DNA complementar

procedimento utilizado para a clonagem de um gene em bactéria. Uma molécula de RNA mensageiro serve de molde para a síntese reversa do DNA complementar (A), produzindo um híbrido RNA-DNA. A porção de RNA do híbrido é eliminada (B), ficando uma cadeia simples de DNA, que é duplicada (C). Essa cadeia dupla de DNA é inserida em um plasmidio (F} que foi isolado a partir de bactérias previamente infectadas (D) e aberto por ação de uma enzima de restrição apropriada (E). O plasmídio híbrido resultante é introduzido em bactérias, nas quais se reproduz (H). Na etapa seguinte (1), os plasmídios são isolados e as sequências específicas de DNA sintetizadas são deles separadas, graças à ação de enzimas de restri­ ção adequadas (J}. É possível, em seguida, marcar esse DNA com isótopos radioativos, produzindo, assim, o que se chama de sonda de detecção que, por hibridação, é capaz de quantificar (quando se trabalha in vivo) ou lo­ calizar a sequência específica de DNA (gene) nas células, quando se faz a hibridação in situ.

A B e

1 1

1

1 1

1

1 1

Biologia Celular e Molecular

Figura 8.32 • Fotomicrografia de cromossomos metafásicos de Solanum corymbiflorum (Solana­ ceae) com 2n = 24, contracorados com DAPI (4,6-diamino-2-phenylindole} (fluorocromo azul) e submetidas à técnica de FISH (fluorescent in situ hibridization) para detectar e localizar as sequências de genes de rRNA com sondas obtidas de trigo. O rDNA 455 foi marcado com biotina-14-dATP e detectado com avidina-FITC (fluorocromo verde) e o rDNA 55 foi marcado com digoxigenina-11-dUTP e detectado com antidigoxigenina-rodamina (fluorocromo vermelho}. 1 OOOx. (Cortesia de Letícia N. A. Almeida Rego e André L. LaforgaVanzela.}

mRNA Bactéria

1 1 1 1 1 1 1 1 1

Transcriptase reversa _mRNA

• Jt o�

1 1 1 1 1 1 1

1

_{DNA complementar}

1 1 1

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1

+ RNase � 1

1 1 1

1

1 1

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1

1

1

1

1

Cromossomo Plasmídio D ^Isolamento do plasmídio

0 0 0

DNA complementar - cadeia única ^{Ruptura do} _{plasmídio por} enzima de restrição 1 + DNA-polimerase

•

1 1

1 1

1 1 1 1

1

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1 1 1

DNA complementar - cadeia dupla

L....

G Integração do plasmidio híbrido na bactéria F H Multiplicação do plasmídio na bactéria

Isolamento dos plasmídios

1

J

E

Solda do DNA de dupla cadeia sintetizado no DNA do plasmídio =

Produção do plasmídio híbrido

lj

10·

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10^{· Separação do DNA ,, ---.\}

" _., ..

inserido nos plasmídios ( • •• ___ .,: J

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....... _ .,. .. ,' + Isolamento do

.8 J Núcleo da Célula

de água quente, e, por isso, foi denominada Taq-polimerase. A Taq-polimerase é usada para adicionar desoxirribonucleo­ tídios a um pequeno segmento de DNA, ou primer, que dirige a síntese do novo segmento de DNA sobre o molde onde o

primer se ligar.

A PCR pode ser dividida em três etapas fundamentais. ( 1)

A mistura da amostra de DNA + Taq -polimerase + primers

+ os quatro nudeotídios que compõem a molécula de DNA (dCTP, dATP, dGTP e dTTP) é submetida a uma temperatura de 92 a 94ºC, para que ocorra a separação dos dois filamen­

tos do DNA; (2) redução da temperatura para que os primers

se liguem às extremidades 3' de cada filamento de DNA, que contêm as sequências nucleotídicas complementares - a Taq­ polimerase vai adicionando nucleotídios às extremidades 3' dos primers, copiando os filamentos de DNA e formando fila­ mentos complementares a cada um deles; (3) a temperatura é novamente elevada, fazendo com que os novos filamentos de DNA se separem dos antigos, que foram usados como molde. Ao final, o processo volta a se repetir várias vezes.

