O ensaio vacinal foi realizado na região de Caratinga, área endêmica para LTA, onde o grupo de pesquisa do Dr. Wilson Mayrink vêm desenvolvendo trabalhos por mais de quarenta anos, o que permitiu a consolidação de uma vigilância epidemiológica sediada no “Ambulatório Dr. Paulo Araújo Magalhães”, centro de referência na região do Vale do Rio Doce para diagnóstico, tratamento e controle das leishmanioses. De acordo com Machado-Coelho et al. (1999) 1.712 novos casos de LTA foram relatados em Caratinga, no período de 1966 a 1996, com um nível médio de incidência de 48 casos por 100.000 habitantes e com um aumento da morbidade neste período. Estes autores também observaram uma variação cíclica, durante três décadas, na incidência anual da LTA na região de Caratinga, com um pico epidêmico em cada década. Segundo estes autores, estas alças epidêmicas se devem, principalmente, ao nascimento de uma coorte de indivíduos susceptíveis com consequente acúmulo destes, suficientes para o início de um novo surto epidêmico. Porém diante da diminuição dos susceptíveis há um declínio da epidemia, até que uma nova coorte de susceptíveis seja formada novamente. Associado a isto, o aumento da população de vetores no domicílio e peridomicílio, devido a baixas condições sanitárias e acúmulo de lixo, contribui para a criação de uma biocenose susceptível responsável pelos picos de incidência ocasionais de LTA.
Com o início da avaliação de uma vacina anti-LTA por Mayrink et al. (1979) realizado nesta mesma área, inúmeros avanços no desenvolvimento desta vacina, confirmados a partir de ensaios de fase I, II e III, foram realizados em diferentes locais do Brasil e da América do Sul. Em estudo de fase I, Mazochi et al. (1998) observaram que a vacina é segura, na medida que não apresenta efeitos colaterais graves, que se restringem a apenas a dor local. Os ensaios de fase II realizados confirmaram a segurança e demonstraram uma capacidade imunogênica da vacina (Vélez et al., 2000; De Luca et al., 2001). Os ensaios de fase III realizados por Armijos et al. (2004) e Vélez et al. (2005) confirmaram novamente a segurança e imunogenicidade desta vacina. Estes estudos, no entanto, demonstraram baixa eficácia vacinal.
Mas em todos os ensaios realizados fica definido que cerca de 30% dos indivíduos vacinados não convertem o TM após vacinação. Vários fatores podem estar relacionados a este percentual da população que não converte o TM, observado em diferentes ensaios
vacinais em diferentes localidades, dentre eles fatores inerentes ao parasita e outros ao hospedeiro.
Existem fatores específicos do hospedeiro, como fatores genéticos e nutricionais que podem afetar a resposta humana contra LTA (Murray et al., 2005). Entre os fatores nutricionais, os elementos traço como cobre, ferro, selênio e zinco são componentes essenciais de muitas enzimas que tem funções importantes na resposta imune humana (Erickson et al., 2000; Mocchegiani et al., 2000; Rink & Gabriel, 2000).
Até o momento não existem estudos publicados que investigaram a influência destes elementos traço na resposta imune induzida por uma vacina anti-leishmaniose.
De acordo com a literatura um aumento de cobre sérico leva a um maior número de macrófagos e neutrófilos no sangue e suas atividades fagocíticas são melhoradas (Erickson et al., 2000; Percival, 1995). No entanto, a deficiência de cobre promove a diminuição da produção de IL-2, uma citocina envolvida na resposta imune do tipo Th1 (Hopkins & Failla, 1997). Além disso é observado neutropenia e redução da produção e atividade de células fagocíticas na deficiência deste elemento (Percival, 1998). Alguns estudos demonstraram que durante processos inflamatórios o organismo produz interleucina-1 (IL- 1) que está associada à síntese de proteínas de fase aguda, como ceruloplasmina, aumentando a captação e biodisponibilidade do cobre, sendo assim a responsável pelo aumento de cobre sérico (Klassing et al., 1987).
Nossos resultados não demonstraram um aumento significativo do diâmetro do TM em função do aumento dos níveis séricos de cobre entre os vacinados. Entretanto, Faryadi & Mohebali (2003) observaram concentrações séricas de cobre significativamente maiores em indivíduos com leishmaniose aguda e crônica, quando comparado a indivíduos saudáveis. O mesmo foi observado por Koçygit et al. (1998), entretanto, neste estudo após o tratamento convencional os níveis sericos de cobre foram semelhante aos valores observados em indivíduos saudáveis. Em ambos os estudos, os autores sugerem uma associação deste aumento sérico de cobre durante a infecção ao aumento da ceruloplasmina induzida por IL-1.
