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EMANUELLA MARIA BARRETO FONSECA
NOVOS INIBIDORES DE LMW-PTP E CDC25B: PLANEJAMENTO
BASEADO EM FRAGMENTOS MOLECULARES COM USO DE
MÉTODOS IN SILICO, ENSAIOS DE INIBIÇÃO E CRISTALOGRAFIA DE
PROTEÍNAS
CAMPINAS 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
EMANUELLA MARIA BARRETO FONSECA
NOVOS INIBIDORES DE LMW-PTP E CDC25B: PLANEJAMENTO
BASEADO EM FRAGMENTOS MOLECULARES COM USO DE
MÉTODOS IN SILICO, ENSAIOS DE INIBIÇÃO E CRISTALOGRAFIA DE
PROTEÍNAS
ORIENTADOR: PROF. DR. RICARDO APARICIO
COORIENTADOR: PROF. DR. MUNIR SALOMÃO SKAF
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM CIÊNCIAS.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR EMANUELLA MARIA BARRETO FONSECA, E ORIENTADA PELO PROF.DR. RICARDO APARICIO.
______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2015
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Dedico esta Tese à minha mãe, Graça Barreto, e à minha irmã, Raphaella Fonseca
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AGRADECIMENTOS
A Deus pela vida.
A minha família pela educação, pelas oportunidades, pelas orações e pelo amor que me deram suporte em cada nova etapa da minha vida.
Ao Prof. Dr. Ricardo Aparicio por ter aceitado a orientação deste trabalho. Ao Prof. Dr. Munir Salomão Skaf por aceitar me coorientar e pelos conselhos. A todos os membros da banca pela disponibilidade e correções.
Aos colegas de grupo pela amizade, descontrações durante o período de desenvolvimento da tese e discussões: Valéria Scorsato, Fábio Lazzarotto de Oliveira, Dra. Daniela Barretto Barbosa Trivella, Dr. Marcelo Augusto dos Reis, Kishore Reddy Mandapati, Mariana Pereira Dias, Caroline Moreira Aguiar, Caio Nakavaki.
À Dra. Deborah de Alencar Simoni pela amizade e apoio durante as coletas de dados no difratômetro.
À Profa. Dra. Carmen Veríssima Ferreira pela orientação nos ensaios enzimáticos, bem como ao seu grupo, em especial à Dra. Maruska do Rocio Neufert Fernandes pelo apoio com o ensaio de viabilidade celular.
Ao Prof. Dr. Ronaldo Aloise Pilli pelo suporte e apoio.
Ao Prof. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda pela colaboração em diversas etapas deste trabalho.
Ao amigo Geraldo Sartori pelas conversas e ajuda com os scripts.
Aos funcionários do Instituto de Química da UNICAMP pelo profissionalismo e competência.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa no início da execução do projeto que originou esta tese.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de doutorado – processo nº 2011/15792-4.
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Curriculum vitae
Formação Acadêmica Graduação
Licenciatura em Química, Universidade Federal de Lavras, 2005-2009. Mestrado
Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Química
Título: Planejamento de Inibidores da Cruzaína baseado em Fragmentos. Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Montanari (IQSC/USP)
Bolsista da: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Ingresso: Agosto/2009 – Defesa: 27/07/2011.
Doutorado
Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química
Título: Novos inibidores de CDC25 e LMW-PTP: planejamento baseado em fragmentos moleculares com uso de métodos in silico e Cristalografia de Proteínas
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Aparício (DFQ/IQ/UNICAMP) Coorientador: Prof. Dr. Munir Salomão Skaf (DFQ/IQ/UNICAMP) Bolsista da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Ingresso: Agosto/2011 – Defesa: 16/01/2015.
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Projetos de Iniciação Científica
08/2008 – 07/2009 - Estágio desenvolvendo trabalhos de QSAR 5D e 6D de inibidores da HIV-1 protease sob orientação da Profa. Dra. Elaine F. F. da Cunha. Departamento de Química/UFLA.
08/2008 – 07/2009 - Bolsista do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica PIBIC/CNPq desenvolvendo o projeto de pesquisa intitulado " Estudos de ancoramento molecular e correlação estrutura-atividade em 4D e 5D de inibidores da COX-2" sob orientação do Prof. Dr. Teodorico de Castro Ramalho e coorientação da Profa. Dra. Elaine F. F. da Cunha. Departamento de Química/UFLA.
08/2007 – 01/2008 - Bolsista do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica PIBIC/CNPq desenvolvendo o projeto de pesquisa intitulado " Solos do quadrilátero ferrífero (MG): mineralogia, elementos-traço, magnetização, taxonomia e perspectiva ambiental" sob orientação do Prof. Dr. Nilton Curi. Departamento de Ciências do Solo/UFLA.
08/2006 – 07/2008 - Bolsista do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica PIBIC/CNPq desenvolvendo o projeto de pesquisa intitulado "Mineralogia, elementos-traço, classificação e geomorfologia de solos do quadrilátero ferrífero (MG)" sob orientação do Prof. Dr. Nilton Curi. Departamento de Ciências do Solo/UFLA.
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Participação em cursos e workshops
1. Cristalografia estrutural: curso teórico e prático intensivo. 2012. (Belo Horizonte – Brasil)
2. ESPCA - Advanced Topics in Computational Biology / Agrochemical and Drug Design. 2012 (Campinas - Brasil)
3. 47th Course of the International School of Crystallography. “Structural Basis of Pharmacology: Deeper Understanding of Drug Discovery through Crystallography” (2014) (Erice – Itália)
4. Workshop: Virtual Screening: How to do it better and how to know you are doing better. 2014 (Campos do Jordão – Brasil)
5. Workshop: Beyond the Rule of Five. 2014 (Campos do Jordão – Brasil)
6. 7th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry. 2014 (Campos do Jordão - Brasil)
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Produção bibliográfica
Principais trabalhos apresentados em congressos (resumo)
1. MANDAPATI, K. R., FONSECA, E. M. B., SCORSATO, V., PILLI, R. A., APARICIO, R., MIRANDA, P. C. M. L. Design of Novel Phosphatases Inhibitors: Synthesis and Inhibition Studies In: 7th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, 2014, Campos do Jordão.
2. FONSECA, E. M. B., SCORSATO, V., FERREIRA-HALDER, C. V., APARICIO, R. Discovery of LMW-PTP and CDC25B Inhibitors based on Virtual Screening and in vitro Assays In: 7th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, 2014, Campos do Jordão.
3. FONSECA, E. M. B., SCORSATO, V., DIAS, M. P., FERREIRA, C. V., PILLI, R. A., APARICIO, R. Fragment-based discovery of phosphatase inhibitors In: 47th Course of the International School of Crystallography “Structural Basis of Pharmacology: Deeper Understanding of Drug Discovery through Crystallography”, 2014, Erice.
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4. MANDAPATI, K. R., FONSECA, E. M. B., PILLI, R. A., APARICIO, R. Binding studies of substituted 2-oxo-2-(phenylamino) acetic acids and phenylsulfamic acids as potential inhibitors of PTP1B In: 23ª Reunião Anual de Usuários LNLS/CNPEM, 2013, Campinas.
5. SCORSATO, V., TRIVELLA, D. B. B., FONSECA, E. M. B., DIAS, M. P., PASTRE, J. C., FERREIRA, C. V., PILLI, R. A., APARICIO, R. Inhibition studies of human PTP1B, a phosphatase involved in cancer. In: 23ª Reunião Anual de Usuários LNLS/CNPEM, 2013, Campinas.
6. FONSECA, E. M. B., TRIVELLA, D. B. B., SCORSATO, V., BAZZO, N. L., OLIVEIRA, F. L. de, PILLI, R. A., MIRANDA, P. C. M. de L., APARICIO, R. Using docking studies for the development of LMW-PTP inhibitors based on fragments In: 23ª Reunião Anual de Usuários LNLS/CNPEM, 2013, Campinas.
7. FONSECA, E. M. B., APARICIO, R. New inhibitors of CDC-25 e LMW-PTP: fragment-based drug design using in silico methods and protein crystallography In: Sao Paulo School of Advanced Science, 2012, Campinas. Advanced Topics in Computational Biology / Agrochemical and Drug Design.
8. FONSECA, E. M. B., ROCHA, J. R. et al. Planejamento de Inibidores da Enzima Cruzaína Baseado em Fragmentos: Docagem e Dinâmica molecular In: 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2011, Florianópolis.
