Prospecção de biossurfactantes em biblioteca metagenômica de
sedimento de manguezal
24 1. INTRODUÇÃO
Mais recentemente, com o aumento da consciência ambiental e ênfase em uma sociedade sustentável em harmonia com o meio ambiente, os surfactantes naturais têm atraído mais a atenção que os surfactantes químicos. Dentre os surfactantes naturais, aqueles produzidos por micro- organismos, conhecidos como biossurfactantes, são os mais promissores. Eles são conhecidos por serem estruturalmente diversos e terem grupos de moléculas tenso-ativas heterogêneas. Considerando a variedade de aplicações dos biossurfactantes, suas propriedades bioquímicas e fisiológicas têm sido foco de muitos estudos (Ron & Rosenberg 2001).
Durante muitos anos, a biotecnologia microbiana foi limitada à descoberta de metabólitos ativos produzidos por micro-organismos cultivados, entretanto estima-se que a fração cultivada da diversidade microbiana é de 1-10% (Amman et al. 1995). Portanto, a maior fração ainda não foi estudada, consequentemente os metabólitos ainda não são conhecidos. Com a evolução de técnicas moleculares, o avanço das plataformas de sequenciamento e as poderosas ferramentas de bioinformática, a metagenômica oferece uma alternativa para permitir o acesso ao arsenal metabólico, sem que que haja a necessidade de cultivar o micro-organismo. Como mencionado pela primeira vez, o termo “metagenômica” refere-se ao conjunto de todos os genomas de uma comunidade microbiana (Handelsman et al. 1998).
O primeiro passo para a construção de uma biblioteca metagenômica é a obtenção do DNA total da comunidade microbiana. Esse passo é crucial para a construção da biblioteca, uma vez que a obtanção de um DNA livre de contaminantes facilita as etapas subsequentes de biologia molecular (Smalla et al. 1993; Tsai et al. 1992). O tamanho do fragmento do DNA também é importante, bibliotecas metagenômicas construídas a partir de DNA de alto peso molecular tem mais chance de conter vias metabólicas completas.
Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi a construção de biblioteca metagenômica de DNA de alto peso molecular proveniente de sedimento de manguezal contaminado com petróleo e subsequente triagem de vias metabólicas de biossurfactantes.
25 2. OBJETIVOS
Construção de biblioteca metagenômica de sedimento de manguezal em vetor fosmidial;
Screening molecular e funcional visando a bioprospecção de biossurfactantes;
Sequenciamento dos clones fosmidiais de interesse (positivos nos ensaios de triagem) para análises de genômica estrutural dos genes que codificam biossurfactantes;
Clonagem dos genes envolvidos na síntese de biossurfactantes em vetores de expressão apropriados visando à purificação e caracterização química e funcional dos produtos gênicos.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta do sedimento de manguezal
A coleta das amostras foi realizada pela equipe técnica da Embrapa Meio Ambiente, no âmbito do Projeto “Biodiversidade e Atividades Funcionais de Micro-organismos de Manguezais do Estado de São Paulo” (Processo FAPESP no 04/13910-6). Amostras de sedimentos foram coletadas de área de manguezal altamente impactado localizado no município de Bertioga – SP (Figura 2). Foram coletadas amostras em triplicata, usando tubos de polipropileno esterilizados, os quais foram totalmente preenchidos com o sedimento para evitar a entrada de ar. As amostras foram imediatamente congeladas em gelo seco e transportadas ao laboratório para subsequente extração de DNA.
26 Figura 2. Localização do manguezal e esquema de amostragem. A linha vermelha indica o ponto em que a amostra do sedimento foi coletada. (Fonte: Andreote et al. 2012)
3.2. Extração de DNA de alto peso molecular de sedimento de manguezal
Vários protocolos foram testados a fim de padronizar e otimizar a extração de DNA de alto peso molecular a partir de amostras de sedimento, os quais são descritos abaixo.
3.2.1. Extração pelo kit PowerSoil® DNA Isolation (MoBio Laboratories, Inc.)
A extração de DNA de amostras de sedimento do mangue através do PowerSoil® DNA Isolation kit foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.
3.2.2. Extração pelo kit PowerMax® Soil DNA Isolation (MoBio Laboratories, Inc.)
A extração de DNA de amostras de sedimento do mangue foi também realizada utilizando o kit PowerMax® Soil DNA Isolation, de acordo com as instruções do fabricante e modificações sugeridas por Sommer et al. (2010).