Em cada ciclo de repetição, o número de genes (segmentos de DNA) é duplicado, e, como cada ciclo dura 2 a 3 h, em algu­ mas horas o DNA pode ser copiado bilhões de vezes. Além de rápida, a PCR é uma técnica tão sensível que pode amplificar o DNA de uma única célula.

Genes clonados podem ser introduzidos em células ani­ mais e mesmo em plantas. Esses experimentos têm possibili­ tado a identificação de genes que controlam o crescimento e a diferenciação da célula, inclusive dos genes responsáveis pelo desenvolvimento de células cancerosas. Esses genes podem ainda ser introduzidos em células da linhagem germinativa de organismos multicelulares, possibilitando o estudo da sua

--- Resumo

As modernas técnicas de análise e manipulação genética, associadas a métodos de análise bioquímica de ácidos nuclei­ cos e de proteínas, têm possibilitado que modificações sejam introduzidas nos genomas dos organismos. O conjunto de técnicas com essa finalidade, conhecido como tecnologia do DNA recombinante ou engenharia genética, consiste na introdução de genes de uma espécie em um organismo de outra espécie, de modo que os genes estranhos possam dupli­ car-se, ser transcritos e traduzidos no novo ambiente celular. A metodologia é complexa e depende do fracionamento do DNA com enzimas de restrição, que cortam a molécula em locais específicos. Ela inclui numerosas técnicas, entre as quais se destacam a hibridação molecular e a clonagem do DNA. As técnicas permitem o isolamento e caracterização de

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expressão em organismos. Os animais transgênicos são, geral­ mente, produzidos por meio da injeção do DNA clonado no pronúcleo do ovo fertilizado, o qual é transplantado posterior­ mente para uma mãe hospedeira, na qual se desenvolve até o nascimento. Assim, o animal incorporará ao seu genoma um gene estranho, que poderá agora ter sua expressão estudada em um organismo multicelular.

O mesmo processo pode ser empregado para obter as plan­ tas transgênicas, nas quais podem ser inseridos genes que con­ ferem resistência às pragas, ou que aumentam o valor nutritivo de um cereal, por exemplo.

Essa técnica, além de numerosas aplicações em biologia molecular, tem também importância no diagnóstico de diversas doenças hereditárias e em medicina forense. Ela torna possível identificar urna pessoa por meio da comparação de amostras contendo células, mesmo em pequenas quantidades, sejam elas de sangue, esperma ou de um fio de cabelo, sendo por isso usada em exames de perícia policial ou de exclusão de paternidade.

•

Mutagênese do DNA clonado

Técnica pela qual sequências de DNA clonado são alte­ radas para produzir versões modificadas de genes, que são reintroduzidos nas células ou em organismos unicelulares.

Esse processo de mutagénese in vitro pode causar deleções,

inserções ou alterações de nucleotídios na molécula de DNA. Esses experimentos favorecem os estudos da expressão gênica, bem como a determinação da função dos produtos desses genes. Por exemplo, alguns aminoácidos de urna determinada proteína podem ser alterados, possibilitando estabelecer a função desempenhada por ela na célula.

genes específicos que são inseridos em vetores (geralmente plasmídios de bactérias) e transferidos para células proca­ riontes, nas quais, além da produção das sequências de DNA em alto número, o produto final (geralmente proteínas) tam­ bém é elaborado em altas taxas, podendo até alcançar produ­ ção em escala industrial. Esses processos constituem o que se convencionou chamar de clonagem gênica. A aplicação da tecnologia do DNA recombinante tem proporcionado diver­ sas vantagens: desde a determinação da proximidade entre organismos na escala evolutiva, a localização de genes espe­ cíficos no genoma, com a amplificação daqueles de maior interesse científico, médico ou econômico, até a direta apli­ cação prática na vida cotidiana, como nos casos de determi­ nação de paternidade.

