3. ESTUDOS DE DERIVADOS DO ÁCIDO BENZENOFOSFÔNICO COMO
3.1.4. Ensaios de Viabilidade Celular
Os ensaios de viabilidade celular foram realizados pela Dra. Maruska do Rocio Neufert Fernandes, no Laboratório de Bioensaios in vitro e Transdução de Sinal coordenado pela Profa. Carmen Veríssima Ferreira do Instituto de Biologia/Unicamp e seguiram as seguintes etapas:
Cultura de células: o cultivo das células Lucena foi realizado em meio RPMI,
contendo penicilina 100 U mL-1, sulfato de estreptomicina 100 µg mL-1 e suplementado
com 10% de soro fetal bovino e cultivadas em atmosfera umidificada, 5% CO2 a 37 °C.
A linhagem celular denominada Lucena-1 é uma linhagem derivada da eritro-leucêmica K562, possui múltipla resistência a fármacos e foi selecionada originalmente pela resistência ao alcalóide de Vinca, vincristina. A Lucena-1 caracteriza-se pelo fenótipo MDR, mecanismo de resistência a múltiplas drogas, e é atualmente, uma das causas mais frequentes de falha terapêutica do câncer [140].
Tratamento com ácido 1-naftilacético (NLA): o composto foi utilizado para a
análise da sensibilidade da linhagem celular Lucena-1. As células foram plaqueadas na densidade de 1 x 105 células mL-1 em placa de 24 poços e cultivadas em atmosfera
umidificada, 5% CO2 a 37 °C. O composto foi primeiramente diluído em DMSO de modo
que a concentração final de DMSO no meio de cultura fosse de 0,1%. Em seguida, o NLA foi diluído diretamente em meio de cultura nas concentrações de 50 µM e 100 µM e incubadas por 24 horas, células tratadas somente com o DMSO 0,1% foram consideradas como controle. Após 24 horas de tratamento com NLA, a viabilidade celular foi avaliada através do ensaio de redução do MTT. O experimento foi feito em quintuplicata.
Ensaio de viabilidade celular através da redução do MTT: terminado o período de
tratamento com o composto NLA, uma solução concentrada de corante MTT (0,5 mg mL-1) foi adicionada em todos os poços da placa (controle, 50 µM e 100 µM) e as
células foram incubadas por 2 horas a 37 °C. Após o período de incubação, a placa foi centrifugada, 4000 rpm, 20 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi retirado com muito cuidado e em seguida foi adicionado 1 mL de etanol por poço para a solubilização do formazan. A placa foi agitada por 10 minutos e a absorbância correspondente a cada poço foi lida em leitor de placas (ELx 800 BIO-TEK) em 570 nm
85
[141, 142]. Os valores foram expressos como porcentagens de redução do MTT em relação ao controle.
3.2.
Resultados e Discussão
3.2.1.
Docagem Molecular
Uma série de compostos derivados do ácido benzenofosfônico foi desenhada baseada na estrutura cristalográfica da LMW-PTP contendo o ligante PMS. Em sua maioria, propôs-se a substituição do grupo sulfonato pelo fosfonato, que mimetizaria a tirosina fosforilada, porém sem a presença do centro eletrofílico. Com isso, os compostos não sofreriam alterações estruturais decorrentes do processo de interação com a enzima, que cliva apenas ligações de fosfomonoéster.
Um aspecto interessante desta série é que ela atende a alguns dos critérios utilizados para a montagem da biblioteca de fragmentos relatados no Capitulo 2, como número máximo de átomos diferentes de hidrogênio ser igual a 21, número máximo de átomos doadores de ligações de hidrogênio ser igual a 3 e de aceitadores ser igual a 6.
Esta série foi submetida a estudos de docagem a fim de verificar quais compostos apresentariam complementaridade de forma e química com a LMW-PTP. Para isso foi empregada a mesma metodologia utilizada na primeira etapa de docagem dos compostos do banco de fragmentos desta tese, utilizando o programa FRED.
Através da docagem percebeu-se que os compostos 4, 5, 6, 8 e 13 não apresentam complementaridade de forma com o sítio, uma vez que os grupos etil e metil formando os ésteres são muito volumosos em relação ao fosfonato. Além disso, esses pequenos substituintes alquílicos diminuem a possibilidade de formação de interação de ligação de hidrogênio com a cadeia principal da LMW-PTP no fundo do sítio ativo – Figura 3.3.
