p elo s complexos de poros

O envoltório nuclear não é contínuo como as demais mem­ branas biológicas. Em alguns pontos, a membrana externa fun­

de-se com a interna, formando os poros nucleares (Figuras 8.4 e 8.5). Esses poros são parcialmente preenchidos por agrega­

dos proteicos, os complexos de poro, que permitem e regulam o trânsito de macromoléculas entre o núcleo e o citoplasma (Figuras 8.4 e 8.6). Os poros são uniformemente espaçados, e sua quantidade por unidade de área do envoltório varia com o tipo de célula e com seu estágio funcional (Figura 8.5). Células com alta atividade de síntese proteica, como as célu­ las embrionárias, apresentam maior quantidade de complexos de poro por unidade de área da superfície do envoltório. Por outro lado, células com baixa atividade metabólica, como os eritrócitos nucleados, têm quantidade de complexos de poro significativamente menor.

Análises detalhadas, que incluem estudos ao microscópio eletrônico, tomografia ultraestrutural, proteômica e recons­ tituição por computador, permitiram a construção de mode­ los tridimensionais dos complexos de poro (Figura 8.7). Eles são constituídos por dois anéis proteicos que têm um arranjo octogonal e estabelecem o perímetro do poro. Um deles está ligado à superfície nuclear -anel nuclear -, e o outro à super­ fície citoplasmática do envoltório -anel citoplasmático. A dis­ posição octogonal desses dois anéis leva ao estabelecimento de um canal central que é em parte preenchido por filamen­ tos proteicos que se projetam como raios e se emaranham no interior do canal. Ainda, oito filamentos proteicos se projetam dos anéis citoplasmático e nuclear, constituindo uma estrutura semelhante a uma cesta de basquete, apenas no lado nuclear. O complexo de poro é ancorado na bicamada lipídica, nos pontos em que as membranas estão fundidas por dois tipos de proteínas intrínsecas, a POM121 (do inglês pare membrane) e a gp210 (do inglês glycoprotein) (Figura 8.4).

Estima-se que os complexos de poro sejam constituídos por mais de 100 moléculas proteicas, coletivamente denominadas

nucleoporinas (Nup). Cada complexo contém cerca de 30 tipos diferentes de nucleoporinas, a maioria delas já caracte­ rizada bioquimicamente, tais como a Nupl53, Nup62, Nup54, NupSO, Nup35, entre outras (os números referem-se aos pesos moleculares dessas proteínas).

As Nup têm localizações específicas no complexo, algu­ mas são simetricamente distribuídas, outras residem exclusi­ vamente na face citoplasmática, outras na nucleoplasmática, e outras, ainda, estabelecem o perímetro do canal central (Figura 8.7). Duas classes de Nup foram identificadas: (1) as que apresentam sequências dos aminoácidos fenilalanina e

Biologia Celular e Molecular

Figura 8.5 • Envoltório nuclear da ameba Entamoeba histolytica, obtido pelo método de criofratura, que mostra o grande número de poros nucleares. 20.000 x. (Cortesia de A. Martinez-Palomo.)

Figura 8.6 • Eletromicrografia de corte oblíquo de calota nuclear de célula renal. Embaixo, a cromatina condensada, que se interrompe nas regiões correspondentes aos poros nucleares. Em alguns poros é visível uma estrutura elétron-densa, em um arranjo em anel (setas), que constitui os complexos de poro. 45.000x.

8 1 Núcleo da Célula Citoplasma Canal central Anel Anel nuclear Filamentos - --M nucleares Núcleo Filamentos citoplasmáticos Espaço perinuclear Membrana nuclear interna Cesta de basquete Figura 8.7 • Esquema de corte do complexo de poro, formado por dois anéis pro­ teicos que se dispõem em um arranjo octogonal. Do anel citoplasmático partem oito filamentos que mergulham no citosol, enquanto os filamentos que partem do anel nuclear formam uma estrutura semelhante a uma cesta de basquete no interior do núcleo. Ambos os anéis estão ancorados na bicamada lipídica, nos pontos em que as membranas se fundem. Essa disposição espacial dos anéis proteicos delimita um canal central, que é preenchido por filamentos das nucleoporinas e que participam do transporte de moléculas.

glicina (FG) que se repetem e se intercalam entre sequências de aminoácidos polares de comprimentos variados e estão envolvidas no transporte entre o núcleo e o citoplasma, e (2) aquelas que não apresentam domínios FG e fazem parte da estrutura dos complexos de poro. As sequências FG das Nup ficam expostas nos filamentos nucleares, nos citoplasmáticos e em todo o perímetro do canal central, no qual elas participam do transporte de moléculas.