A extração foi realizada de acordo com o fabricante até o passo em que houve a passagem do DNA pela coluna de purificação. A eluição foi realizada com 7,5 mL de Tris 10 mM pH 8,0. Para a precipitação do DNA foi utilizado 0,1 volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e dois volumes de etanol absoluto gelado e, a seguir, a solução foi incubada por duas horas a -20°C. Após a incubação, o material foi centrifugado a 5.000 rpm por 45 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi eluído
27 em 500 µL de Tris 10 mM pH 8,0. Para que o DNA fosse completamente eluído, os tubos foram incubados a 65°C por 1 hora.
3.2.3. Extração pelo método CTAB-SDS
O protocolo de extração de DNA de alto peso molecular foi realizado também de acordo com Ghosh et al. (2010), com modificações. Um grama de sedimento foi misturado a 2,7 mL de tampão de extração (100 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 100 mM Na2EDTA [pH 8,0]; 100 mM Na2HPO4 [pH 8,0]; 1,5 M NaCl;
1% CTAB) e 10 µL de proteinase K (20 mg/mL), e incubado por 30 minutos a 37°C sob agitação de 225 rpm. Feito isso, foram adicionados 300 µL de SDS 20%, e a reação foi incubada novamente por 2 horas a 65°C sob agitação de 50 rpm. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 6.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, ao qual foram adicionados 900 µL de tampão de extração e 100 µL de SDS 20%, seguido de incubação a 65°C por 10 minutos. Após a incubação, os tubos foram centrifugados a 6.000 rpm por 10 minutos. Esse procedimento foi repetido por duas vezes. Após a obtenção do sobrenadante, foi adicionado igual volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). A separação das fases foi realizada por centrifugação a 8.000 rpm por 5 minutos. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e o DNA foi precipitado com 0,6 volume de isopropanol e, a seguir, incubado overnight em temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm por 20 minutos e o sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado com 5 mL de etanol 70% e eluído em Tris- HCl 10 mM pH 8,0.
3.2.4. Extração por Freeze-Thaw
A extração de DNA pelo método Freeze-Thaw foi realizada utilizando uma combinação dos protocolos descritos por Groβkopf . (1998) e Neria-Gonzáles . (2006), com modificações.
Foi adicionado em um microtubo 0,5 g de sedimento de manguezal, o qual foi lavado duas vezes com tampão PBS. Feito isso, foram adicionados 600 µL de tampão PBS e lisozima na concentração final de 17 mg/mL, incubando-se a 37°C por 30 minutos. Posteriormente, foi adicionada à solução proteinase K na concentração final de 0,7 mg/mL e SDS na concentração final de 2%, seguido de incubação a 60°C por 30 minutos. Em seguida, foram realizados três ciclos de 2 minutos cada de incubação em nitrogênio líquido e banho-maria a 65°C. Após a lise mecânica da parede celular pelo ciclo de Freeze-Thaw, foi realizada a limpeza com igual volume de fenol (pH 8,0) e, posteriormente, a centrifugação a 13.000 rpm
28 por 5 minutos. A fase superior da solução foi transferida para um novo tubo, adicionado de igual volume de clorofórmio:álcool isolamílico (24:1) e centrifugada a 13.000 rpm por 5 minutos. A fase superior dessa solução foi novamente transferida para um novo tubo e o DNA foi precipitado com 10% do volume de NaCl 5 M e com duas vezes o volume de etanol absoluto gelado, e incubado overnight a - 20°C. A solução contendo o DNA precipitado foi centrifugada a 13.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado duas vezes com etanol 70%, seco e eluído em 50 µL de água Milli-Q.
3.3. Eletroforese
Para analisar a concentração do DNA obtido, foi realizada a eletroforese em gel de agarose 0,8% em tampão TEB (Tris-EDTA – Ácido bórico) 1 X corado com brometo de etídio a 0,01%.
3.4. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Para analisar com precisão o tamanho dos fragmentos de DNA previamente extraídos, foi realizada a Eletroforese em Campo Pulsado utilizando o equipamento Pulsed-field CHEF III (BIORAD).