9. FONSECA, E. M. B., ROCHA, J. R. et al. On the use of GRID/CPCA approach to recognize hot spots in S2 pocket of cruzain enzyme In: 5th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, 2010, Ouro Preto.
10. FONSECA, E. M. B., da CUNHA, E. F. F., RAMALHO, T. C. Estudos quantitativos de correlação estrutura-atividade de uma série análogos do Rofecoxib inibidores da COX-2 In: 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2009, Fortaleza.
11. FONSECA, E. M. B., de SOUZA, T.C.S., da CUNHA, E. F. F. Modelagem por homologia da ciclooxigenase-2 humana In: XXII Congresso de Iniciação Científica da UFLA, 2009, Lavras.
12. FONSECA, E. M. B., ALBUQUERQUE, M. G., da CUNHA, E. F. F. et al. Estudos de ancoramento molecular de potenciais inibidores da NS2B/NS3 serino-protease do virus da dengue-2 In: XXI Congresso de Iniciação Científica da UFLA - CIUFLA, Lavras.
13. FONSECA, E. M. B., LOPES, J. H., MARTINS, P. F. Q. et al. Influência da adição de ácidos orgânicos na estrutura de blendas poliméricas de amido/glicerol In: 31ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2008, Águas de Lindóia.
14. de SOUZA, T.C.S., FONSECA, E. M. B., da CUNHA, E. F. F. Quantitative structure-activity relationship studies of HIV-1 protease inhibitors. In: 4th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, 2008, Porto de Galinhas.
Artigos publicados em periódicos
1. MACHADO, A. R. T., MARTINS, P. F. Q., FONSECA, E. M. B. et al. Compósitos biodegradáveis a base de polihidroxibutirato-hidroxivalerato (PHB-HV) reforçados com resíduos do beneficiamento do café. Matéria (UFRJ). v.15, p.400 - 404, 2010.
2. Cunha, Elaine F. F. da, Ramalho, Teodorico C., Mancini, Daiana T. et al. New approaches to the development of anti-protozoan drug candidates: a review of patents. Journal of the Brazilian Chemical Society, v.21, p.1787 - 1806, 2010.
3. Oliveira, Luiz C.A., Zaera, Francisco, Lee, Ilkeun, Fonseca, Emanuella M.B. et al. Nb-doped hematites for decomposition of isopropanol: Evidence of surface reactivity by in situ CO adsorption. Applied Catalysis. A, General. v.368, p.17 - 21, 2009.
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Produção Técnica
Produtos tecnológicos: patente
PEREIRA, J., LOPES, J. H., FONSECA, E. M. B., MACHADO, A. R. T. et al. Compósito biodegradável obtido a
partir de amido e glicerol incorporado com ácidos orgânicos de cadeia curta com diferentes propriedade ópticas. PI0903958-9, 2009.
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Programa de Estágio Docente
Bolsista do Programa de Estágio Docente do Instituto de Química/UNICAMP
1. 2012/1S - QF732 – Físico-Química Experimental II
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RESUMO
NOVOS INIBIDORES DE LMW-PTP E CDC25B: PLANEJAMENTO BASEADO EM FRAGMENTOS MOLECULARES COM USO DE MÉTODOS IN SILICO, ENSAIOS DE INIBIÇÃO E CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS
O câncer é uma doença cuja incidência e prevalência atinge proporções alarmantes, estabelecendo-se, hoje, como um problema mundial de saúde pública. A fosforilação de proteínas é um evento dinâmico e reversível, governado pela atividade oposta de proteínas quinases e proteínas fosfatases. Níveis elevados das fosfatases LMW-PTP e CDC25B foram observados em uma ampla variedade de tumores e, assim, estas foram selecionadas como alvo para o desenvolvimento de novos inibidores. Utilizando métodos in silico, uma coleção, contendo aproximadamente 500 mil fragmentos, foi montada a partir de um banco de compostos comerciais. Para cada enzima, esses fragmentos foram submetidos a distintos protocolos de docagem molecular, através dos quais 19 pequenas moléculas foram selecionadas e adquiridas comercialmente. Os resultados computacionais foram validados por ensaios de inibição enzimática, tendo sido identificados novos esqueletos moleculares capazes de inibir mais do que 50% da atividade enzimática, obtendo-se valores de eficiência do ligante de até 0,33 kcal mol-1
por átomo diferente de hidrogênio. Paralelamente, uma série de compostos derivados do ácido benzenofosfônico foi ensaiada frente à LMW-PTP após estudos de docagem, seguindo-se estudos cristalográficos que levaram à obtenção de duas estruturas inéditas: uma com a proteína na forma apo e outra de um complexo LMW-PTP:inibidor. Além do sítio ativo já conhecido, observou-se um segundo sítio cristalográfico cuja potencial função biológica, se confirmada, poderia abrir novas possibilidades para modular a atividade da LMW-PTP, perspectiva que demanda investigação.
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ABSTRACT
NEW INHIBITORS OF LMW-PTP AND CDC25B: FRAGMENT-BASED DRUG DESIGN USING IN SILICO METHODS, INHIBITION ASSAYS AND PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY
Cancer is a disease whose incidence and prevalence have reached alarming proportions, emerging today as a major public health problem. Protein phosphorylation is a dynamic and reversible event, governed by the opposite activities of protein kinases and protein phosphatases. High levels of the phosphatases LMW-PTP and CDC25B have been observed in a wide variety of tumors and, for this reason, they have been selected as targets for inhibitor development. Using in silico methods, a collection of approximately 500,000 fragments was assembled from a database of commercial compounds. For each enzyme, these fragments were subjected to different molecular docking protocols, through which 19 small molecules have been selected and purchased. The computational results were validated by enzyme inhibition assays, with the identification of new molecular scaffolds capable of inhibiting in more than 50% the enzyme activity, resulting in ligand efficiency values up to 0.33 kcal mol-1 per non-H
atom. Similarly, a number of compounds derived from benzenophosphonic acid was tested against the LMW-PTP after docking studies, followed by crystallographic studies which resulted in two new structures: one of the apo protein and another of a complex LMW-PTP:inhibitor. In addition to the previously described active site, a second crystallographic site was identified, whose potential biological function, if confirmed, might open new possibilities to modulate LMW-PTP activity, in a perspective which demands further investigation.