Os complexos de poro têm um diâmetro externo de 120

nm e um peso molecular de 125 MDa (megadálton = 106 dál­

tons). O canal central, por sua vez, tem um diâmetro de 25 a 30 nm. A disposição dos filamentos das Nup no interior do canal central fecha parcialmente a abertura do complexo de poro (Figura 8.7).

O trânsito de moléculas através dos complexos de poro pode ocorrer tanto por transporte passivo quanto por ativo. Água, íons e pequenas moléculas de até 9 nm de diâmetro atravessam rapidamente o complexo de poro nos dois sen­ tidos. Elas se difundem passivamente pelo canal central. A maioria das proteínas e RNA, no entanto, são grandes demais para se difundirem por esses canais. Essas macromoléculas atravessam os complexos de poro por um processo que con­ some energia, em que tanto as proteínas quanto os RNA são reconhecidos e transportados seletivamente. Normalmente, o núcleo importa do citoplasma proteínas de peso molecular elevado, como as polimerases do DNA (100.000 dáltons) e do RNA (200.000 dáltons). As proteínas próprias do núcleo são sintetizadas no citoplasma com sinais de localização nuclear, que consistem em uma ou duas sequências curtas de aminoá­ cidos, ricas em lisina e arginin;;. As proteínas marcadas para destino nuclear atravessam os complexos de poro por um mecanismo que consome energia fornecida pelo GTP. Os sinais de destinação nuclear são reconhecidos pelos recep­ tores de importação, que são proteínas citoplasmáticas da

família das importinas (Figura 8.8). Estima-se que existam, em vertebrados, cerca de 20 tipos diferentes de importinas. A importina se liga à proteína a ser transportada, formando um complexo que, para ser translocado através do poro, deve interagir com as nucleoporinas. A importina do complexo importina-proteína nuclear é reconhecida pelas sequências FG das Nup, que compõem os filamentos citoplasmáticos, e pelas sequências FG das Nup, que formam o canal central do complexo de poro. Essas sequências funcionam como tri­ lhos que promovem a translocação do complexo importina­ proteína pelo poro. Após o transporte, a importina se desliga da proteína e retorna ao citoplasma, no qual pode ser utili­ zada em novo processo de importação. O sinal de localização nuclear não é removido depois que a proteína entra no núcleo, o que permite a reintrodução da proteína quando o envoltório nuclear se refaz após a mitose.

A exportação de RNA do núcleo para o citoplasma é semelhante à importação de proteínas, mas atua em direção oposta. Esse processo também é mediado por receptores de exportação específicos, ou seja, uma família de proteínas denominadas exportinas (Figura 8.8). O processo é ativo, consumindo energia fornecida pelo GTP. Os RNA transcritos no núcleo que desempenham sua função no citoplasma, ou seja, o mRNA, tRNA e rRNA, são exportados como comple­ xos RNA-proteínas (RNP), e os sinais de exportação nuclear desses complexos RNP estão presentes nas proteínas. A única exceção encontrada foi a molécula de tRNA, uma vez que foi isolado e caracterizado um tipo de exportina que reconhece e se liga diretamente a ele. As moléculas de mRNA, por sua vez, estão complexadas com cerca de 20 proteínas, formando as

ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas ou hnRNP. Uma

dessas proteínas, ao menos, deve conter um sinal de expor­

tação nuclear, que é reconhecido e ligado a uma exportina, formando o complexo de exportação. Durante o processo de translocação através do complexo de poro, a exportina é reco­ nhecida pelas sequências FG presentes nas Nup que consti­ tuem os filamentos nucleares e o canal central do complexo de poro e atuam como trilhos no transporte do complexo exportina-mRNA para o citoplasma. Uma vez no citoplasma, a exportina libera sua carga e retorna ao núcleo, onde pode ser reutilizada em outro processo de exportação. Como será visto mais adiante, também os rRNA são exportados do núcleo na forma de partículas complexadas com proteínas, ou seja, na forma de subunidades ribossômicas.