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• Roteiro

• Toda célula se origina da divisão de uma célula preexistente

• O período que compreende as modificações ocorridas em uma célula desde a sua formação até sua própria divisão em duas células-filhas é denominado ciclo celular

• O ciclo celular compreende duas etapas: a intérfase e a mitose

• Cada vez que a célula se divide, seu conteúdo deve ser duplicado de modo a reparti-lo igualmente entre as duas células-filhas

• Nos tecidos que se renovam, as células passam pelas fases G₁, S, G₂ e M do ciclo. A fase S é o momento da síntese do DNA

• A síntese de DNA é semiconservativa. Cada dupla hélice tem uma cadeia antiga e uma cadeia nova

• As duas cadeias-filhas de uma molécula de DNA são sintetizadas de maneira diferente: uma contínua e outra descontínua

• A fase M ou mitose é subdividida em prófase, metáfase, anáfase e telófase

• A progressão por meio do ciclo celular é dirigida por uma família de proteínas

• Uma série de pontos de controle regula a progressão por meio das várias fases do ciclo celular

• Os controles atuam em resposta ao tamanho celular e a sinais extracelulares, como fatores de crescimento e de inibição

• A meiose é a divisão especializada em reduzir à metade o número de cromossomos, resultando na formação dos

gametas

• Na meiose ocorre permuta entre cromossomos paternos e maternos

• O controle da meiose é feito por mecanismos semelhantes aos que controlam a mitose

• Os gametas resultantes de um processo meiótico são geneticamente diferentes, o que contribui para maior diver­ sidade da espécie.

9 1 Ciclo Celular e Meiose

A capacidade de crescer e de se reproduzir é atributo fun­ damental de todas as células. No caso das células eucarion­ tes, o processo básico de gênese de novas células obedece a um padrão cíclico que começa com o crescimento celular, determinado por um aumento quantitativo coordenado dos milhares de tipos diferentes de moléculas que a célula tem, inclusive de seu material genético, e culmina com a partição de seu núcleo e citoplasma em duas células-filhas. As células originadas repetem o ciclo, e o número de células aumenta exponencialmente. Este processo é denominado ciclo de divi­ são celular ou, simplesmente, ciclo celular, e serve tanto para manter a vida, em organismos pluricelulares, como para gerar a vida, no caso dos organismos eucariontes unicelulares. Por meio dele, o corpo humano, por exemplo, inicia sua existência a partir de uma única célula, o zigoto, a qual passa por dupli­ cações celulares sucessivas, tanto ao longo do período embrio­ nário como ao longo do desenvolvimento do organismo. Essas duplicações levam à formação de cerca de cem trilhões (10¹⁴)

de células, chamadas células somáticas, que constituem o indi­ víduo adulto. Assim, pode-se afirmar que o processo de cres­ cimento de um tecido, de um órgão ou de todo um organismo

pluricelular se dá basicamente pela multiplicação do número de suas células, e não pelo crescimento destas, já que uma das propriedades celulares é manter um volume caracteristica­ mente constante.

Mesmo no adulto, as divisões celulares continuam frequen­ tes. Esse processo de multiplicação ou proliferação celular, que ocorre por duplicação de células preexistentes, é também o responsável pela reposição de células mortas e pela regene­ ração de partes danificadas de tecidos ou órgãos. As células morrem não só como resultado de lesões, mas, principal­ mente, por um processo fisiológico normal, conhecido como apoptose, um tipo de morte celular programada, que será dis­ cutida mais adiante, neste capítulo. Por esse meio, o organismo controla e mantém constante o número de células em tecidos e órgãos, livra-se de células danificadas e, ainda, elimina célu­ las indesejáveis e não permanentes de tecidos em desenvol­ vimento, durante a morfogênese. Assim, tanto o desenvolvi­ mento como a manutenção de tecidos e órgãos no

adulto dependem de um balanço cuidadosamente

regulado entre a proliferação celular e a morte programada.

A formação de novas células, no entanto, nem sempre ocorre por meio do ciclo celular típico. Quando se trata da origem de células gaméticas, ou gametas, de organismos que têm reprodução

sexuada, esse processo não é cíclico. Os gametas ^{.. ....} -se formam a partir da divisão de células somáticas

específicas, presentes nas gônadas ou nos órgãos

do sistema reprodutor masculino e feminino, chamadas células germinativas. Os gametas

car-somente a metade do número cromossô­

c, assim, a metade da quantidade de mate­

..cnético presente nas células somáticas do

organismo; por isso, são células

haploi-qual ocorre redução do conteúdo original de material gené­ tico. Assim, a meiose não é simplesmente outro tipo de divisão celular, mas o processo pelo qual uma célula preexistente dá origem a células diferentes dela própria e diferentes entre si. A meiose, então, gera uma fase haploide da vida dos organis­ mos, enquanto a fusão de dois gametas, chamada fecundação ou fertilização, restabelece a fase diploide, por resultar em uma célula diploide, que inicia um novo organismo. A meiose será vista na parte final deste capítulo.