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SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ... XIX LISTA DE TABELAS ... XXIII LISTA DE FIGURAS ... XXV
CAPÍTULO 1 ... 1
1. CÂNCER, PROTEÍNAS TIROSINA FOSFATASES E PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS BASEADO EM FRAGMENTOS ... 3
1.1. Perfil histórico ... 3
1.2. Câncer e as proteínas fosfatases ... 4
1.3. Proteína tirosina fosfatase (PTP) ... 8
1.3.1. LMW-PTP: fosfatase de baixa massa molecular ... 9
1.3.2. CDC25: fosfatase com dupla especificidade ... 13
1.4. Planejamento de fármacos baseado em fragmentos ... 17
1.4.1. Métodos Computacionais – Docagem Molecular ... 22
1.4.2. Cristalografia de Proteínas ... 24
1.5. Objetivos ... 27
CAPÍTULO 2 ... 29
2. SELEÇÃO E ENSAIOS DE INIBIÇÃO DE FRAGMENTOS ... 31
2.1. Materiais e Métodos ... 31
2.1.1. Banco de Fragmentos ... 31
2.1.2. Docagem Molecular ... 31
2.1.2.1. LMW-PTP... 32
2.1.2.2. CDC25B... 35
2.1.3. Expressão e Purificação das Tirosina Fosfatases ... 36
2.1.4. Ensaio de Inibição ... 37
xviii
2.2. Resultados e Discussão ... 42
2.2.1. Banco de Fragmentos ... 42
2.2.2. Seleção dos Fragmentos ... 47
2.2.2.1. LMW-PTP... 47
2.2.2.2. CDC25B... 56
2.2.3. Ensaios de Inibição Enzimática ... 62
2.2.4. Estudos Cristalográficos ... 71
CAPÍTULO 3 ... 79
3. ESTUDOS DE DERIVADOS DO ÁCIDO BENZENOFOSFÔNICO COMO INIBIDORES DE LMW-PTP ... 81
3.1. Materiais e Métodos ... 81
3.1.1. Docagem Molecular ... 81
3.1.2. Ensaios de Inibição Enzimática ... 83
3.1.3. Estudos Cristalográficos ... 83
3.1.4. Ensaios de Viabilidade Celular ... 84
3.2. Resultados e Discussão ... 85
3.2.1. Docagem Molecular ... 85
3.2.2. Ensaios de Inibição Enzimática ... 88
3.2.3. Estudos Cristalográficos ... 90 CAPÍTULO 4 ... 99 4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ... 101 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 103 A. ANEXO 1 ... 115 B. ANEXO 2 ... 116
xix
LISTA DE ABREVIATURAS
ADME: absorção, distribuição, metabolismo e eliminação AG: algoritmo genético
ASU: unidade assimétrica ATP: adenosina trifosfato
CDC25B: do inglês, cell division cycle 25 B - ciclo de divisão celular 25 B CDK: do inglês, cyclin-dependent kinase - quinase dependente de ciclina clogP: coeficiente de partição octanol/água calculado
DM: Dinâmica Molecular DMSO: dimetilsulfóxido
DNA: ácido desoxirribonucleico DTT: ditiotreitol
EphA2: receptor de efrina A2
FBDD: do inglês, Fragment Based Drug Discovery – descoberta de fármacos baseado em fragmentos
Fcalc: fator de estrutura calculado
Fobs: fator de estrutura observado
GnRH: hormônio liberador de gonadotrofinas
HAC: do inglês, Heavy Atom Account – número de átomos diferentes de hidrogênio HBA: do inglês, Hydrogen Bond Acceptor – aceitador de ligação de hidrogênio HBC: agente causador da hepatite C
HBD: do inglês, Hydrogen Bond Donnor – doador de ligação de hidrogênio HBV: agente causador da hepatite B
Hepes: ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etano-sulfônico HPV: vírus do papiloma humano
HTS: do inglês, high-throughput screening – ensaio em larga escala IC50: concentração para inibir 50% da atividade enzimática
INCA: Instituto Nacional do Câncer
IPTG: isopropil--D-1-tiogalactopiranosídeo KM: constante de Michaelis-Menten
xx
LB: meio Lysogeny Broth, também referido como Luria Broth, Lennox Broth ou Luria-Bertani
LE: do inglês, ligand efficiency – eficiência do ligante
LMW: do inglês, low molecular weight – baixa massa molecular MC: Monte Carlo
MES: ácido 2-N-morfolinoetanossulfônico MM: massa molecular
MT: ácido málico:Tris
Myt1: fator de transcrição de mielina 1
NCE: do inglês, New Chemical Entity – nova entidade química NLA: ácido 1-naftilacético
NPS: mistura de Na2HPO4, KH2PO4 e (NH4)2SO4
NROT: número de ligações rotacionáveis OMFP: fosfato de 3-o-metilfluoresceína OMS: Organização Mundial da Saúde PDB: Protein Data Bank
PDGF-R: receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas PEG: polietilenoglicol
PLAP: fosfatase alcalina de placenta humana
P-loop: do inglês, phosphate binding loop- loop de ligação do fosfato PMS: ácido fenil-metanossulfônico
PMSF: fluoreto de fenil-metil-sulfonila pNP: para-nitrofenol
pNPP: para-nitrofenil-fosfato
PSA: do inglês, Polar Surface Area – área superficial polar
PTP: do inglês, Protein Tyrosine Phosphatase – proteína tirosina fosfatase PTP1B: proteína tirosina fosfatase 1B
pThr: resíduo de treonina fosforilado pTyr: resíduo de tirosina fosforilado Rfree: fator residual livre
xxi
RMSD: do inglês, Root Mean Square Deviation – desvio da raiz quadrada média Ro3: do inglês, rule-of-three – Regra dos três
TB: meio Terrific Broth
Tris: tris(hidroximetil)aminometano v/v: volume/volume
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LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 - Alguns dos parâmetros mais importantes usados no programa FILTER para montagem da coleção inicial de fragmentos ... 32 Tabela 2.2 - Volume dos mapas de contorno usados para definir o síto de docagem .. 35 Tabela 2.3 - Sequências dos resíduos de aminoácido das PTPs estudadas neste trabalho... 38 Tabela 2.4 - Estruturas cristalográficas da LMW-PTP ... 48 Tabela 2.5 - Interações preditas para os fragmentos selecionados para a LMW-PTP .. 54 Tabela 2.6 - Estruturas cristalográficas da CDC25B ... 57 Tabela 2.7 - Interações preditas para os fragmentos selecionados para a CDC25B .... 60 Tabela 2.8 - Relação dos fragmentos selecionados com os respectivos Códigos ZINC e fornecedor ... 65 Tabela 2.9 - IC50 e LE (kcal mol-1 por átomo diferente de hidrogênio) determinadas para
os fragmentos que apresentaram maior inibição nos ensaios de dose única. ... 69 Tabela 2.10 - Descrição dos conjuntos coletados para as fosfatases alvo. O cristal relativo ao primeiro ligante foi indexado em P21. O empacotamento cristalino e
dimensões de rede são os mesmos dos cristais pertencentes ao grupo P212121. ... 72
Tabela 3.1 - Condições de cristalização dos complexos de LMW-PTP ... 90 Tabela 3.2 - Parâmetros e estatísticas da coleta de dados e refinamento estrutural. Valores entre parênteses referem-se à última camada de resolução. ... 91 Tabela B.1 - Códigos do fornecedor dos compostos selecionados nesta seção ... 117 Tabela B.2 - IC50 e LE (kcal mol-1 por átomo diferente de hidrogênio) determinadas para
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 - Mecanismo catalítico das proteínas tirosina fosfatases ... 10 Figura 1.2 - Estrutura cristalográfica da LMW-PTP. Os resíduos do sítio ativo estão destacados em laranja. a) PDB ID 5PNT [14] – detalhe para o sítio ativo contendo o tampão MES, b) PDB ID 3N8I [23] – detalhe para o chamado sítio secundário contendo o ligante NLA e c) empacotamento cristalino mostrando que, devido a contatos cristalinos, o sítio ativo da LMW-PTP encontra-se obstruído. ... 11 Figura 1.3 - Algumas classes de inibidores relatados para a LMW-PTP. Entre parênteses é apresentado o valor de IC50 em M [26-29]. ... 12
Figura 1.4 - Algumas classes de inibidores relatados para a CDC25B. Em parênteses é apresentado o valor de IC50 em M [37, 43-53]. ... 15
Figura 1.5 - a) Estrutura cristalográfica da CDC25B (PDB ID 1QB0) [57]. Os resíduos do sítio ativo estão destacados em laranja. No detalhe, a presença do íon sulfato no sítio ativo e na região chamada de ‘hotspot’ (Arg488, Arg492 e Tyr497). b) empacotamento cristalino. ... 16 Figura 1.6 - a) Estruturas cristalográficas da CDC25B contendo um polipeptídio (BASF) [59], íon tungstato (PDB ID 1CWS) e íon sulfato (PDB ID 1CWT) no sítio ativo [57], b) detalhe do resíduo de cisteína (Cys473) oxidado no sítio ativo [58]. ... 17 Figura 1.7 - Comparação da massa molecular pela potência no desenvolvimento de um composto matriz. As linhas pontilhadas mostram os limites de massa molecular da ‘Regra dos 5’ (500) e da ‘Regra dos 3’ (300). Adaptado de Scott e colaboradores [75]. 20 Figura 1.8 – Otimização do fragmento. a) Combinação de diferentes fragmentos b) Crescimento do fragmento, pedaço a pedaço (Adaptado de Zoete e colaboradores) [77] ... 21 Figura 1.9 – Etapas para obtenção de estrutura cristalográfica ... 26 Figura 2.1 – Espectrofotômetro SpectraMax M2e (Molecular Devices) usado na leitura dos dados de inibição. ... 39