• A Ran controla o sentido da translocação

de moléculas pelos poros

A direção do transporte de moléculas entre o núcleo e o citoplasma é regulada pela Ran (do inglês RAs-related nuclear protein), uma proteína de baixo peso molecular pertencente à família das enzimas que quebram GTP ou GTPases. Os receptores de importação nuclear (importinas) e de expor­ tação (exportinas) contam com dois domínios: um que se liga à Ran e outro que se liga à molécula a ser transportada (Figura 8.8). A Ran hidrolisa o GTP, fornecendo energia para a translocação das moléculas por meio dos complexos de

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Biologia Celular e Molecul:r

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Figura 8.8 • Representações esquemáticas do transporte de moléculas através dos complexos de poro. À esquerda, está representado o processo de importação de mo­ léculas pelo núcleo. Nesse processo, a molécula a ser importada contém um sinal de localização nuclear (SLN) que é reconhecido pela importina e se liga a ela. O complexo importina-molécula importada liga-se às sequências FG das Nup (1), que funcionam como trilhos e fazem a translocação do complexo através do canal central do poro

(2 e 3). No interior do núcleo (4), a RanGTP liga-se à importina, fazendo com que ela libere a molécula importada no nucleoplasma. À direita, o processo de exportação se inicia quando a molécula a ser exportada, contendo um sinal de exportação nuclear (SEN), é reconhecida pela exportina, liga-se a ela e à RanGTP (1). Esse complexo e

reconhecido pelas sequências FG das Nup (2) e é translocado através do canal central do poro (3). Já no citoplasma, a Ran, ativada pela RanGAP, hidrolisa o GTP, assumindo a configuração RanGDP. A molécula exportada e a exportina são liberadas no citoplasma (4).

poro. A Ran pode adotar dois estados conformacionais dife­ rentes, dependendo da sua ligação à molécula de GTP ou de GDP, sendo a RanGTP concentrada no núcleo e a RanGDP, no citoplasma.

O processo de importação inicia-se no citoplasma, quando a proteína que contém o sinal de importação nuclear liga-se à importina. O complexo proteína-importina atravessa o com­ plexo de poro, como visto anteriormente, e, então, no núcleo, a RanGTP liga-se à importina, promovendo uma alteração conformacional no sítio de ligação da importina e causando a liberação da proteína no nucleoplasma. O complexo impor­ tina-RanGTP retorna ao citoplasma, no qual outra proteína, chamada GAP (do inglês GTPase-activating protein) ou pro­ teína ativadora de GTPase, induz a atividade hidrolítica da Ran, que quebra o GTP, adotando a configuração RanGDP e liberando a importina no hialoplasma.

Na exportação, que se inicia no núcleo, a exportina liga-se, ao mesmo tempo, à proteína que contém o sinal de exportação nuclear e à RanGTP (Figura 8.8). Esse complexo é translocado através do complexo de poro, e, uma vez no citoplasma, a Ran, ativada pela GAP, hidrolisa o GTP, assumindo a configuração RanGDP, liberando a proteína e a exportina no citoplasma. A exportina retorna ao núcleo, no qual irá participar de um novo processo de exportação.

• A lâmina nuclear confere forma e

estabilidade ao envoltório nuclear

Associada à superfície interna do envoltório nuclear, encontra-se a lâmina nuclear, uma rede proteica com 20 a 50

nm de espessura (Figuras 8.1 e 8.4), que se interrompe nos poros nucleares. A lâmina é constituída pelas proteínas lami­ nas que pertencem a uma classe de filamentos intermediários nucleares. Nos vertebrados, há três genes que codificam sete tipos de laminas: duas do tipo A (A e AfllO) (Li - do grego, delta); duas do tipo C (C e C2) e três do tipo B (Bl, B2 e 83). As laminas dos tipos A e C são codificadas por um único gene, cujo RNA sofre diferentes modos de processamento (splicing alternativo), originando as quatro laminas. Os três tipos de laminas B, por sua vez, são codificados por dois genes, sendo que um deles, também por processamento diferencial, origina as laminas 81 e 82. Todas as células de vertebrados expressam pelo menos uma lamina do tipo B, enquanto as laminas do tipo A e C são expressas em células diferenciadas. Sugere-se que as laminas apresentem funções célula e tecido-específicas.

Cada molécula de lamina é um dímero de subunidades proteicas que se associam através das porções em a-hélice de cada cadeia polipeptídica e tem duas porções não helicoidais nas extremidades de cada cadeia. As extremidades não

heli-8 1 Núcleo da Célula

coidais, carboxi e aminoterminal, variam entre os diferentes tipos de laminas e estabelecem associações cabeça-cauda for­ mando os protofilamentos. Os protofilamentos, por sua vez, associam-se lateralmente, formando filamentos muito pareci­ dos com os filamentos intermediários do citoesqueleto, razão pela qual são classificados como tal.