• O ciclo celular compreende duas etapas

coordenadas: uma de crescimento e

outra de divisão em duas células-filhas

O ciclo celular compreende os processos que ocorrem desde a formação de uma célula até sua própria divisão em duas células-filhas, todas iguais entre si. O ciclo pode ser divi­ dido em duas grandes etapas:

• aquela compreendida entre duas divisões sucessivas, em que a célula cresce e se prepara para nova divisão, denomi­ nada intérfase

• a etapa da divisão propriamente dita, pela qual se 0riginam duas células-filhas. Esta etapa se caracteriza pela divisão do núcleo, chamada cariocinese ou mitose, seguida pela divi­ são do citoplasma, ou citocinese (Figura 9.1).

O crescimento e a divisão celulares devem ser regulados e coordenados de tal modo que o ciclo transcorra em um equi­ líbrio que assegur" a manutenção das características celulares essenciais na progênie; por exemplo, para que se conserve constante o tamanho celular nas células-filhas, o crescimento deve ser compensado com a divisão celular. Isso significa que a duração do ciclo tem de se ajustar perfeitamente ao tempo de que a célula necessita para dobrar seu tamanho. Assim, evi­ ta-se que a célula seja cada vez menor, ou maior, dependendo do tempo de duração do ciclo em relação à massa celular. Essa coordenação requer que mecanismos de controle operem em

.. : · s --- -lntérfase Mitose,:'

. . _{. . .}

Pró fase Metáfase ! � _Anáfase @_relófase \. Mitose

=-=91anto as somáticas são diploides. Sua resulta, portanto, de uma divisão celular

, denominada meiose, por meio da

Figura 9.1 • Esquema do ciclo celular. À esquerda, a intérfase com as fases G1, S e G2; à direita, a mi­

tose, dividida em quatro fases. A intérfase consiste em crescimento celular, duplicação do conteúdo e preparação para nova divisão. A mitose compreende a divisão do núcleo e do citoplasma.

momentos específicos do ciclo celular. Nas células eucarion­ tes, o controle do processo de reprodução celular é feito por diversos produtos gênicos, que são, por sua vez, regulados por fatores extracelulares, sejam eles nutrientes ou fatores de crescimento, que fazem com que a divisão celular ocorra coor­ denadamente com as necessidades do organismo como um todo.

Certamente, a complexidade dos organismos vivos faz com que a maioria dos processos moleculares que neles operam sejam muito diversos, em consequência dos diferentes tipos de vida que têm e dos padrões evolutivos que sofreram. Assim, também os detalhes do ciclo celular variam entre grupos de organismos filogeneticamente distantes. No entanto, quanto

mais se conhece a respeito do sistema de controle do ciclo

celular, mais similaridades se descobrem entre os diferentes organismos vivos, indicando uma origem ancestral comum e

uma alta conservação evolutiva dos modos de atuação e da

composição de genes e proteínas envolvidos nesse controle. Essas proteínas são tão semelhantes que muitas delas, quando transferidas de uma célula humana para uma célula de leve­ dura, continuam desempenhando a mesma função.

• Fases do ciclo celular IA síntese de

DNA ocorre na fase S da intérfase

Ainda que a mitose constitua morfologicamente a etapa mais espetacular do ciclo celular, é na intérfase que ocorre a duplicação dos componentes da célula-mãe, bem como, em especial, a duplicação do DNA, pré-requisito essencial para que a divisão ocorra. Esse processo pode ser estudado por meio do emprego de precursores radioativos, utilizando-se métodos bioquímicos ou radioautográficos, ou por citofotometria.