Cinco microlitros do DNA extraído foram misturados em 3 µL de tampão de corrida e aplicados em gel de agarose low-melting 1% (BioRad) em TEB 0,5 X. Foi utilizado como padrão de peso molecular o High MW DNA Marker (InvitrogenTM). Para a corrida, foram utilizados os seguintes parâmetros: 9 volts; swich time inicial e final de 0,5; ângulo de 120°; 12°C de temperatura e 5 horas de corrida.
3.5. PCR do gene RNAr 16S
Foi realizada a amplificação por PCR do gene RNAr 16S para verificar a qualidade do DNA extraído. Para a realização das reações de amplificação, foram utilizados os primers e reagentes nas seguintes concentrações: tampão 1x (Invitrogen), MgCl2 50 mM (Invitrogen), 0,5 μM de cada um dos
primers 1100r (AGGGTTGCGCTCGTTG) e 10f (GAGTTTGATCCTGGCTCAG), 0,2 mM de dNTPs, 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 1 μL do DNA diluído 1:10, 1:100 e puro. As condições de amplificação consistiram dos seguintes ciclos de temperatura: 94°C por 2 min, 30 ciclos de 94°C por 1 min, 55°C por 1 min e 72°C por 3 min, e uma extensão final de 72°C por 3 min.
29 3.6. Construção da biblioteca metagenômica de sedimento do mangue
A construção da biblioteca metagenômica foi realizada de acordo com as especificações do fabricante, com algumas modificações, utilizando o kit CopyControl™ Fosmid Library Production Kit (Epicentre® Biotechnologies), conforme as etapas detalhadas abaixo.
3.6.1. Seleção de fragmentos de DNA de alto peso molecular
Para a seleção de fragmentos de DNA de alto peso molecular foi realizada nova eletroforese em PFGE nas mesmas condições citadas no item 3.4. Entretanto, o DNA foi concentrado no Concentrator plus (Eppendorf) e todo o volume obtido ( 20 g) foi aplicado em gel de agarose low-melting point 1% (BioRad) em tampão TAE (Tris-EDTA – Ácido acético) 0,5 x. O tampão de corrida do PFGE foi trocado por TAE uma vez que o ácido bórico inibe a ação da enzima utilizada nas etapas posteriores.
3.6.2. Purificação dos fragmentos de DNA de alto peso molecular
Após a seleção dos fragmentos de interesse, foi realizada a excisão do DNA do gel de agarose com o auxílio de um bisturi, e então iniciado o processo de purificação.
Pequenas porções da agarose contendo o DNA de tamanho desejado foram pesadas, colocadas em microtubos e aquecidas a 70°C por 10-15 minutos. Após completo derretimento da agarose, os tubos foram transferidos para banho-maria a 45°C, adicionados de volume adequado de GELase 50 X Buffer pré-aquecido para a concentração final de 1 X e homogeneizados delicadamente. Em seguida, foi adicionada 1 U da enzima GELase para cada 100 mg de gel e os tubos foram incubados a 45°C por 1 hora. Para a inativação da enzima, os tubos foram transferidos para banho-maria a 70°C por 10 minutos. Alíquotas de 500 µL da solução foram adicionadas em novos tubos esterilizados de 1,5 mL e resfriados em gelo por 5 minutos. Posteriormente, foi realizada a centrifugação a 10.000 rpm por 20 minutos e 90- 95% do sobrenadante foi recolhido cuidadosamente em um novo tubo esterilizado.
A seguir, foi realizada a precipitação do DNA adicionando 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M (pH 7,0) e 2,5 volumes de etanol absoluto, e a solução foi homogeneizada por inversão. Os tubos foram incubados por 10 minutos em temperatura ambiente e posteriormente centrifugados a 10.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet lavado duas vezes com etanol 70%
30 gelado. Após a segunda lavagem, o pellet foi seco em temperatura ambiente e o DNA suspenso em 53 µL de água ultra-pura estéril.
Para determinar a concentração de DNA, foi realizada a eletroforese utilizando 1 µL do DNA em um gel de agarose 0,8% em tampão TEB 0,5 X. Como controle para a estimativa da concentração, foi utilizado o Fosmid Control DNA.