As laminas associam-se ao envoltório nuclear por meio de proteínas intrínsecas à membrana nuclear interna, tais como as LAP 1 e 2, a emerina e a LBR (Figura 8.4). Elas se associam também aos complexos de poro, provavelmente por meio das nucleoporinas.

Durante a mitose, a fosforilação temporária das laminas causa a desorganização da lâmina nuclear. Ao final da mitose, as laminas são desfosforiladas e se associam novamente para refazer a lâmina, levando à reconstituição do envoltório nuclear.

Além de manter a forma e garantir suporte estrutural ao envoltório nuclear, a lâmina nuclear também é responsável pela ligação das fibras cromatínicas ao envoltório. A observação de que alterações na lâmina afetam várias funções nucleares levou à proposição de funções adicionais para a lâmina nuclear, tais como participação nos processos de replicação e transcrição do DNA, na expressão gênica, na manutenção do citoesque­ leto e na sobrevivência da célula.

Mutações nos genes que codificam proteínas presentes ou associadas ao envoltório nuclear causam uma série de doenças genéticas denominadas

envelopatias. Dentre as envelopatias, podemos citar as laminopatias, que são causadas por mutações no gene que codifica a lamina A. Várias dessas síndro­ mes já estão descritas na literatura. A distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), ocasionada por uma mutação no gene que codifica a proteína intrín­ seca emerina, é uma miopatia degenerativa caracterizada por contraturas dos músculos dos calcanhares, cotovelos e pescoço. Com o progresso da doença, a condução cardíaca é alterada, podendo levar o paciente à morte. Outro tipo de mutação que ocorre no gene que codifica a lamina A ocasiona uma distrofia muscular menos grave que a EDMD, mas que também causa anormalidades cardíacas. O diagnóstico precoce dos efeitos cardíacos da doença pode salvar a vida de seus portadores.

• O material genético está na

forma de cromatina

O termo cromatina ( do grego croma, cor) designa, com exceção dos nucléolos, toda a porção do núcleo que se cora e é visível ao microscópio de luz. Em células eucariontes, o DNA se complexa com proteínas específicas, constituindo a cro­ matina. Sua organização é dinâmica, pois se altera de acordo com a fase do ciclo celular e com o seu grau de atividade. No núcleo interfásico, a cromatina se apresenta compactada e/ou descompactada (Figura 8.9). No núcleo em divisão (mitose ou meiose), a cromatina está altamente compactada, constituindo os cromossomos. Assim, a cromatina e os cromossomos repre­ sentam dois aspectos morfológicos e fisiológicos da mesma estrutura.

A disposição da cromatina no interior do núcleo e o seu grau de condensação variam de um tipo celular para outro e são característicos de cada tipo celular. Além disso, a mesma célula pode apresentar cromatina com vários graus de

conden-sação, de acordo com o estágio funcional e com o estado de diferenciação em que se encontra.

De modo geral, as células nervosas e os espermatócitos (células precursoras dos espermatozoides), em certa fase, apresentam cromatina pouco condensada (Figura 8.10). Os plasmócitos (células produtoras dos anticorpos) apresentam núcleos com grumos densos de cromatina. Os eritroblastos

(eritro, vermelho, e blasto, germe), células que se transformam nos glóbulos vermelhos do sangue, sofrem uma condensação gradual da cromatina durante sua maturação (Figura 8.9), e esse processo culmina, nos mamíferos, com a expulsão do núcleo. Como será estudado mais adiante, o estado de con­ densação da cromatina tem um significado funcional impor­ tante.

• A cromatina é constituída por DNA

complexado com proteínas

As proteínas que se associam ao DNA para formar a cro­ matina são classificadas em histônicas e não histônicas. Além disso, sempre que a cromatina é isolada, encontra-se pequena quantidade de RNA associado a ela.

