Docagem Molecular

Em geral, docagem é a identificação dos modos de interação com baixa energia de uma molécula pequena dentro do sítio ativo de uma macromolécula cuja estrutura é conhecida. Um composto capaz de interagir com uma proteína associada a uma doença, pode inibir a sua função e, assim, atuar como um fármaco. Cada programa de docagem utilizado nesta tese exigiu uma preparação diferente.

32

Tabela 2.1 - Alguns dos parâmetros mais importantes usados no programa FILTER para montagem da coleção inicial de fragmentos

Parâmetro Valor Definição

MIN_NUM_HVY 0 Número mínimo de átomos diferentes de hidrogênio MAX_NUM_HVY 21 Número máximo de átomos diferentes de hidrogênio

MIN_ROT_BONDS 0 Número mínimo de ligações rotacionáveis

MAX_ROT_BONDS 5 Número máximo de ligações rotacionáveis

MIN_LIPINSKI_DONORS 0 Número mínimo de hidrogênios ligados a O e N MAX_LIPINSKI_DONORS 3 Número máximo de hidrogênios ligados a O e N

MIN_LIPINSKI_ACCEPTORS 0 Número mínimo de átomos de O e N

MAX_LIPINSKI_ACCEPTORS 6 Número máximo de átomos de O e N

MIN_2D_PSA 0 Área superficial polar bidimensional mínima

MAX_2D_PSA 80 Å Área superficial polar bidimensional máxima MIN_XLOGP -2.0 Logaritmo do coef. de partição octanol/água mínimo MAX_XLOGP 3.0 Logaritmo do coef. de partição octanol/água máximo

AGGREGATORS true Elimina agregadores conhecidos*

PRED_AGG true Elimina agregadores preditos*

* _{Esse filtro inclui dois parâmetros relacionados à identificação de uma molécula como um dos agregadores definidos} por Shoichet e colaboradores.[96, 97] O primeiro parâmetro, AGGREGATORS, permite determinar se a molécula corresponde exatamente a um dos cerca de 400 agregadores publicados na literatura. O segundo, PRED_AGG, indica se as moléculas se encaixam no modelo de QSAR proposto para prever agregadores.

2.1.2.1. LMW-PTP

Para a LMW-PTP foi adotada a estratégia de docagem consensual (para definição, consultar seção 2.2.2.1), utilizando uma estrutura cristalográfica anteriormente determinada no nosso grupo, que continha o ligante PMS no sítio ativo e empregando os programas conforme apresentado a seguir.

FRED [98] (Fast Rigid Exhaustive Docking; FRED version 2.2.5. OpenEye

Scientific Software, Santa Fe, NM): é um programa de docagem rígida de pequenas moléculas em proteínas. A avaliação da flexibilidade do ligante requer uma coleção multiconformacional de cada molécula como arquivo de entrada (algoritmo de busca multiconformacional). A coleção de fragmentos obtida foi submetida a um protocolo

33

para geração de conformações 3D. Para isso, o módulo Makefraglib e o programa Omega [99, 100] (OMEGA version 2.4.3 OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM) foram utilizados, o primeiro está implementado no pacote que acompanha o Omega e tem a função de fragmentar a molécula em ligações simples (onde há rotação). Já o segundo, constrói a molécula em diferentes conformações. Para a docagem, uma estrutura contendo o ligante PMS foi adotada, conforme será abordado na seção 2.2.2.1. A proteína foi preparada no módulo FREDRECEPTOR que acompanha o pacote do programa FRED. Nele, foram removidas moléculas de água e definido o sítio ativo como sendo a região da proteína onde se espera que os fragmentos interajam. Essa região foi delimitada tendo como guia o ligante cocristalizado com a proteína. A forma do sítio ativo foi descrita por dois mapas de contorno denominados interno e externo. O mapa externo é grande, com 1068 Å3_{, sendo um critério obrigatório, ou seja,}

toda a molécula deve estar contida dentro dessa região. O mapa interno é menor, com 205 Å3_{, sendo que o programa exige que ao menos o centro de um átomo diferente de}

hidrogênio de qualquer uma das posições encontradas na docagem (também chamadas de poses) esteja nessa região. Além disso, restrições foram adicionadas aos resíduos Leu13 e Arg18, com relação às interações de van der Waals e ligação de hidrogênio, respectivamente. Essas interações foram observadas na estrutura contendo o ligante PMS e por isso escolhidas de modo a direcionar as posições dos fragmentos no sítio de interação. Uma docagem teste foi feita com o ligante da estrutura cristalográfica a fim de validar os parâmetros utilizados. FRED doca multiconfôrmeros em um único receptor usando uma pesquisa exaustiva que pesquisa sistematicamente rotações e translações de cada conformação do ligante dentro do sítio ativo. Após a busca exaustiva as poses de pontuação superior são otimizadas e é atribuída uma pontuação final. Em ambas as etapas foi utilizada a função de pontuação chemgauss3 [98, 101].

