). Pesquisas em engenharia genética já estão sendo realizadas a fim de desenvolver micro-organismos que sobrevivam e sejam metabolicamente ativos em ambientes extremos, essa tecnologia é conhecida por Genetically engineered MEOR (GEMEOR) (Sen, 2008). Algumas espécies de Bacilus tem sido utilizadas para aplicação em reservatório de petróleo, essas linhagens aplicadas isoladamente
13 podem reduzir a viscosidade do petróleo (Bryant, 1990). Entretanto, o processo pode ser mais eficiente se for realizada a aplicação de um consórcio bacteriano. Esses consórcios podem contribuir para a recuperação de duas formas: i) crescendo nas rochas do reservatório e produzindo gases, biossurfactantes, biopolímeros e outros compostos não tóxicos, auxiliando assim a recuperação; e ii) crescendo nos canais das rochas e aumentando a permeabilidade, favorecendo o processo de recuperação (Brown, 2010; McInerney et al. 2005). O sucesso do MEOR in situ depende do desenvolvimento do consórcio microbiano, ou seja, se consegue sobreviver e produzir metabólitos ativos em ambientes extremos como os reservatórios. Então, as atividades em pesquisa tem focado em bactérias anaeróbias extremófilas, incluindo halofílicas, barofílicas e termofílicas (Tango & Islam 2002; Almeida et al. 2004).
Outra forma de MEOR é a injeção de nutrientes no reservatório para estimular a microbiota endógena à produção de metabótitos de interesse. Alguns reservatórios requerem nutrientes inorgânicos para o crescimento celular ou como aceptores de elétrons no lugar do oxigênio (Sundae & Torsvik, 2004). Já foi patenteada a técnica de injeção de água contendo fontes de vitaminas, fosfatos, nitratos para auxiliar o crescimento das bactérias anaeróbias sendo a principal fonte de carbono o próprio óleo de reservatório (Sunde, 1992).
O método mais promissor para o MEOR é a utilização do biossurfactante produzido ex situ e então aplicado no reservatório. Quando a solução entra em contato com as pequenas bolhas de óleo aprisionadas nos poros das rochas, a tensão interfacial é drasticamente reduzida aumentando a remoção do óleo por capilaridade. A formação da emulsão óleo em água geralmente aumenta a eficiência na mobilidade do óleo nas rochas. Os biossurfactantes que apresentam os melhores resultados na aplicação são os ramnolipídios, soforolipídios, glicolipídios e os lipopeptídios. Em uma extensa revisão feita por Sen (2008) mostrou que muitos estudos, em escala laboratorial, tem sido realizados com glicopeptídos produzidos por espécies de Pseudomonas, bem como a surfactina e liquenisina, os lipopolissacarídios, representados pelo emulsan, tem apresentado resultados satisfatórios. Mas a surfactina tem apresentado os melhores resultados, ela tem sido produzida em fermentadores com rigorosos padrões de crescimentos e aplicada com muito sucesso em MEOR (Sen 2008). O bioprocesso desenvolvido para a produção de surfactina é dividido em três etapas: i) otimização dos fatores nutricionais para o crescimento do micro-organismo; ii) otimização de parâmetros físicos, incluindo pH, tempetatura e aeração e iii) otimização da concentração de inóculo. Geralmente os biossurfactantes produzidos ex situ são injetados juntamente com água para facilitar a
14 emulsificação do óleo (Sen 1997, Sen & Swaminathan 1997; Sen & Swaminathan 2004; Sen & Swaminathan 2005).
Biorremediação
A contaminação causada por atividades industriais, sendo ela acidental ou por liberação de resíduos tóxicos orgânicos e/ou inorgânicos tem sido um problema de âmbito mundial. Tais contaminantes causam dificuldades na remediação, uma vez que se ligam às partículas do solo. A aplicação de biossurfactantes na remediação de compostos ôrganicos, como hidrocarbonetos, tem como objetivo a aceleração de processos biodegradativos naturais em ambientes contaminados, melhorando a disponibilidade de materiais (nutrientes e oxigênio), das condições (pH e teor de umidade), e dos micro-organismos já existentes no ambiente. A aplicação de biossurfactante na remediação de compostos inorgânicos, como metais pesados, visa quelar e remover ions durante o processo de lavagem facilitando as intereções de moléculas anfifílicas e os íons de metais.
A biorremediação de petróleo e derivados é realizada por micro-organismos capazes de utilizar hidrocarbonetos como fonte de energia e de carbono. Esses micro-organismos são ubíquos na natureza e são capazes de degradar diversos hidrocarbonetos – de cadeia curta ou longa, assim como numerosos compostos aromáticos, incluindo hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PHAs). Todos esses compostos possuem uma baixa solubilidade em água e podem estar solubilizados na fase aquosa, adsorvidos às partículas do solo, adsorvidos na superfície das células ou na fase insolúvel. O biossurfactante adicionado ao meio pode interagir tanto com as partículas abióticas como com as células bacterianas. Isso, aliado ao fato de que o primeiro passo na degradação de hidrocarbonetos implica na atividade de uma oxigenase ligada à membrana, é essencial para que as bactérias entrem em contato direto com o substrato. A emulsificação é uma estratégia biológica que pode aumentar o contato entre os micro-organismos e os hidrocarbonetos insolúveis em água. Portanto, bactérias que crescem em ambientes com petróleo geralmente produzem potentes emulsificantes (Rosenberg, 1993).