xxvi
Figura 2.2 – Esquema do mecanismo de reação das PTPs com os substratos sintéticos pNPP (a) e OMFP (b). ... 40 Figura 2.3 – Distribuição dos valores de HAC, XlogP, HBA, HBD, PSA e NROT para os fragmentos do banco construído neste estudo ... 46 Figura 2.4 - Representação do modo de interação do PMS no sítio da LMW-PTP. Mapa de densidade eletrônica (2Fobs-Fcal a 1.2) observados para o PMS no sítio da
LMW-PTP ... 49 Figura 2.5 - Sobreposição das poses obtidas pela redocagem do PMS na LMW-PTP nos programas FRED (molécula em azul) e DOCK6.0 (molécula em verde). A molécula do ligante PMS da estrutura cristalográfica está representada pela cor dos átomos - carbono: cinza, enxofre: amarelo e oxigênio: vermelho. ... 51 Figura 2.6 - Processo de escalonamento das pontuações obtidas através do uso de diferentes programas. ... 52 Figura 2.7 - Fragmentos selecionados para a LMW-PTP. ... 53 Figura 2.8 – Modo de interação observado por docagem para os fragmentos EM21 e EM38 no sítio da LMW-PTP. Nos diagramas, carbonos, oxigênios, nitrogênios e fósforo estão representados pelas cores preta, vermelha, azul e roxo, respectivamente. As linhas verdes representam ligação de hidrogênio e ao aros vermelhos indicam contato hidrofóbico. ... 55 Figura 2.9 - Superfície das estruturas da CDC25B utilizadas para a docagem dos fragmentos e sobreposição destas, evidenciando as diferentes orientações encontradas por DM para a porção C-terminal (laranja). O sítio ativo foi destacado em amarelo. .... 58 Figura 2.10 - Fragmentos selecionados para a CDC25B. ... 59 Figura 2.11 – Sobreposição da posição de todos os fragmentos no sítio ativo de cada estrutura de CDC25B usada. ... 61 Figura 2.12 – Gel de eletroforese da purificação da LMW-PTP ... 62 Figura 2.13 – Gel de eletroforese da purificação da CDC25B ... 63
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Figura 2.14 – Ensaios da enzima LMW-PTP para adequação dos ensaios com os fragmentos. Variação a) da concentração, b) tempo de reação, c) pH e d) Temperatura. ... 64 Figura 2.15 - Ensaio de inibição em dose única contra as fosfatases, mostrando a atividade remanescente na presença da coleção de fragmentos planejados para a LMW-PTP (em vermelho) e para a CDC25B (azul) ... 66 Figura 2.16 – Taxa de sucesso deste trabalho na seleção de inibidores das PTPs e exemplos da literatura para estudos envolvendo a seleção in silico de compostos para ensaios de inibição para a LMW-PTP e CDC25B ... 68 Figura 2.17 – Cristais de LMW-PTP crescidos na presença do composto EM31 ... 73 Figura 2.18 – Difratômetro Bruker Kappa APEX II Duo do Instituto de Química/Unicamp ... 74 Figura 2.19 – a) Padrão típico de difração e b) exemplo do mapa de densidade eletrônica (2Fobs-Fcal a 1.2) observados para a LMW-PTP (limite de resolução de 2,45
Å), na tentativa de cocristalização com o composto EM31... 75 Figura 2.20 – Cristais típicos de CDC25B usados nos testes de soaking ... 76 Figura 2.21 – a) Padrão típico de difração e b) exemplo do mapa de densidade eletrônica (2Fobs-Fcal a 1.2) observados para a CDC25B (limite de resolução de 1,90
Å). ... 77 Figura 3.1 – Estruturas da série desenhada com base na estrutura cristalográfica contendo o ligante PMS... 82 Figura 3.2 - PMSF e o seu produto de hidrólise PMS ... 83 Figura 3.3 – Posição dos compostos 6 e 14 no sítio ativo da LMW-PTP ... 86 Figura 3.4 – Modo de interação predito a partir da pose obtida na docagem molecular, para os ligantes no sítio ativo da LMW-PTP: a) 1, b) 9, c) 11, e d)18. Nos diagramas, carbonos, oxigênios, nitrogênios e fósforo estão representados pelas cores preta, vermelha, azul e roxo, respectivamente. As linhas verdes representam ligação de hidrogênio e ao aros vermelhos indicam contato hidrofóbico. ... 87
xxviii
Figura 3.5 - Ensaios de inibição: a) ensaio de inibição em dose única, b) gráfico de Dixon para composto 2, c) gráfico de Dixon para composto 3 – Compostos 1 a 6 referentes à Figura 3.1 e composto 7 referente ao PMS – Figura 3.2 ... 89 Figura 3.6 – a) sítio secundário na estrutura A, b) sítio secundário na estrutura B. Em ciano é destacado o loop catalítico. É destacada também a cauda de expressão (Tabela 2.3), o mapa de trabalho (2Fobs-Fcalc) é apresentado a 1.2 sigma (em azul). ... 92
Figura 3.7 – a) superposição da estrutura PDB ID 3N8I com os resíduos F-1 e E-2 da estrutura A e b) modo de interação predito para os resíduos da cauda de expressão no sítio secundário. ... 93 Figura 3.8 – a) Estrutura A contendo o ligante B85 no sítio ativo. Mapas de trabalho (2Fobs-Fcalc) desenhados a 1.2 sigma (em azul) mostrando regiões adequadamente
modeladas. ... 95 Figura 3.9 – a) Estrutura B contendo águas no sítio ativo. Mapas de trabalho (2Fobs
-Fcalc) desenhados a 1.2 sigma (em azul) mostrando regiões adequadamente
modeladas. b) Sobreposição com a estrutura contendo o composto 1. c) Modo de interação predito para as moléculas de água ocupando o sítio ativo da estrutura B, formando uma rede de ligações de hidrogênio. ... 97 Figura B.1 - Estruturas dos compostos selecionados (direita) baseando-se nos melhores fragmentos inibidores (esquerda). Não foi possível adquirir análogos dos compostos EM23, EM27 e EM30. ... 118 Figura B.2 - Ensaios de inibição em dose única contra as fosfatases, mostrando a atividade remanescente na presença da coleção de fragmentos planejados para a LMW-PTP (azul), CDC25B (vermelho) e PTP1B (preto) ... 119
1
CAPÍTULO 1
Câncer,
proteínas
tirosina
fosfatases
e
3
1. Câncer, proteínas tirosina fosfatases e planejamento de fármacos
baseado em fragmentos
1.1.
Perfil histórico
Câncer é uma das maiores causas de morte no mundo, contabilizando 8,2 milhões de mortes em 2012, sendo mais incidentes os casos de câncer de pulmão, estômago, fígado, colorretal e mama. Mais de 60% das mortes por câncer em 2012 ocorreram na África, Ásia, América Central e do Sul. Aproximadamente 30% das mortes por câncer se devem aos cinco principais riscos comportamentais e dietéticos: índice de massa corporal elevado, baixo consumo de frutas e vegetais, falta de atividade física, tabagismo e uso de álcool. O uso do tabaco é o fator de risco mais importante para a doença, causando 20% das mortes globais por câncer e 70% das mortes por câncer de pulmão. Câncer por infecções virais, como HBV/HCV e HPV (agente causador da hepatite B e vírus do papiloma humano), são responsáveis por até 20% das mortes por câncer em países de baixa e média renda. Antes vista como doença de países ricos, hoje muitos casos da doença são observados em países em desenvolvimento. Os dados referentes a esta enfermidade atingiram proporções tão grandes que estabelecem um problema de saúde pública mundial [1-3].
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que em 2030 são esperados 27 milhões de casos incidentes de câncer, 17 milhões de mortes e 75 milhões de pessoas vivas, anualmente, com a doença. No entanto muitas destas mortes poderiam ser evitadas. Mais de 30% de casos de câncer podem ser prevenidos através de ações para o enfrentamento da doença, como investimento em educação, saúde e adição de um estilo de vida saudável, atividades de promoção à prevenção e imunização. Além disso, alguns tipos podem ser detectados cedo, tratados e curados. Mesmo pacientes com a doença em estágio final, podem ter seu sofrimento aliviado com cuidados paliativos [1, 2].
No Brasil, o problema do câncer vem apresentando um perfil de aspecto epidemiológico. A estimativa do Instituto Nacional do Câncer (INCA) do Ministério da Saúde é de 576 mil novos casos para 2015, sendo os cânceres de pele tipo não
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melanoma, de próstata e de mama os mais incidentes na população, correspondendo a 308 mil casos [3].
Esse perfil levou o Ministério da Saúde a incluir ações de controle como um de seus 16 objetivos para o período 2011-2015. Prova disso são as campanhas contra o tabagismo e a recente vacinação de meninas contra o HPV (vírus do papiloma humano), conferindo imunização contra quatro subtipos do vírus (6, 11, 16 e 18). O HPV é responsável por cerca de 70% dos casos de câncer do colo do útero em todo mundo [3].