3.6.3. Reação de End-Repair
Para a reação de end-repair, todos os reagentes foram descongelados em gelo e a reação também foi realizada em banho de gelo. Para a montagem da reação, foram utilizados 52 µL de DNA (aproximadamente 10 µg de DNA), 8 µL do End-Repair Buffer 10X, 8 µL do dNTP Mix 2,5 mM, 8 µL de ATP 10 mM e 4 µL do End-Repair Enzyme Mix. A reação foi incubada por 45 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, para a inativação da enzima End-Repair Enzyme Mix, a reação foi levada ao banho-maria a 70°C por 10 minutos. Posteriormente, foi realizada a precipitação do DNA seguindo o mesmo procedimento descrito no item 3.6.2, entretanto, o DNA foi suspenso em 7 µL de água ultra- pura estéril.
Para determinar a concentração do DNA, foi realizada a eletroforese utilizando 1 µL do DNA em um gel de agarose 0,8% em tampão TEB 0,5 X. Como controle para a estimativa da concentração, foi utilizado o Fosmid Control DNA.
3.6.4. Reação de ligação
Para a reação de ligação, todos os reagentes foram descongelados em gelo e a reação também foi realizada em banho de gelo. Para a montagem da reação, foram utilizados 6 µL de DNA (aproximadamente 0,25 µg de DNA), 1 µL do Fast-Link Ligation Buffer 10X, 1 µL de ATP 10 mM, 1 µL do vetor CopyControl pCC2FOS (0,5 µg/mL) e 1 µL da enzima Fast-Link DNA Ligase. A reação foi incubada em termociclador a 16°C overnight. Em seguida, para a inativação da enzima Fast-Link DNA Ligase, a reação foi levada a banho-maria a 70°C por 10 minutos.
31 3.6.5. Empacotamento
A linhagem de E. coli EPI300-T1R utilizada como célula hospedeira na clonagem foi reativada em meio LA (Luria-Bertani Ágar) a 37°C por 18 horas. Então, foi realizado o pré-inóculo de uma única colônia da EPI300-T1R em 50 mL de meio LB + 10 mM de MgSO4 + 0,2% de maltose e incubado a 37°C por 18
horas sob agitação de 180 rpm.
Antes de iniciar a reação de empacotamento, 5 mL da cultura crescida no dia anterior foram inoculados em um novo tubo contendo 45 mL de meio LB + 10 mM de MgSO4 + 0,2% de maltose e o
cultivo foi incubado a 37°C sob agitação de 180 rpm até atingir a OD600 = 0,8 - 1,0.
Um tubo de Lambda Packaging Extracts foi descongelado em banho de gelo e metade do volume (25 µL) foi transferido para um novo microtubo esterilizado, sendo o restante do material novamente congelado a -70°C. No tubo contendo 25 µL do extrato de fagos foi adicionado o volume total (10 µL) da reação de ligação, seguido de incubação a 30°C por duas horas. Em seguida, o volume restante do Lambda Packaging Extracts foi novamente descongelado em gelo, adicionado ao tubo com a reação de empacotamento e incubado por mais duas horas a 30°C. Após a reação de empacotamento, foram adicionados 940 µL de Phage Dilution Buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,3]; 100 mM NaCl; 10 mM MgCl2) e
12,5 µg/mL de clorofórmio para precipitação de qualquer resíduo de proteína.
3.6.6. Transfecção
Após a obtenção da biblioteca (≈1 mL), foi realizada a transfecção na célula hospedeira EPI300- T1®. Alíquotas de 100 µL de células, previamente crescidas (DO600 = 0,8 - 1,0), foram distribuídas em
microtubos esterilizados e adicionadas de 10 µL da solução de fagos já empacotados. A reação foi incubada em banho-maria a 37°C por 1 hora.
Em seguida, a reação foi inoculada com o auxílio de alça de Drigalsky em meio LA acrescido de 12,5 µg/mL de cloranfenicol e incubada a 37°C por 18 horas.
3.6.7. Validação da biblioteca metagenômica
Para a validação da biblioteca, dez clones foram selecionados aleatoriamente. O DNA fosmidial foi extraído por lise alcalina (Sambrook et al. 1989) Aproximadamente, 500 ng de DNA fosmidial foram clivados com a enzima de restrição NotI e o padrão de digestão dos fosmídios foi visualizado em gel de
32 agarose 1%, utilizando-se cuba de eletroforese em campo pulsado (PFGE) (CHEF-DR III, BIORAD®) a 6 V cm-1, switch de 1-12 por 10 horas.