O DNA, segundo o modelo de Watson e Crick, é constituído por duas cadeias de polinucleotídios complementares e antipa­ ralelas, que se associam por pontes de hidrogênio, formando uma dupla hélice com diâmetro de 2 nm (Capítulo 3). A quan­ tidade de DNA por núcleo varia de uma espécie para outra e é característica de cada espécie. Essa quantidade, expressa em pares de bases (pb), é chamada de valor C. As células somá­ ticas, diploides, têm um conteúdo 2C de DNA, enquanto os gametas, que têm um conteúdo de DNA reduzido à metade, apresentam uma quantidade C de DNA. Nos núcleos das célu­ las eucariontes, o valor de C varia de 107 até 1011 pb.

Nos seres vivos, a análise do conteúdo de DNA mostra, em geral, um incremento à medida que se progride na escala evolu­ tiva (Figura 8.11). Entre os vertebrados existem exceções entre o nível evolutivo e o conteúdo de DNA, e o caso mais evidente é o de certos urodelos, com teor cerca de 30 vezes superior ao humano. Nos peixes pulmonados, também se encontram altas taxas de DNA, e, em ambos os casos, desconhece-se o signi­ ficado biológico desse fenômeno. Essa discrepância na quan­ tidade de DNA entre os organismos foi chamada de paradoxo do valor C, o qual é uma consequência direta da comprovação de que a quantidade de DNA nas células dos vertebrados está acima do teor mínimo necessário para armazenar a informação genética da espécie. Esse fato levou à proposição de que a maior parte do genoma de uma célula eucarionte não é funcional ou tem outras funções que não a codificação de proteínas. Alguns aspectos referentes a esse aparente excesso de DNA serão discu­ tidos mais adiante neste capítulo.

O RNA associado à cromatina representa 3% da sua com­ posição e é constituído, basicamente, de cadeias de RNA nas­ centes, que ainda estavam associadas à fita molde do DNA no momento em que a cromatina foi isolada.

As fibras cromatínicas apresentam DNA associado a proteí­ nas básicas, as histonas. As histonas são proteínas bastante estáveis, não sendo renovadas constantemente, como a maioria

Biologia Celular e Moleculr

Figura 8.9 • Eletromicrografia de corte de medula óssea. As quatro células que aparecem com seus núcleos são eritroblastos, precursores dos eritrócitos. A cromatina, nesses núcleos, mostra diferentes graus de condensação, e os eritroblastos mais maduros apresentam os núcleos mais condensados. 1 1 .OOOx.

Figura 8.10 • Eletromicrografia de célula do testículo. A cromatina descompactada está uniformemente dispersa no núcleo. As duas membranas que compõem o envol­ tório nuclear estão bem visíveis. O nucléolo mostra uma estrutura enovelada. 1 O.OOOx.

8 1 Núcleo da Célula

Vírus

Conteúdo de DNA nos organismos Mamíferos = 100% 0,01 0,1 1 ,0 1 0 100 Mamífero_e Réptil. 106 107 Anfíbio Teleósteoe Elasmobrânquio 10ª

Número de pares de bases por célula

109 Figura 8.11 • Conteúdo de DNA encontrado na árvore filogenética. (Dados de Hood, L.E. et ai. Molecular Biology of Eucariotic Cells. Benjamin Publ., 1975.)

das proteínas celulares. A quantidade em massa de histonas é, aproximadamente, igual à do DNA total do núcleo, em uma razão de 1:1. Essas proteínas têm peso molecular baixo e apre­ sentam forte caráter básico, pois são ricas nos aminoácidos básicos (carga positiva), arginina e lisina. Elas se ligam ao DNA graças à interação de seus radicais amino com os radi­ cais fosfato do DNA. Nem todos os radicais fosfato estão neu­ tralizados pelas histonas, o que confere à cromatina um cará­ ter ácido, isto é, uma grande capacidade para ser corada por

corantes básicos, propriedade denominada basofilia. Como as bases nitrogenadas não se ligam às histonas, as interações DNA-histonas independem da sequência de nucleotídios do DNA.

Há cinco tipos principais de histonas, classificadas de acordo com seu teor em lisina e/ou arginina: Hl, H2A, H2B,

H3 e H4. As histonas H2A, H2B, H3 e H4 são moléculas pequenas, com 102 a 135 aminoácidos. Esses quatro tipos de histonas partilham uma estrutura molecular comum, com as cadeias polipeptídicas constituídas por três sequências dispos­ tas em a -hélice e conectadas por duas sequências filamento­ sas, que se dispõem como alças (Figura 8.12). Elas apresentam um longo segmento N-terminal composto principalmente por aminoácidos básicos. Os aminoácidos das histonas podem ser acetilados, metilados ou fosforilados, processos que levam a