1.2.
Câncer e as proteínas fosfatases
As células que constituem o corpo dos organismos multicelulares formam uma comunidade de tecidos altamente organizados. Os órgãos crescem até atingirem certo tamanho porque suas células obedecem aos sinais recebidos para entrar na fase G-zero do ciclo celular e interromper a proliferação. As células cancerosas apresentam alterações no DNA e, por isso, escapam dos mecanismos de controle do ciclo celular [4].
O câncer é um termo genérico para um grande grupo de doenças que podem afetar qualquer parte do corpo. Outros termos utilizados são tumores malignos e neoplasias. O tumor surge de uma única célula que sofreu mutação, multiplicou-se por mitose e suas descendentes foram acumulando outras mutações que se foram somando até darem origem às células cancerosas. Tais células proliferam-se muito, perdem a capacidade de aderência, secretam enzimas capazes de atacar a matriz extracelular, espalhando-se no organismo e proliferando em locais distantes de sua origem, onde produzem tumores secundários. Esses tumores secundários são denominados metástases, sendo esta a principal causa de morte por câncer [4].
Existem muitos tipos diferentes de células normais e quase todos esses tipos podem gerar tumores. Isso implica em dizer que existem também muitos tipos de células cancerosas, produzindo tumores que diferem entre si pelo grau de malignidade e resposta ao tratamento. Tumores malignos recebem nomes diferentes relacionados aos tecidos onde são originados: carcinomas (originados de células epiteliais de
5
revestimento), adenocarcinoma (células epiteliais secretoras), osteossarcoma (osteoblasto) e condrossarcoma (células de cartilagem) [4].
A transformação de uma célula normal numa célula de tumor é o resultado da interação entre fatores genéticos de uma pessoa e três categorias de agentes externos, incluindo:
a) carcinogênicos físicos, como a radiação ultravioleta e ionizante;
b) carcinogênicos químicos, como amianto, componentes da fumaça do tabaco, aflatoxina (um contaminante de alimentos) e arsênio (um contaminante de água potável);
c) carcinogênicos biológicos, como infecções por determinados vírus, bactérias ou parasitas.
O envelhecimento é outro fator fundamental para o desenvolvimento de câncer. A incidência da doença aumenta drasticamente com a idade, provavelmente devido a uma acumulação de riscos para tipos específicos de câncer. O risco global de acumulação é combinado com a tendência de mecanismos de reparação celular serem menos eficazes quando a pessoa envelhece.
O tratamento do câncer pode ser feito através de cirurgia, imunoterapia, radioterapia, quimioterapia ou transplante de medula óssea. Em muitos casos, é necessário combinar mais de uma modalidade. O objetivo é curar a doença ou prolongar a vida consideravelmente, melhorando a qualidade de vida do paciente. O diagnóstico e o tratamento são complementados por suporte psicológico. Alguns dos tipos de câncer mais comuns, como câncer de mama, de colo uterino, bucal e colorretal têm maiores taxas de cura quando detectados precocemente e tratados de acordo com as práticas recomendadas [5].
A cirurgia é o tratamento mais antigo para o câncer, sendo durante muito tempo o único que podia curar o paciente. O tratamento cirúrgico do câncer mudou drasticamente ao longo das últimas décadas. Os avanços nas técnicas cirúrgicas e uma melhor compreensão dos padrões de propagação das células tumorais têm permitido que os cirurgiões realizem com sucesso ressecções para número crescente de doentes. O desenvolvimento de estratégias alternativas de tratamento levou os cirurgiões a reavaliar a magnitude da necessidade de cirurgia. O cirurgião que trata o câncer deve
6
estar familiarizado com os princípios e potencialidades não somente da cirurgia, como também da radioterapia, quimioterapia, imunoterapia e outras novas modalidades de tratamento [5].
A história da radioterapia para o tratamento do câncer remete ao final do século XIX, após a descrição de Wilhelm Roentgen de raios X em 1895 e a descoberta do rádio por Marie e Pierre Curie, em 1898. Nas primeiras décadas do século XX, radiação ionizante tinha sido utilizada para tratar uma variedade de tumores humanos. Avanços tecnológicos na segunda metade do século XX, levou ao desenvolvimento de unidades de telecobaltoterapia. Estas eram capazes de produzir raios X de energia mais alta, que poderiam penetrar mais profundamente no tecido e reduzir a dose para a pele e, portanto, representando um enorme avanço na capacidade para tratar tumores internos. Além disso, ao longo dos últimos anos, novas ferramentas foram desenvolvidas, aumentando a habilidade de colocar a dose de radiação em locais difíceis, permitindo um tratamento mais eficaz dos tumores, protegendo melhor os tecidos normais adjacentes. Em décadas recentes, a radioterapia tornou-se uma opção de tratamento padrão para uma vasta gama de doenças malignas [5].
O desenvolvimento da quimioterapia nas décadas de 1950 e 1960 resultou na disponibilidade de estratégias terapêuticas para os pacientes com doenças hematológicas malignas e vários tipos de tumores sólidos avançados. Esses avanços confirmaram o princípio de que a quimioterapia poderia realmente curar o câncer e forneceu justificativa para a integração de quimioterapia em programas de terapias combinadas com cirurgia e radioterapia nos estágios iniciais da doença, de modo a fornecer benefício clínico. Os principais obstáculos para a eficácia clínica de quimioterapia têm sido a toxicidade para os tecidos normais do corpo e o desenvolvimento de resistência celular ao fármaco. A melhor compreensão das vias moleculares pelo qual a quimioterapia exerce sua atividade citotóxica tem proporcionado uma base racional para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras [5].
A quimioterapia envolve o uso de pequenas moléculas capazes de destruir o tumor ou cessar seu crescimento. Um dos primeiros agentes usados clinicamente foi a mostarda de nitrogênio (mecloretamina – agente alquilante), que foi descoberta
7
acidentalmente durante da 1ª Guerra Mundial [6]. A partir de então, várias classes de quimioterápicos foram desenvolvidas ou descobertas, sendo três delas destacadas no Quadro 1.1.
Quadro 1.1 - Exemplos de alguns quimioterápicos usados atualmente[6]
Classe Exemplos
Antimetabólitos Análogo do ácido fólico: metotrexato Análogo de purina: 6-mercaptopurina Análogo de pirimidina: citarabina
Terapia Hormonal
Modulador seletivo do receptor de estrógeno: Tamoxifeno
Análogos do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH): goserelina
Anticorpos Monoclonais Indução da lise de células de linfócitos B: rituximabe
Inibidor de angiogênese: bevacizumabe
O quadro atual é caracterizado pela existência de tratamentos de elevado custo e índice terapêutico relativamente reduzido. Apesar das diversas classes farmacológicas disponíveis de agentes quimioterápicos para tratamento do câncer, nenhuma delas têm se mostrado capaz de erradicar as células cancerosas sem afetar tecidos normais. Assim, a descoberta de novas abordagens terapêuticas torna-se um dos principais desafios de nossa época, com investimentos significativos em pesquisa feitos tanto pela indústria farmacêutica global quanto pelos governos de diferentes países [7].
Novas drogas anticâncer inovadoras (por exemplo, o rituximabe e bevacizumabe) são importantes dentro dos regimes de tratamento recomendados para certas neoplasias malignas, no entanto, seus custos de aquisição são relativamente altos, enquanto que seus benefícios podem parecer modestos [7].
O balanço entre fosforilação e desfosforilação de proteínas controla diversos eventos biológicos disparados por efetores extracelulares, como hormônios,
8
carcinógenos, mitógenos. Em consequência da ação destes efetores, ocorre regulação da divisão, diferenciação, desenvolvimento e morte celular, regulação do metabolismo e expressão gênica. A adição ou remoção do grupamento fosfato de uma proteína pode gerar um “motivo” de reconhecimento para a interação proteína-proteína, controlar a estabilidade proteica e, mais importante, modular a atividade de enzimas [8].