2.4. Metagenômica aplicada à Microbiologia
Durante muito tempo a única forma de se estudar os micro-organismos era através do isolamento de culturas puras, sendo este o primeiro passo para o estudo do metabolismo bacteriano. O cultivo de bactérias serviu de base para o conhecimento da fisiologia e genética microbiana até meados da década de 80 (Handelsman, 2004). No entanto, estudos de diversidade microbiana, utilizando
15 técnicas de microscopia e contagem de células, mostraram que métodos tradicionais de isolamento e cultivo são capazes de recuperar apenas uma pequena fração (1 a 10%) dos micro-organismos presentes no ambiente (Amman et al. 1995). Isto é decorrente das limitações de técnicas de cultivo, uma vez que é muito difícil reproduzir em laboratório as condições encontradas no meio ambiente.
Nas últimas décadas, muitas metodologias foram desenvolvidas na área de biologia molecular (extração de ácidos nucleicos, amplificação por PCR, clonagem e sequenciamento de DNA), superando limitações impostas pela abordagem clássica de estudo de populações microbianas, evitando o isolamento e cultivo dos micro-organismos. A utilização destas metodologias vem permitindo uma mudança drástica na perspectiva da diversidade microbiana no ambiente, com a descoberta de novos grupos de organismos nunca antes cultivados (Hugenholtz et al., 1998; Rappé & Giovannoni, 2003). Entretanto, estas metodologias não nos permitem ter acesso ao potencial metabólico destes novos organismos, uma vez que as etapas de isolamento e cultivo são suprimidas nos estudos.
Porém, o uso dessas metodologias associado à estratégia de construção de bibliotecas metagenômicas permite o acesso ao potencial metabólico de novos organismos, sendo uma alternativa viável para a descoberta de novas enzimas e vias metabólicas (Handelsman, 2004).
As bibliotecas metagenômicas permitem ainda combinar o escrutínio de genes funcionais com a análise de sequências de rRNA 16S, representando um mecanismo valioso no estabelecimento de relações entre filogenia e função, podendo também ajudar a elucidar o papel ecológico dos componentes da microbiota no ambiente.
A estratégia de bibliotecas metagenômicas consiste na clonagem de fragmentos grandes de DNA (40 a 200 kb), que podem corresponder a um operon ou mesmo a uma via metabólica inteira, em vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosome), cosmídios ou fosmídios, e transformação da bactéria hospedeira, geralmente Escherichia coli, com subsequente análise das bibliotecas resultantes em busca da expressão da atividade biológica de interesse (Rondon et al., 2000; Singh, 2009).
A triagem de bibliotecas metagenômicas pode ser baseada na sequência de DNA ou na análise da expressão biológica. Esta última estratégia, conhecida por análise funcional, tem a vantagem de permitir o acesso a genes ainda não conhecidos, oferecendo grande potencial para identificar novas classes gênicas ou ainda funções não conhecidas. O método de triagem baseado em sequencia de DNA é mais conservador, uma vez que os oligonucleotídeos (sequências curtas de DNA) necessários para identificar os genes-alvo, utilizando PCR ou métodos de hibridização, são desenhados com base em
16 regiões conservadas das sequências de aminoácidos de proteínas conhecidas, de maneira a garantir uma alta probabilidade de pareamento com sequências gênicas desconhecidas presentes no ambiente.
A viabilização das bibliotecas metagenômicas como um método para seleção de novos compostos de interesse só é possível, no entanto, quando uma abordagem integrada é usada, combinando metodologias de triagem de alto desempenho (high-throughput) recém-desenvolvidas, como ensaios enzimáticos miniaturizados (em microplacas) associados a leitores de placa e tecnologia de hibridização em microarrays de DNA, com sequenciamento em larga escala e a bioinformática. Esta última envolve o desenvolvimento e o emprego de bases de dados e programas de análise de sequências de DNA e proteínas para acelerar a análise funcional e comparativa dos genes ou operons clonados (Oliveira et al., 2006).
Neste contexto, bibliotecas metagenômicas surgem como uma ferramenta poderosa para acessar de maneira mais abrangente a diversidade microbiana total em um dado ambiente, permitindo a análise de genes funcionais de membros da microbiota, principalmente de micro-organismos não-cultivados, e a descoberta de novos produtos naturais. Aliado a isto, a prospecção da diversidade microbiana em ambientes inóspitos, extremos e/ou pouco explorados, como no caso de manguezais, potencializa as chances de sucesso na busca por novas moléculas bioativas, contribuindo para o desenvolvimento industrial e econômico mais sustentável (Lorenz & Eck, 2005).
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