3.6.8. Preservação dos clones
Após o crescimento das colônias em meio LA, os clones foram repicados em placas de polietileno de 96 poços em meio de cultura HMFM (1,6% triptona; 1% extrato de levedura; 0,5% de NaCl; 8% Solução A [0,8 mM MgSO4 .7H2O; 3,4 mM citrato de sódio; 13,6 mM (NH4)SO4; 44% glicerol];
2% Solução B [0,66 M KH2PO4; 1,34 M K2HPO4]) e congelados em ultra-freezer -80°C.
3.7. Screening funcional dos clones 3.7.1. Colapso da gota
Para a realização dos ensaios de triagem de clones com atividade biossurfactante foi selecionada a metodologia descrita no trabalho de Bodour et al. (2003) e denominada “teste do colapso da gota”.
Alíquotas de 5 μL de petróleo foram colocadas em microplacas de fundo chato (96 poços), deixando- se por 24 horas à temperatura ambiente. Ao mesmo tempo, as culturas de clones foram repicadas em LB contendo cloranfenicol (12,5 μg/mL) e incubadas até 24 horas a 37°C sob agitação de 180 rpm. Após este período, as placas contendo as culturas dos clones foram centrifugadas a 3.600 rpm por 8 minutos e alíquotas de 5 μL do sobrenadante foram adicionadas ao petróleo com auxílio de micropipeta. Os resultados foram considerados positivos quando a gota entrou em colapso. O resultado foi considerado negativo para a atividade de biossurfactante quando a gota do permaneceu intacta na amostra. Esse ensaio baseia-se na desestabilização da gota pelo biossurfactante. Uma gota da suspensão celular ou sobrenadante da cultura são colocadas sobre uma superfície sólida revestida de óleo. Se a amostra não tiver biossurfactante, as moléculas polares da água são repelidas a partir da superfície hidrofóbica e as gotas permanecem estáveis. Se a amostra tiver biossurfactante a gota entra em colapso, uma vez que a tensão interfacial entre o líquido da gota e a superfície do óleo é reduzida (Jain et al. 1993).
33 3.7.2 Colapso da gota modificado
Inicialmente foi realizado o teste do colapso da gota com 4.800 clones, dos quais 1.122 foram positivos. Um novo teste foi realizado a fim de confirmar os resultados obtidos, entretanto com algumas modificações.
No primeiro ensaio, foi realizado um inóculo em microplacas com LB e então feito o teste. No novo ensaio, foi realizado o pré-inóculo em LB e posteriormente o inóculo em meio mineral (5 g extrato de levedura; 1 g (NH4)2SO4; 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4; 2,7 g NaCl; 0,6 g MgSO4 ∙7H2O, 1000 mL água
destilada). Ao meio pronto foi adicionado 0,1 % (v/v) de solução de micronutrientes [10,95 g ZnSO4∙
7H2O; 5 g FeSO4∙ 7H2O; 1,54 g MnSO4∙ 7H2O; 0,39 g CuSO4∙ 5H2O; 0,25 g Co(NO3)2 6H2O; 0,17 g Na2B4O7
10H2O]) (Oliveira et al., 2013) acrescido de 1% de glicerol, e a seguir as culturas foram crescidas a 37°C,
sob agitação de 150 rpm por 120 horas. Após este período, as placas contendo as culturas dos clones foram centrifugadas a 3.600 rpm por 8 minutos e alíquotas de 5 μL do sobrenadante foram adicionadas ao petróleo com auxílio de uma pipeta.
3.7.3. Tensiometria
O ensaio de tensiometria foi realizado a fim de confirmar a produção de biossurfactantes pelos clones que apresentaram resultados positivos no screening preliminar realizado pelo teste “colapso da gota”.