Aproximadamente 30% das proteínas celulares são fosfoproteínas [9]. As fosfatases são hidrolases que utilizam como substratos fosfomonoésteres. Em células eucarióticas, a maioria da fosforilação de proteínas ocorre em resíduos de tirosina, serina e treonina, catalisada por proteínas quinases, ao passo que as proteínas fosfatases exercem efeitos regulando negativamente e/ou positivamente as vias de sinalização e no controle fisiológico de uma variedade de tecidos [8, 10]. Numa transformação oncogênica, o nível de proteínas fosforiladas em resíduos de tirosina aumenta de 1% a 2% na célula. Mudanças anormais na atividade dessas enzimas acarretam na fosforilação inapropriada de resíduos de tirosina, o que contribui para o desenvolvimento de várias patologias que incluem diabetes, doenças resultantes de defeitos imunológicos e o câncer – foco dos estudos aqui apresentados [8, 11].
Com base na função, estrutura, sequência, especificidade, ativadores e inibidores, as proteínas fosfatases podem ser agrupadas em dois grandes grupos: proteínas serina/treonina fosfatases e proteínas tirosina fosfatases [8]. Neste trabalho, as proteínas tirosina fosfatases (LMW-PTP e CDC25B), descritas a seguir, foram selecionadas como alvo para a descoberta e o desenvolvimento de inibidores enzimáticos.
1.3.
Proteína tirosina fosfatase (PTP)
As proteínas tirosina fosfatases (PTPs) são uma grande família de enzimas responsáveis pela hidrólise do fosfato ligado aos resíduos de tirosina em proteínas, sendo caracterizadas por possuírem um domínio altamente conservado com uma sequência consenso no sítio catalítico característico desta família, CX5R (CXXXXXR,
onde C - cisteína, R -arginina e X - qualquer aminoácido), compartilhando um padrão de sítio ativo constituído de uma cisteína e uma arginina, que são essenciais para a catálise enzimática. Esta sequência forma um loop, onde o grupo fosfato do substrato
9
se liga e é conhecido como P-loop (do inglês, Phosphate binding loop – loop de ligação do fosfato). Todas as PTPs têm mecanismos catalíticos idênticos, os quais envolvem a formação de um intermediário cistenil-fosfato. Elas estão envolvidas em uma série de processos como metabolismo celular, proliferação, diferenciação e transformação oncogênica [8, 10, 12].
Estruturas tridimensionais de PTPs vêm ajudando a entender a função da enzima a nível molecular, por definir as interações que estabilizam a estrutura do sítio ativo e a formação do complexo enzima-substrato. Com base na função, estrutura e sequência, as proteínas tirosina fosfatases podem ser agrupadas em três famílias principais: proteínas tirosina fosfatases específicas, de baixa massa molecular e proteína fosfatase com dupla especificidade. Estudos cinéticos e estruturais detalhados das subfamílias das PTPs revelaram um mecanismo químico comum para reações catalisadas por estas enzimas [13-18].
A Figura 1.1 é uma representação do mecanismo catalítico das PTPs. O resíduo de cisteína desprotonada promove o ataque nucleofílico ao fósforo da proteína fosforilada. Em seguida ocorre hidrólise do intermediário cistenil-fosfato por adição de uma molécula de água, completando o ciclo catalítico pela regeneração da enzima ativa. Na presença de agentes oxidantes, o resíduo de cisteína é oxidado e as enzimas tirosina fosfatases tendem a perder suas atividades.
1.3.1.
LMW-PTP: fosfatase de baixa massa molecular
A LMW-PTP (do inglês, Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase - EC 3.1.3.48) é uma enzima citoplasmática de 18 kDa, expressa em uma ampla variedade de tecidos de mamíferos. Ela apresenta similaridade sequencial muito limitada com outras PTPs, exceto pelo padrão de sítio ativo e mesmo mecanismo de catálise. O sítio ativo contém o motivo CX5R [19-21].
Uma característica única da LMW-PTP dentre todas as proteínas tirosina fosfatases é a presença de duas cisteínas (posições 12 e 17) no sítio catalítico, diferentemente de outras PTPs, que têm apenas uma cisteína – Figura 1.2a. Esta cisteína adicional confere à LMW-PTP a capacidade de recuperar rapidamente sua atividade após os processos oxidativos dos quais participa, atuando como um sensor
10
intracelular para a intensidade do estado redox. Neste contexto, sabe-se que a regulação da atividade da LMW-PTP pode ocorrer por um sistema redox refinado e tanto óxido nítrico quanto H2O2 inativam reversivelmente a LMW-PTP [22].
No Protein Data Bank tem-se duas estruturas depositadas desta enzima, uma contendo a molécula do tampão MES (ácido 2-N-morfolinoetanossulfônico) no sítio e outra contendo o ácido 1-naftilacético (NLA) em um sítio secundário (Figura 1.2a-b; PDB ID 5PNT e 3N8I, respectivamente) [14, 23]. Na Figura 1.2c é possível ver o empacotamento dessa fosfatase no grupo P212121. Devido a contatos decorrentes do
empacotamento cristalino, o sítio ativo da LMW-PTP encontra-se ocluído, impossibilitando estudos por soaking (vide definição detalhada na seção 1.4.2), sendo esta uma das limitações determinantes durante a execução deste trabalho.
Esta enzima é superexpressa em células cancerosas - câncer de mama, cólon, pulmão e um grupo de amostras de neuroblastoma [24]. Seu estudo se tornou de especial interesse para compreensão da biologia do câncer e o estabelecimento de novas estratégias de terapias para a doença [25]. Na literatura, diversas classes de inibidores de LMW-PTP foram relatadas, conforme exemplificado na Figura 1.3 [26-29].
11
Figura 1.2 - Estrutura cristalográfica da LMW-PTP. Os resíduos do sítio ativo estão destacados em laranja. a) PDB ID 5PNT [14] – detalhe para o sítio ativo contendo o tampão MES, b) PDB
ID 3N8I [23] – detalhe para o chamado sítio secundário contendo o ligante NLA e c) empacotamento cristalino mostrando que, devido a contatos cristalinos, o sítio ativo da
LMW-PTP encontra-se obstruído.1
1 O programa Chimera [30] (v. 1.8., 2013, http://www.cgl.ucsf.edu/chimera) foi usado para gerar as Figuras 1.2, 1.5 e 1.6 (neste capítulo)
a
b
12
Figura 1.3 - Algumas classes de inibidores relatados para a LMW-PTP. Entre parênteses é apresentado o valor de IC50 em M [26-29]. 2
2 Estruturas desenhadas com o programa MarvinSketch - Marvin 5.5.1.0, 2011 ChemAxon (http://www.chemaxon.com) – Figuras 1.3 e 1.4.
13
A LMW-PTP hidrolisa a ligação de fosfato em resíduos de tirosina e regula várias macromoléculas na progressão do câncer, incluindo receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-R) e o receptor de efrina-A2 (EphA2) [31-33]. Essa PTP atua como modulador fisiológico dos efeitos da PDGF no crescimento celular, desfosforilando a tirosina do loop de ativação do PDGF-R, reduzindo a atividade quinase desse receptor, e, deste modo, reduzindo o sinal mitogênico [31, 34].
Estudos demonstram que os níveis de expressão do receptor de efrina-A2 correlacionam-se com o grau de malignidade do tumor [35]. A superexpressão de LMW-PTP em células metastáticas leva à regulação positiva da expressão de EphA2, sendo que esta PTP pode ser considerada um oncogene que requer EphA2 para sua atividade oncogênica [32]. Em células de câncer agressivo, EphA2 não está com a tirosina fosforilada, o que sugere que a LMW-PTP tem papel no processo tumorigênico através da desfosforilação deste receptor [36].
1.3.2.
CDC25: fosfatase com dupla especificidade
As CDC25 (do inglês, cell division cycle 25 - EC 3.1.3.48) atuam na regulação do ciclo celular e estão envolvidas em eventos celulares essenciais, como crescimento, divisão e replicação. Elas ativam complexos quinase dependentes de ciclinas (CDK) desfosforilam duas treoninas adjacentes e resíduos de tirosina, permitindo a progressão do ciclo celular [37].
Essas enzimas são capazes de hidrolisar fosfatos monoésteres de peptídeos contendo fosfotirosina e fosfoserina/treonina, possuindo mais afinidade por fosfotirosina, sendo que esta característica dual parece estar relacionada à menor profundidade do sítio ativo de, aproximadamente, 6 Å nas PTPs de especificidade dupla e 9 Å nas PTPs específicas [8, 38, 39].