Van Weyenbergh et al. (2004) ao comparar diferentes formas clínicas da leishmaniose mostrou um aumento expressivo deste elemento na forma cutânea da LTA e na leishmaniose visceral. Na LV foi observada uma correlação positiva entre cobre
plasmático e anticorpos IgG anti-Leishmania. Esta resposta é caracterizada como não protetora, tipo Th2, sugerindo a interferência de cobre também na resposta humoral. Estes autores não consideraram o aumento de cobre como marcador de infecção, pois não foi observado aumento significativo na forma mucosa da LTA, caracterizada por alta produção de citocinas pró-inflamatórias como INF-γ e TNF-α.
Em nosso estudo observamos uma relação significativa entre elevados níveis de cobre e um menor nível de hemoglobina. Isto pode ser explicado pela capacidade inibitória da absorção de ferro em meio a elevadas concentrações de cobre, observada por Arredondo et al. (2006) em experimentos in vitro. Estes autores sugerem que essa interação ocorre devido à competição da ligação na proteína transportadora DMT1, que participa do transporte de metais bivalentes (Fe, Cu, Zn, Mn e Pb). A DMT1 é a principal proteína transportadora de Fe2+ e participa ativamente no transporte de Cu+1 (Gunshin, 1997; Arrendondo, 2003).
Um menor percentual de monócitos foi observado no grupo GII para o cobre (p < 0,05), onde os indivíduos apresentam elevados níveis séricos deste elemento. De acordo com Percival (1998) o cobre é essencial à produção e maturação de monócitos, porém seu excesso pode interferir na absorção de outros elementos importantes para produção desta linhagem de células, como zinco e ferro (Whittaker, 1998; Arredondo et al., 2006).
A deficiência de zinco afeta primariamente as células T, resultando na diminuição destas e em um desequilíbrio de resposta das células T helper, promovendo predominância de uma resposta Th2 (Ibs & Rink, 2003; Rink and Haase, 2007). Essa deficiência leva também a diminuição da produção e maturação de monócitos, bem como de neutrófilos e células “natural killer” (NK), diminuindo também o estresse oxidativo no interior dos fagócitos, além da diminuição da produção de citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α e INF-γ) (Erickson et al., 2000; Mocchegiani et al., 2000; Ibs & Rink, 2003). Porém, durante a resposta inflamatória a produção de IL-1 induz a produção de IL-6 e glicocorticóides, substâncias capazes de ativar a síntese de metalotioneína no fígado e em outros tecidos, resultando em uma diminuição dos níveis de zinco sérico, explicando a hipozincemia em estados inflamatórios e infecciosos (Svenson et al., 1985; Klassing et al., 1987; Rofe et al., 1996; King et al., 2000).
Nossos resultados demonstraram uma baixa resposta ao TM entre os vacinados com altos níveis de zinco sérico. Estes resultados parecem concordar com outros estudos que observaram uma redução da reação de hipersensibilidade tardia associada a um excesso dos níveis séricos de zinco. Isto provavelmente é devido à supressão da atividade dos linfócitos e da diminuição de INF-γ, demonstrado em estudos in vitro (Chandra, 1984; Provinciali et al., 1998; Rink & Gabriel, 2000), reduzindo a resposta imune Th1 (Mendonça et al., 1995; Nascimento et al., 1990). É importante ressaltar que em nosso estudo, ao contrário do demonstrado por estes autores, nossos resultados não foram consistentes, pois comparando os níveis séricos de zinco com os quartis do diâmetro positivo do TM essa diferença não foi significativa.
No trabalho de Faryadi & Mohebali (2003) uma hipozincemia associada a níveis séricos elevados de cobre foi observada entre os pacientes com LTA aguda e crônica. Resultado semelhante foi encontrado por Koçygit et al. (1998), na Turquia, e por Van Weyenbergh et al. (2004), no Brasil, antes do tratamento convencional com antimoniais. Entretanto, em ambos os estudos, após o tratamento da leishmaniose os níveis séricos de zinco e cobre se normalizaram, demonstrando uma correlação fundamental entre estes elementos e uma resposta inflamatória produzida pela infecção por Leishmania (Koçyigit et al., 1998; Van Weyenbergh et al., 2004). Uma possível explicação para a ausência de mudanças expressivas nos níveis séricos de cobre e zinco entre os vacinados é que a resposta imune, neste caso, foi induzida pelo contato com parasitas mortos. O estímulo produzido pela vacina é menos expressivo que o induzido pela presença de parasitas vivos no sítio de infecção, já que estes se replicam. Sendo, portanto este último estímulo contínuo e mais expressivo, refletindo em uma significativa modificação dos níveis séricos de cobre e zinco.