DOCK6.0: O programa realiza um procedimento automático de docagem de uma

molécula em um local do receptor. Neste método, a proteína é mantida rígida e as pequenas moléculas, flexíveis. Moléculas de água presentes na estrutura cristalina da proteína foram removidas. O sítio da enzima foi definido como o conjunto de aminoácidos em que pelo menos um átomo estivesse numa distância ≤ 7,0 Å do ligante.

34

Os átomos de hidrogênio e cargas parciais foram adicionados à enzima usando o módulo Dock Prep do programa Chimera [30]. De modo similar ao feito para o programa FRED, uma docagem de teste do ligante também foi feita. O banco de fragmentos foi submetido à docagem sem a necessidade da geração de multiconformações. Isso se deve ao algoritmo implementado no programa, que é baseado em fragmentos (também chamado de construção incremental). Neste algoritmo, o ligante é ‘construído’ incrementalmente dentro do sítio ativo. No DOCK6.0, o ligante é divido em um núcleo rígido, chamado de fragmento base, que é docado dentro do sítio ativo. Em seguida, as demais partes da molécula (partes flexíveis) são adicionadas de maneira incremental.

As pontuações obtidas em cada programa foram avaliadas por análise consensual. Os programas foram escolhidos pela rapidez com que docam extensas coleções de compostos e por apresentarem algoritmos de busca diferentes. Após a análise consensual, uma nova etapa de docagem, com uma coleção menor e mais focada de fragmentos, foi feita utilizando o programa GOLD.

GOLD [102-104]: é um programa muito utilizado dentro da comunidade de

modelagem molecular por sua precisão e confiabilidade, que utiliza algoritmos genéticos (AG) para docagem. Trata-se de um algoritmo estocástico, no qual é feita uma busca aleatória para um ligante ou população de ligantes. AG’s trabalham com uma população de indivíduos, onde cada indivíduo representa uma possível solução para o problema a ser resolvido. A cada geração, faz-se uma nova recombinação de genes de modo a introduzir novas possibilidades. Este processo é repetido de maneira que a população evolua para melhores soluções, até que um critério de parada pré- determinado seja satisfeito. Para este trabalho, a proteína foi preparada utilizando o módulo Wizard do pacote de visualização do GOLD, chamado Hermes. Nesta etapa, foram adicionados todos os hidrogênios a fim de assegurar os corretos estados de protonação e tautomerização na proteína. O sítio de interação foi definido como sendo a região de até 10 Å em torno do ligante cocristalizado e a função de avaliação adotada foi a goldscore. Neste trabalho, foi utilizada uma biblioteca de isômeros rotacionais, conferindo flexibilidade aos resíduos Cys12, Cys17, Arg18, Tyr49, Glu50, Asp129, Tyr131 e Tyr132. O uso do programa GOLD foi feito em sistema operacional Windows

35

7, gentilmente disponibilizado pelo Prof. Dr. Ronaldo Aloise Pilli em seu laboratório, no Instituto de Química/Unicamp.

2.1.2.2. CDC25B

Para a fosfatase CDC25B, foi realizada uma abordagem diferente, envolvendo análise consensual da docagem de sete estruturas distintas desta proteína provenientes do banco de dados Protein Data Bank e de estudos de Dinâmica Molecular. Para a docagem foi utilizado o programa FRED (FRED version 2.2.5. OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM. http://www.eyesopen.com). Conforme será apresentado na seção 2.2.2.2, no caso da CDC25B, foram realizadas docagens utilizando sete diferentes estruturas, sendo cinco delas provenientes de estudos de Dinâmica Molecular [105]. Agradecemos ao Prof. Dr. Guilherme Menegon Arantes (Instituto de Química/USP) por disponibilizar os arquivos referentes a estas estruturas.

FRED: as etapas de preparação dos fragmentos e da proteína foram feitas

conforme descrito para a docagem utilizando o programa FRED para a enzima LMW- PTP. A forma do sítio ativo também foi descrita por dois mapas de contorno denominados interno e externo conforme volumes apresentados na Tabela 2.2. Além disso, restrições foram adicionadas aos resíduos Phe475 e Ser477, com relação às interações de van der Waals e ligação de hidrogênio, respectivamente. Estas interações foram escolhidas como forma de direcionar a docagem, com o objetivo de se obter apenas fragmentos capazes de interagir no fundo do sítio e com resíduos do loop catalítico. Nas etapas de busca exaustiva e otimização das poses obtidas, a função

chemgauss3 [98, 101] foi utilizada.

Tabela 2.2 - Volume dos mapas de contorno usados para definir o síto de docagem

Estrutura Volume Å3

1QB0 Interno: 131 Externo: 1711

1QB0-cortada Interno: 200 Externo: 1111

DM1 Interno: 370 Externo: 1341

DM2 Interno: 270 Externo: 1553

DM3 Interno: 136 Externo: 1582

DM4 Interno: 144 Externo: 2177

36