O genoma humano codifica três CDC25 homólogas, nomeadas CDC25A, B e C. O substrato fisiológico das CDC25 são quinases dependentes de ciclina (CDKs). CDKs são reguladoras chave na progressão do ciclo celular eucariótico, sendo mantidas inativas através da fosforilação de dois resíduos localizados no sítio de ligação do ATP (Thr14 e Tyr15) pelas quinases Wee1 e Myt1. As três CDC25 são responsáveis pela desfosforilação da pThr14 e pTyr15 (a letra p remete ao resíduo fosforilado) e, assim,
14
provocam a ativação final de complexos CDK/ciclinas. Em células de mamíferos, todas as três isoformas estão implicadas no controle das transições G1-S e G2-M do ciclo celular [40, 41].
Superexpressão de CDC25A e B foi observada em uma ampla variedade de tumores estando relacionadas a várias linhagens de células cancerígenas, incluindo mama, ovário, próstata, pulmão, câncer gástrico e hepatocarcinomas [42]. Essa expressão anormal muitas vezes está relacionada com o prognóstico reservado e, uma vez que as isoformas A e B possuem propriedades oncogênicas, fosfatases CDC25 são consideradas como alvos atraentes para novas abordagens no tratamento do câncer. Algumas classes de inibidores, descritos até o momento, são apresentadas na Figura 1.4 [37, 43-53].
A estrutura das proteínas CDC25 pode ser dividida em duas regiões. A região N-terminal, que é altamente divergente em sequência, contêm inúmeros sítios de fosforilação, que estão envolvidos na regulação da atividade da fosfatase, os níveis de proteína, e/ou associação com outras proteínas [42]. Na região C-terminal, por outro lado, está localizado o sítio catalítico das CDC25. A sequência característica das PTPs (CX5R), contendo a cisteína catalítica, é encontrada dentro deste domínio catalítico e
representa a única região de significativa identidade sequencial entre as CDC25 e outras PTPs. O sítio ativo superficial é bem adequado para permitir o acesso de ambos os substratos (contendo pThr e pTyr) à cisteína catalítica, em acordo com a dupla especificidade das CDC25 [42, 54]. Além disso, os resíduos Arg488, Arg492 e Tyr497, localizados a 20-30 Å do sítio ativo, foram identificados como os pontos com os quais a proteína substrato ancora na CDC25B e, por isso, são chamados de hotspots (Figura 1.5a) [55, 56]. Ao contrário do observado para a LMW-PTP, o empacotamento da CDC25B não resulta em obstrução do sítio, o que possibilita estudos utilizando soaking para obtenção de complexos fosfatase:fragmento (Figura 1.5b).
Atualmente não se tem estrutura cristalográfica depositada em bancos de dados de um complexo enzima-inibidor para a CDC25B, ocorrendo apenas estruturas com os íons WO4-2 e SO4-2 (PDB ID 1CWS e 1CWT, respectivamente) [57] no sítio ativo, ou
estruturas com a cisteína catalítica oxidada (PDB ID 1YMK, 1YML, 1YM9 e 1YMD) [58]. Além disso, estruturas cristalográficas contendo polipeptídios modificados foram
15
reportadas pela BASF em patente – Figura 1.6 a-b. Interessante também observar a presença de íon sulfato na região dos hotspots (PDB ID 1CWS e 1CWT) e do polipeptídio na estrutura da BASF [57, 59].
Figura 1.4 - Algumas classes de inibidores relatados para a CDC25B. Em parênteses é apresentado o valor de IC50 em M [37, 43-53].
16
Figura 1.5 - a) Estrutura cristalográfica da CDC25B (PDB ID 1QB0) [57]. Os resíduos do sítio ativo estão destacados em laranja. No detalhe, a presença do íon sulfato no sítio ativo e na
região chamada de ‘hotspot’ (Arg488, Arg492 e Tyr497). b) empacotamento cristalino.
Durante a preparação desta tese, duas novas estruturas da CDC25B (PDB ID 4WH7 e 4WH9) contendo inibidores foram publicadas. Trata-se da presença de fragmentos na região conhecida como ‘hotspot’, a 15 Å do sítio ativo da enzima. Esses inibidores atuam na faixa de milimolar, impedindo a interação da CDC25B com seu substrato, o complexo CDK2/Ciclina A [60].
a
17
Figura 1.6 - a) Estruturas cristalográficas da CDC25B contendo um polipeptídio (BASF) [59], íon tungstato (PDB ID 1CWS) e íon sulfato (PDB ID 1CWT) no sítio ativo [57], b) detalhe do resíduo
de cisteína (Cys473) oxidado no sítio ativo [58].
1.4.
Planejamento de fármacos baseado em fragmentos
No início da descoberta de medicamentos (de 1950 a cerca de 1980), os químicos medicinais tinham ferramentas limitadas e, por isso, gastavam muito tempo em sínteses comparado aos padrões atuais, geralmente 1 a 3 novos compostos por semana. A criatividade e a intuição eram essenciais para o sucesso de seus projetos, sendo que a “serendipidade”, quando o processo de descoberta se dá ao acaso, tinha um grande papel. Testes in vitro somente se tornaram disponíveis após os anos 1980 e 1990. Assim, modelos in vivo eram utilizados como testes iniciais [61].
Atualmente, existe uma ampla variedade de ferramentas avançadas como tecnologias em síntese, em química analítica e de purificação. Extensas bibliotecas de compostos se tornaram disponíveis para a realização de ensaios em larga escala
a
18
(HTS). Além disso, a revolução da genética viabilizou o uso de alvos moleculares definidos e o planejamento de fármacos baseado na estrutura do alvo [61].
O amplo espaço químico é um dos obstáculos encontrados no planejamento de moléculas bioativas utilizado para a realização da busca. Atualmente, o número de compostos existentes no Chemical Abstracts já ultrapassa 89 milhões, sendo que apenas 80.000 estão no banco mundial de fármacos (World Drug Index) [62, 63]. Considerando que o tamanho desse universo químico é em torno de 1060 moléculas,
candidatas a novas substâncias químicas bioativas (NCE, do inglês New Chemical
Entity), identificar as regiões do espaço que contém compostos biologicamente ativos
não é uma tarefa trivial [64].
Os limites desse espaço podem ser definidos pela interação específica de ligações entre as pequenas moléculas e os alvos macromoleculares, ou até o mesmo através do conhecimento de propriedades físico-químicas de ligantes conhecidos ou da informação sobre a topologia do alvo. Para navegar pelo vasto espaço químico-biológico, os químicos medicinais utilizam estratégias como planejamento de fármacos baseado na estrutura do receptor ou do ligante, o que inclui o uso de métodos em docagem molecular, similaridade química, relação estrutura atividade, entre outros [65].
Uma abordagem recorrente na química medicinal é a busca de inibidores enzimáticos através da modificação de substratos ou cofatores. Quando esta estratégia não é bem sucedida, um novo ponto de partida precisa ser identificado. Para isso podem ser usados ensaios de inibição em larga escala, os quais apresentam a desvantagem de terem elevado custo. Outra opção é a triagem virtual desses compostos a fim de estudar experimentalmente apenas compostos que apresentarem potencial para interagir com o alvo de interesse. Neste contexto, estudos envolvendo fragmentos se tornaram atrativos na última década, essencialmente nos estágios iniciais do planejamento de fármacos, uma vez que permitem a identificação de pequenas moléculas com baixa afinidade, que podem ser usadas como ponto de partida para otimização e obtenção de inibidores mais potentes [66].
A história do planejamento de fármacos baseado em fragmentos (FBDD) começa com o trabalho de Jencks [67], com a introdução do conceito de que uma molécula poderia ser entendida como a combinação de dois ou mais fragmentos. Posteriormente,
19
Goodford [68] desenvolveu um programa computacional chamado GRID onde pequenas moléculas, denominadas sondas, são usadas para mapear sítios de interação em proteínas. Em 2002, o primeiro composto planejado por essa abordagem entra na fase clínica, LY-517717, um inibidor do fator Xa. Mas é em 2003 que as pesquisas começam a crescer com a publicação da chamada ‘Regra dos três’ (Ro3) pelos cientistas da Astex Therapeutics [69-71].
Estima-se que o universo de fragmentos seja de aproximadamente 14 milhões de moléculas. Assim, ensaiar uma biblioteca de fragmentos pode capturar essencialmente um espaço químico mais diverso, com um número menor de compostos, do que em abordagens de HTS. Na montagem dessa biblioteca, alguns critérios são usados, como a própria Ro3, que prevê massa molecular < 300 Da, clogP ≤ 3 (coeficiente de partição octanol/água calculado) e átomos aceitadores ou doadores de ligação de hidrogênio ≤ 3. De acordo com o alvo macromolecular ou o planejamento experimental que se deseja seguir, mais regras podem ser adicionadas [64].