Em relação ao ferro, a literatura tem indicado que a proliferação e ativação de linfócitos, neutrófilos e células NK requerem a presença de ferro, uma vez que este elemento é essencial para o funcionamento de enzimas como a ribonucleotídeo redutase, envolvida na síntese de DNA (Leberman et al., 1984; Brock & Mulero, 2000; Erickson et al., 2000). Além disso, já foi observada em indivíduos deficientes de ferro uma redução da reação de hipersensibilidade tardia e função de células T reduzidas (Brock, 1993). Entretanto, entre os indivíduos da amostra desse estudo, em Caratinga, o percentual de
indivíduos com baixos níveis de ferro foi pequeno. Portanto, não foi observada diferença significativa entre os níveis séricos de ferro e a resposta ao TM entre os indivíduos vacinados anti-LTA.
Ao contrário dos resultados observados em Caratinga, entre os indivíduos vacinados, outros autores observaram um menor nível de ferro entre os indivíduos infectados por Leishmania, quando comparado aos controles (Koçyigit et al., 1998; Faryadi & Mohebali, 2003). Koçyigit et al. (1998) observaram que após tratamento os níveis de ferro sérico aumentaram, encontrando-se na faixa aceitável como normal pelos valores de referência. O mecanismo da diminuição dos níveis séricos de ferro sugerido foi devido à presença de citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e TNF-α pela via de regulação da ferritina (Brock & Mulero, 2000) e pela liberação de apolactoferrina pelos granulócitos (Adamik & Wlaszczyk, 1996). Este sequestro do ferro durante estágios da infecção é importante para diminuir a biodisponibilidade deste elemento aos microorganismos impedindo seu crescimento e patogenicidade. Entretanto, essa diminuição é controlada pelo hospedeiro a fim de permitir o desenvolvimento de uma resposta imune adapatativa (Brock & Mulero, 2000).
Este efeito da biodisponibilidade do ferro favorável ao patógeno foi avaliado por Laionde & Holbein. (1984) que observaram um aumento da mortalidade em camundongos infectados com Trypanosoma cruzi quando recebiam suplementação de ferro, mas uma depleção deste elemento se mostrava como fator protetor aos camundongos quanto ao desenvolvimento da infecção. Resultados semelhantes foram encontrados por Pedrosa et al. (1990b) ao avaliar os efeitos de depleção e suplementação de ferro, no curso da infecção em camundongos infectados com a cepa Y de T. cruzi.
Ao contrário do cobre, zinco e ferro, os níveis séricos de selênio são significativamente maiores com o aumento do TM, resultados que se mantiveram consistentes mesmo após a inversão da análise. Observamos um aumento progressivo do diâmetro do TM com o aumento dos níveis séricos de selênio. Mas neste caso, foi observado apenas a partir do grupo de diâmetro do TM de 8,1 – 9 mm, demonstrando uma relação benéfica do selênio com a resposta imune. Estes resultados parecem confirmar estudos onde a suplementação de selênio, em animais experimentais, está associada ao aumento da produção e atividade de células NK, neutrofilos, macrófagos e células T
citotóxicas, produção de citocinas, aumento da resposta de hipersensibilidade tardia e resposta induzida por vacinas (Urban & Jarstrand, 1986; Kiremidjian-Schumacher & Roy, 1998; McKenzie et al., 1998; Erickson et al., 2000; Arthur et al., 2003). Este aumento da reação de hipersensibilidade tardia com aumento do selênio é concordante com os resultados observados neste estudo, uma vez que o TM é baseado neste tipo de reação.
Nossos resultados apresentaram uma menor concentração de hemoglobina em GII para o selênio, onde os indivíduos apresentaram elevados níveis séricos deste elemento. Porém, como sua biodisponibilidade ainda não é totalmente elucidada, não sabemos se há alguma interação na absorção e biodisponinilidade de selênio e ferro. Interações entre elementos como cobre, ferro, zinco e outros elementos já são conhecidas (Pedrosa et al., 1993; Arredondo, 2006), por isso não se pode descartar a hipótese de uma interação entre ferro e selênio.