Algumas tentativas de padronização do teste de tensiometria foram realizadas. O primeiro teste foi realizado a fim de analisar a melhor fonte de carbono (hexadecano ou glicose) e também verificar a medida da tensão superficial após remoção química do hexadecano com hexano. Para este teste, foram utilizadas linhagens sabidamente produtoras de biossurfactantes, dentre elas: um pool de sete isolados previamente caracterizados por Reys (2009) e a Pseudomonas aeruginosa CBMAI 602. Também foi utilizada a linhagem hospedeira da biblioteca metagenômica (E. coli EPI-300) como controle negativo, e dois pools de 20 clones foram testados. Antes da incubação em meio mineral (2 g NaCl; 0,4 g K2HPO4;
0,4g KH2PO4; 0,4 g (NH4)2SO4; 0,08 g MgSO4∙7H2O; 1,2 g NaNO3; 1000mL H2O), foi realizado um pré-
inóculo das amostras em tubos Falcon contendo 40 mL de meio LB acrescido de 12,5 µg/mL de cloranfenicol e incubados por 24 horas a 37°C sob agitação de 180 rpm. Posteriormente, as amostras foram transferidas para frascos “SCHOTT” com 200 mL de meio LB e crescidas nas mesmas condições. Após o crescimento, as culturas foram centrifugadas a 8.000 rpm por 10 minutos e o pellet suspenso em
34 água ultra-pura. Alíquotas de 5 mL da suspensão de células ajustada na DO = 0,1 foram inoculadas em frascos Erlenmeyer com 50 mL de meio mineral acrescido de 12,5 μg/mL de cloranfenicol, 250 μL de solução de vitaminas e 0,5 % de hexadecano ou glicose como única fonte de carbono, e então as culturas foram incubadas por 10 dias a 37°C sob agitação de 180 rpm. Após o término do período da incubação, as culturas foram centrifugadas por 10 minutos a 8.000 rpm e 4°C. Uma alíquota de aproximadamente 25 mL, da cultura crescida com o hexadecano, foi removido utilizando hexano. Para tal procedimento, uma alíquota do sobrenadante livre de células foi colocada em um funil de separação e adicionada de mesmo volume de hexano. O material foi homogeneizado vigorosamente e a primeira fase foi coletada. Este procedimento foi repetido três vezes seguidas. O sobrenadante obtido foi avaliado em tensiômetro (Digital Tensiometer K10-ST – Krüss®) utilizando água destilada como padrão para calibrar o equipamento. Dezoito pools foram avaliados utilizando o método descrito acima usando o hexadecano (sem a remoção química) como fonte de carbono, entretanto no decorrer do experimento, foi observado que as replicatas não apresentavam boa reprodutibilidade e também que o hexadecano por si só alterava a tensão superficial do meio.
Com base nesta observação, um segundo teste foi proposto. Para esse teste, o inóculo foi realizado com o mesmo procedimento utilizado anteriormente. Entretanto, o hexadecano foi removido fisicamente por centrifugação a 0°C. O sobrenadante obtido foi avaliado em tensiômetro (Digital Tensiometer K10-ST – Krüss®), utilizando água destilada como padrão para calibrar o equipamento. Foram analisadas duas linhagens sabidamente produtoras de biossurfactantes (CBMAI 557 e CBMAI 602), um pool de isolados sabidamente produtores de biossurfactante e como controle negativo a E. coli EPI-300 (hospedeira da biblioteca metagenômica). Todas as amostras foram avaliadas na ausência e na presença do hexadecano. Com esse teste, foi observado que o hexadecano realmente interfere na leitura do equipamento, e que esta fonte de carbono não foi eficiente para estimular a produção de biossurfactante.
Dessa forma, novos testes foram realizados a fim de verificar qual a melhor fonte de carbono para estimular a produção de biossurfactante e o melhor tempo de produção. Alguns parâmetros foram alterados, tais como o meio de cultura, o tempo de incubação e as fontes de carbono. Nestes testes, foi utilizado o meio mineral (5 g extrato de levedura; 1 g (NH4)2SO4; 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4; 2,7 g NaCl; 0,6
g MgSO4 ∙ 7H2O, 1000 mL água destilada). Ao meio pronto foi adicionado 0,1 % (v/v) de solução de
micronutrientes [10,95 g ZnSO4 ∙ 7H2O; 5 g FeSO4 ∙ 7H2O; 1,54 g MnSO4 ∙ 7H2O; 0,39 g CuSO4 ∙ 5H2O; 0,25
35 hexadecano, n-fenantreno, glicose e glicerol. Uma alíquota de 10 % (v/v) da cultura em fase exponencial
de crescimento, com absorbância ajustada para DO600 = 0,150 ± 0,030 foi utilizada como inóculo. As
culturas foram incubadas sob agitação contínua de 150 rpm, a 37°C por oito diferentes tempos (48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h, 192 h e 216 h). Após o período de incubação, o material foi centrifugado a