Uma biblioteca de fragmentos com boa solubilidade aquosa e um sistema de ensaio capaz de quantificar interações fracas são importantes pré-requisitos para a abordagem baseada em fragmentos. Fragmentos precisam ser solúveis em pelo menos 10-2 mol L-1 em tampões ou 10-1 mol L-1 para estoques em dimetilsulfóxido (DMSO) [66,
70].
A baixa complexidade desses compostos aumenta a chance de um evento de interação ou reconhecimento molecular acontecer devido à melhor complementaridade com o sítio de interação. Por outro lado, a baixa complexidade diminui a chance de detecção dessa interação, já que a potência pode ser muito baixa. Além disso, existe a probabilidade de interação não-específica ou fragmento que apresente múltiplos modos de interação [72].
Um conceito valioso em FBDD é da eficiência do ligante (LE). Primeiramente aplicado pelos cientistas da Pfizer para descrever a energia livre de interação média por cada átomo diferente de hidrogênio, é bastante útil para comparar séries diferentes e a eficácia da otimização de um composto [72, 73].
A Figura 1.7 mostra uma comparação entre a massa molecular e a potência de um inibidor durante o desenvolvimento de um composto-matriz, em abordagens HTS e
20
FBDD convencionais. Quando partimos de um composto fármaco-similar (definido pela ‘Regra dos 5’ de Lipinski) [74], o processo de otimização do composto requer ganho de potência, sem aumento de massa molecular para manutenção de uma alta eficiência. Por outro lado, ao se trabalhar com fragmentos, a otimização pode ser feita com ganho de massa molecular, uma vez que estes são ligantes altamente eficientes (região levemente colorida de laranja no gráfico).
Figura 1.7 - Comparação da massa molecular pela potência no desenvolvimento de um composto matriz. As linhas pontilhadas mostram os limites de massa molecular da ‘Regra dos 5’
(500) e da ‘Regra dos 3’ (300). Adaptado de Scott e colaboradores [75].
Fragmentos identificados como inibidores podem ser otimizados, aumentando seu tamanho, principalmente utilizando duas técnicas - a combinação de diferentes fragmentos (linking – Figura 1.8a) ou o crescimento do fragmento (growing – Figura 1.8b). Na primeira abordagem é necessário o conhecimento sobre o modo de interação de no mínimo dois fragmentos que interajam em regiões próximas na superfície da proteína. Um linker apropriado que possa manter as interações de ligação dos fragmentos individuais é então usado para uni-los formando um composto único. A
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necessidade de um linker que não afete o modo de interação dos fragmentos sozinhos torna o método de difícil aplicação [66].
No segundo caso, a orientação do fragmento no sítio de interação é usada para decidir como crescer o fragmento para pegar interações adicionais, em áreas adjacentes ao sítio de interação, visando aumentar a afinidade de ligação. Essa estratégia é menos problemática e robusta, já que apenas um fragmento inicial é requerido [66, 76].
Figura 1.8 – Otimização do fragmento. a) Combinação de diferentes fragmentos b) Crescimento do fragmento, pedaço a pedaço (Adaptado de Zoete e colaboradores) [77]
Devido ao crescente interesse no uso de FBDD nos últimos anos, várias metodologias têm sido desenvolvidas para aplicação nessa área, destacando-se o uso de calorimetria de titulação isotérmica, ressonância magnética nuclear, espectrometria de massas, cristalografia de proteínas e métodos computacionais [69, 70]. Destas, neste trabalho foram escolhidas duas que serão discutidas a seguir.
Vários trabalhos na literatura citam o uso de ensaios de fragmentos em larga escala utilizando cristalografia de proteínas. Um dos problemas nessa aplicação é o elevado investimento de recursos financeiros e o tempo requeridos para obter as estruturas cristalinas para grande quantidade de fragmentos. Uma alternativa é a
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utilização de técnicas de triagem antecedendo os estudos cristalográficos, como métodos in silico, seguidos de ensaios de inibição in vitro, para uma avaliação preliminar. Assim, são estudados apenas fragmentos que apresentem boa complementaridade pelo sítio e potencial para inibir os alvos macromoleculares. Assim, o uso de métodos in silico possibilita a obtenção de uma coleção refinada de fragmentos, com maior potencial para inibir as enzimas estudadas, possibilitando o uso dos estudos cristalográficos de modo mais focado e esperando maior taxa de acerto na identificação de moléculas ativas [78-80].
1.4.1.
Métodos Computacionais – Docagem Molecular
Métodos computacionais tem se tornado uma ferramenta dominante no planejamento de fármacos, uma vez que reduzem o tempo gasto e o custo com ensaios
in vitro, tornando o processo mais eficiente e eficaz. Com esta técnica espera-se obter
conhecimento suficiente para promover melhorias em propriedades como interação proteína-ligante. Na docagem molecular, procura-se predizer o modo de interação em condições fisiológicas de uma pequena molécula com o sítio de interação de um alvo macromolecular [77, 81-83].
De modo geral, a docagem pode ser descrita como a combinação de um algoritmo de busca e uma função de pontuação. O algoritmo de busca deve ser rápido o suficiente para cobrir o espaço conformacional de modo rápido, uma vez que o número de possíveis modos de interação de um ligante na superfície de uma proteína é virtualmente infinito. Já a função de pontuação precisa predizer a termodinâmica de interação adequadamente para distinguir, dentre os possíveis modos de interação, indicados pelo algoritmo de busca, qual é o mais provável [77, 82].
Os primeiros algoritmos de busca tratavam tanto proteína quanto ligante de modo rígidos, o que não reflete a realidade. Atualmente os programas incluem ao menos o grau de liberdade conformacional do ligante e se dividem em três categorias – métodos de busca sistemática, métodos estocásticos e métodos de simulação [77].
Os métodos de busca sistemática são baseados em fragmentação molecular. Em geral a molécula do ligante é dividida em fragmentos moleculares que são docados na superfície do receptor de maneira incremental. Isso implica em dizer que um fragmento
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base é escolhido primeiramente, e os demais vão se adicionando através de ligações covalentes, explorando um ângulo de torção por vez. Uma busca conformacional é realizada para cada ângulo de torção a partir de uma biblioteca de ângulos diedrais. Assim, um algoritmo de “corte” se faz necessário para eliminar conformações não favoráveis.
No método estocástico o ligante é considerado por inteiro e as mudanças conformacionais são adicionadas passo-a-passo para o ligante inicial. Os dois métodos mais utilizados nesta categoria são Monte Carlo (MC) e algoritmo genético (AG). No método MC, uma conformação inicial é usada como referência para a geração de uma conformação secundária. Se a conformação secundária apresentar energia menor que sua sucessora ela é aceita e usada como nova referência, do contrário, um critério é estabelecido para decidir se essa conformação será aceita, até que se obtenha o número mínimo desejado de conformações [77]. O método baseado em AG será melhor explorado na seção 2.1.2.1 [81].
Os métodos de simulação agrupam Dinâmica Molecular (DM) e métodos de minimização de energia. Na DM, os movimentos de cada átomo do sistema são obtidos resolvendo recursivamente as equações de Newton para tal sistema. Na minimização de energia, ocorre a exploração da superfície de energia potencial, de modo que o sistema atinja o mínimo local de energia e em geral é aplicado em conjunto com algum dos outros métodos descritos anteriormente [77].
Já as funções de pontuação podem ser divididas em três categorias: as baseadas no conhecimento (knowledge-based), as empíricas e as baseadas em campo de força. As funções baseadas no conhecimento utilizam as informações sobre interação ligante-receptor em estruturas determinadas experimentalmente. É feita uma análise estatística das geometrias dessas interações, a partir da qual é gerado um “pseudo-potencial”, que descreve as geometrias preferenciais de interação proteína-ligante [77].
As funções empíricas utilizam dados determinados experimentalmente e baseiam-se na ideia de que a energia livre de interação pode ser entendida como um somatório de termos relativos à ligação de hidrogênio, interação hidrofóbica e interação eletrostática, entre outros. Essas funções são muito dependentes do conjunto