Um menor percentual de monócitos foi observado em GII, ou seja, entre os indivíduos com excesso de selênio. Este resultado parece contraditório aos dados da literatura que relatam a necessidade deste elemento para a produção e maturação de monócitos, mas pouco se sabe sobre a toxicidade do mesmo e sua interferência na manutenção das células.
Estudos em animais experimentais demonstraram que uma baixa ingestão de selênio e conseqüente deficiência deste elemento estão relacionadas ao desenvolvimento de várias doenças e geralmente é concomitante a deficiência de vitamina E. Esta associação da deficiência de selênio e vitamina E leva a hipótese de um processo antioxidante (Turner & Finch, 1991; Wichtel, 1998). O efeito antioxidante do selênio na resposta imune está relacionado à atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px). Esta selenoenzima é importante na proteção celular, pois cataliza a oxidação da glutationa reduzida pelo peróxido de hidrogênio e outros hidroperóxidos, diminuindo assim o dano oxidativo a célula hospedeira (Ursini & Bindoli, 1987). A atividade diminuída da glutationa peroxidase leva a uma remoção incompleta de peróxido de hidrogênio das células, aumentando a morte de parasitas intracelulares (Haidaris & Bonventre, 1982; Koçyigit et al., 1999; Urban & Jarstrand, 1986).
Koçyigit et al. (1999) avaliaram os níveis séricos de selênio e de glutationa peroxidase em indivíduos com leishmaniose cutânea, os quais apresentaram menores níveis séricos de selênio correlacionados a uma diminuição significativa de glutationa peroxidase quando comparado a indivíduos saudáveis. Estes resultados sugerem que durante a infecção por Leishmania a diminuição de selênio promove uma baixa capacidade antioxidante da glutationa peroxidase, aumentando a citotoxidade dos fagócitos. Isto pode ser considerado uma estratégia de defesa do hospedeiro contra os patógenos invasores. Resultados semelhantes foram encontrados em pessoas infectadas por Leishmania donovani (Biwas et al., 1997). No entanto, apesar deste achado o mecanismo exato da redistribuição do selênio ainda é desconhecido.
A essencialidade do selênio ao funcionamento eficiente do sistema imune em animais e humanos e sua bioquímica celular descrita como um sistema complexo, além da expressão de proteínas contendo selênio é relatado por vários autores (Turner & Finch, 1991; Wichtel, 1998; Lescure et al., 2002; Arthur et al., 2003). Este elemento é encontrado em quantidades variadas em solos de diferentes regiões do mundo, o que é refletido na sua concentração sérica em indivíduos que consomem alimentos produzidos localmente. Combs (2001) avaliando a expressão de selenoenzimas de acordo com a dieta observou que indivíduos que apresentam dieta pobre em selênio possuem uma menor expressão destas selenoenzimas. Diante disso, seria interessante uma avaliação dos níveis de selênio no solo da região de Caratinga, para correlacionar aos níveis séricos observados em nossa amostra.
7.1 Limitações do estudo
Idealmente, a avaliação da resposta proliferativa de células mononucleares do sangue perifério (CMSP) e a determinação de citocinas séricas deveriam ser utilizadas para avaliação de vacinas candidatas. Entretanto devido aos recursos escassos e dificuldade destas avaliações nos campos de trabalho, isto se torna inviável para o desenvolvimento destes ensaios em grande escala.
Diante da alta correlação do TM com a resposta proliferativa de CMSP e com os níveis séricos de INF-γ e IL-12 (Nascimento et al., 1990) além de ser um teste barato e de fácil realização, este método tem sido utilizado tanto na seleção de indivíduos aptos a receberem a vacina como sendo marcador imunogênico pós-vacinal (Mayrink et al., 1979;
Mayrink et al., 1985; Antunes et al., 1986; Nascimento et al., 1990; Mendonça et al., 1995; Armijos et al., 1998; Marzochi et al., 1998; De Luca et al., 1999; Vélez et al., 2000; Armijos et al., 2004).
Alguns autores tem questionado a capacidade do TM em induzir um significativo aumento da proliferação de CMSP e produção de INF-γ in vitro e in vivo (José et al., 2001; De Luca et al., 2003), o que limitaria seu uso em ensaios vacinais. Entretanto, as diferenças na dose entre a vacina e o TM (40 µg de nitrogênio proteico por mL para o TM e 180, 360 ou 540 µg de nitrogênio proteico/mL para a vacina) e na via de administração (via intradérmica para o TM e intramuscular para a vacina) sugerem que uma única dose do TM não seja capaz de induzir positividade de um segundo TM por no mínimo 60 dias da primeira aplicação.