Quando precursores radioativos do DNA, como a timidina tritiada (timidina-H³), são dados às células por poucos minu­ tos e estas são então processadas para radioautografia, pode-se observar, ao microscópio óptico, que células em divisão não incorporan1 a timidina-H3. Por outro lado, células que esta­ vam replicando seu DNA no momento da exposição à timidi­ na-H³ produzem a imagem radioautográfica de núcleos mar­ cados, verificando-se que apenas algumas células em intérfase estavam replicando seu DNA. A observação, a intervalos de tempo fixos posteriores à exposição, para detectar o momento em que o bloco de células marcadas entra em mitose, permite demonstrar, entre outros aspectos, que as células terminam a replicação do DNA pelo menos 2 h antes da mitose. Portanto, nas células eucariontes, a duplicação do DNA está situada em um período intermediário da intérfase e não ocupa toda essa fase. Essa descoberta possibilitou a divisão da intérfase em três períodos sucessivos, ou a divisão do ciclo em quatro fases dis­ tintas, que foram chamadas G1, S, G2 e M. A sequência cíclica dessas fases está ilustrada nas Figuras 9.1 e 9.2. No período S ocorre a duplicação ou síntese do DNA, daí o nome dessa fase. A abreviatura G provém do termo inglês gap (intervalo). O período G₁ é o intervalo de tempo que transcorre desde o fim da mitose (M) até o início da síntese de DNA (S), por isso também considerado período pós-mitótico ou pré-sintético. O período G2 é o intervalo entre o término da síntese de DNA e

Figura 9.2 • As quatro fases sucessivas do ciclo de divisão de uma célula eucarió· tica típica. No início da fase G1, em resposta a sinais externos, a célula "decide" se continua em ciclo ou se assume um estado quiescente chamado Go, cuja duração é

extremamente variável. Desse estado, ela pode voltar ao ciclo mediante estímulo.

Certas células cultivadas, por exemplo, se estimuladas, podem voltar ao ciclo, en­ trando novamente na fase G1 e começando a sintetizar DNA 12 h depois. No final de G1, existe um importante ponto de controle do ciclo, chamado ponto de restrição

(R), que impede a progressão do ciclo em condições desfavoráveis ou insatisfatórias.

Quando o ponto R é ultrapassado, a célula passa pelas demais fases do ciclo celular até que duas células- filhas idênticas sejam formadas ao final da mitose (M). a próxima mitose, também denominado período pós-sintético

ou pré-mitótico.

As fases do ciclo e a determinação da duração de cada uma delas ainda podem ser estudadas por citofotometria, em que também se mede a quantidade de DNA de células individuais em uma população celular. Para o emprego desse método, células fixadas devem ser coradas com corantes específicos para DNA (por meio da reação de Feulgen, por exemplo) ou com corantes fluorescentes que se ligam a pontos específicos da molécula de DNA. Dessa maneira, na análise feita por meio de um citofotômetro ou da técnica de microfluorometria de fluxo, a fluorescência detectada ou a intensidade de luz trans­ mitida através dos núcleos é proporcional ao conteúdo de DNA. Assim, em uma determinada população celular, podem ser obtidas as frequências de células com conteúdo de DNA duplicado (4C), não duplicado (2C) e intermediário entre 2C e 4C, que corresponderiam, respectivamente, às células nos períodos G2, G1 e S. Se as células da população estiverem distribuídas ao acaso pelas diferentes fases do ciclo, ou seja, se a população for assincrônica, então a porcentagem de células detectada em qualquer segmento da intérfase será proporcio­ nal à duração desse segmento. Se o tempo médio de ciclo for, também, previamente conhecido, a duração absoluta de cada fase poderá ser determinada; por exemplo, se o tempo de ciclo for de 20 h e 40% da população celular apresentar- se em G₁, conclui-se que a duração dessa fase é de 8 h.

O ciclo celular pode ser estudado, ainda, utilizando-se a técnica de sincronização celular. Esse método permite acom­ panhar uma população celular que esteja atravessando as etapas do ciclo celular sincronicamente, e, dessa maneira,

9 1 Ciclo Celular e Meiose

podem-se analisar os eventos moleculares inter-relacionados. Para esse fim, pode ser usada uma população celular natural­ mente sincrônica. Isso ocorre no fungo Physarum, por ser um plasmódio, ou, ainda, no início do desenvolvimento embrio­ nário, quando a sincronia se mantém por cerca de 10 ciclos celulares consecutivos após a fertilização da célula-ovo. Como os casos de sincronia natural do ciclo são pouco frequentes, a sincronização pode também ser induzida. Essa indução pode

No documento Biologia Celular (páginas 170-181)