José et al. (2001) avaliando o poder sensibilizante do TM em indivíduos sem contato prévio com Leishmania e residentes em área não endêmica, observaram semelhança entre a positividade do segundo TM aplicado 30 e 90 dias após o primeiro, entre os grupos placebo e o que recebeu o TM. Esses autores ao avaliarem os níveis séricos de INF-γ 30 e 360 dias após a primeira aplicação do TM observaram um alto nível desta citocina no 30º dia. No entanto, 360 dias após o primeiro TM esta citocina foi detectada em poucos indivíduos e com níveis muito baixos (José et al., 2001). Diante disso, acreditamos que o TM é capaz de sensibilizar indivíduos saudáveis, porém em menor intensidade e com uma sensibilização não duradoura, assim sua utilização como teste para seleção de indivíduos aptos a receberem vacina anti-LTA e na avaliação da imunogenicidade da mesma é aceitável.
Um fator limitante deste estudo é a presença de subgrupos populacionais compostos por diferentes níveis séricos de elementos traço. Apesar de ser ideal uma avaliação prévia destes elementos à vacinação, os custos seriam proibitivos, uma vez que suas deficiências são pouco freqüentes. Em Caratinga observamos um percentual de deficiência de apenas 6,2% de cobre e zinco e 5,8 para ferro. Entretanto, para o selênio o percentual de indivíduos deficientes foi bem maior (49,5%).
Outra limitação observada foi a variação da concentração de cobre em função da idade, com uma maior concentração sérica média deste elemento na faixa etária de 5 a 10 anos. Os níveis séricos de cobre podem ser correlacionados à concentração do mesmo no
solo e nos alimentos. Dentre estes alimentos, leites e derivados contém baixo teor de cobre e normalmente muito consumidos nesta faixa etária. No entanto, como as localidades deste estudo são áreas de cultivo de café, um consumo de leite é provavelmente menos freqüente para algumas famílias. Porém, quanto aos grupos G0/I e GII, estes foram homogêneos na medida em que não houve diferença significativa entre os níveis de elementos traço relacionados ao sexo, idade e IMC.
Os resultados obtidos neste trabalho nos permitem as seguintes conclusões:
1. Níveis séricos elevados de cobre e ferro não apresentaram associação com a resposta imune induzida pela vacina anti-LTA composta por L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), avaliada pelo Teste de Montenegro.
2. A imunogenicidade da vacina anti-LTA composta por L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), avaliada pelo Teste de Montenegro aumenta em função dos níveis séricos de selênio.
3. A imunogenicidade da vacina anti-LTA composta por L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), avaliada pelo Teste de Montenegro é menor no grupo com excesso de zinco sérico. No entanto, estes resultados não são consistentes na medida em que estes não se repetem com a inversão da definição de dependência das variáveis.
4. Não foi encontrada relação entre a antropometria e a resposta imune induzida pela vacina anti-LTA, avaliada pelo Teste de Montenegro.
Tabela 14. Distribuição da concentração média e desvio padrão de cobre, ferro, selênio e zinco de acordo com o diâmetro do TM, determinado em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga, MG.
Cobre (µg/L) Ferro (µg/L) Selênio (µg/L) Zinco (µg/L) Diâmetro
do TM n Média DP n Média DP n Média DP n Média DP 0 97 1.354,1 657,4 86 1.536,2 848,9 93 83,6 a 20,1 97 1.009,0 323,1 5,0 – 8,0 33 1.599,8 696,4 27 1.408,2 824,9 28 111,1a 66,0 33 938,6 151,1 8,1 – 9,0 10 1.614,8 881,6 8 1.094,2 475,4 10 68,4 a 16,7 10 1.237,0 1071 9,1 – 12,0 16 1.341,7 462,3 12 1.152,6 458,4 13 76,5a 19,5 16 950,6 184,1 > 12,0 15 1.560,9 648,6 11 1.221,3 588,4 13 103,3b 35,5 15 962,2 168,7 Total 171 1.433,7 665,7 144 1.431,6 791,5 157 88,57 39,0 171 999,2 365,7 p 0,285 0,264 0,002* 0,228
n: número de indivíduos avaliados; DP: desvio padrão; a: diferença significativa (p<0,05) do diâmetro 5,0 – 8,0 com os grupos de diâmetro 0; 8,1 – 9,0; 9,1 – 12,0. b: diferença significativa (p<0,05) do diâmetro 8,1 – 9,0 com o grupo de diâmetro > 12,0.
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