86
Figura 3.3 – Posição dos compostos 6 e 14 no sítio ativo da LMW-PTP
Por outro lado, os demais compostos conseguem mimetizar as interações do substrato com o loop que forma o sítio catalítico. Os compostos contendo o grupo benzil se ajustam melhor do que aqueles com o fenil por conseguirem alcançar interações de van der Waals e -stacking com o resíduo Y131 – Figuras 3.4a e 3.4b. Os compostos contendo o anel piridínico também apresentaram boa complementaridade química, e por serem mais longos, realizam interações de van der Waals com Y49, que encontra- se na saída do sitio da enzima conforme pode-se observar na Figura 3.4c.
87
Figura 3.4 – Modo de interação predito a partir da pose obtida na docagem molecular, para os ligantes no sítio ativo da LMW-PTP: a) 1, b) 9, c) 11, e d)18. Nos diagramas, carbonos, oxigênios, nitrogênios e fósforo estão representados pelas cores preta, vermelha, azul e roxo,
respectivamente. As linhas verdes representam ligação de hidrogênio e ao aros vermelhos indicam contato hidrofóbico.
Nos compostos 14-18 foram simulados substituintes para o fragmento 1, ácido benzilfosfônico. Nestes casos, interações hidrofóbicas são observadas com ambas tirosinas do sítio, Y131 e Y49, devido à sua posição na entrada do sítio conforme observa-se para o composto 11 – Figura 3.4a. Na Figura 3.4d observa-se que o composto 18 se destaca pois realiza interações adicionais, em relação aos outros compostos desta série, com o resíduo E50.
a b
88
3.2.2.
Ensaios de Inibição Enzimática
Uma pequena série de testes foi sintetizada - compostos 1 a 6 (Figura 3.1) - e disponibilizada para que, juntamente com o PMSF (numerado como 7 na Figura 3.5a), se pudesse conduzir ensaios de inibição enzimática e estudos de cristalografia.
A influência dos compostos sintetizados na atividade da LMW-PTP foi avaliada usando o substrato clássico de fosfatases, pNPP. Na concentração de 2 mmol L-1, os
compostos 2 e 3 foram os mais potentes em inibir a LMW-PTP (Figura 3.5a). Em seguida, foi examinado o mecanismo de inibição de ambos os compostos. Os compostos atuam como inibidores competitivos apresentando constante inibitória de 0,124 mM para o composto 2 e 0,047 mM para o composto 3 – Figura 3.5b e 3.5c.
Sob o aspecto estrutural, quando comparamos os compostos 1 e 3 é razoável assumir que a substituição na posição para levou a compostos mais efetivos, provavelmente devido às interações favoráveis à inibição na entrada do sítio. Por outro lado, a substituição de enxofre por fósforo no composto 1, em relação ao PMSF, demonstra a importância da eletronegatividade. No caso, o composto contendo o enxofre, que é mais eletronegativo, parece ser mais efetivo em inibir a LMW-PTP, provavelmente por uma maior ‘disponibilidade’ dos oxigênios da estrutura em aceitar a ligação de hidrogênio com a cadeia principal do loop catalítico.
Além disso, o ácido benzenofosfônico (composto 1 da Figura 3.1) já havia sido reportado como um inibidor fraco de fosfatases [143-147]. Zhang e Van Etten [148] relataram que ele seria um inibidor competitivo da Fosfatase Ácida de coração bovino, apresentando constante de inibição aparente de 4,6 mM. Adicionalmente, foi também reportada a inibição da Fosfatase Alcalina de placenta humana (PLAP), com constante de inibição de 0,58 mM [143].
89
Figura 3.5 - Ensaios de inibição: a) ensaio de inibição em dose única, b) gráfico de Dixon para composto 2, c) gráfico de Dixon para composto 3 – Compostos 1 a 6 referentes à Figura 3.1 e
composto 7 referente ao PMS – Figura 3.2
A B
C a
b
90
3.2.3.
Estudos Cristalográficos
Conforme ilustra a Figura 1.2c, e já comentado anteriormente, o empacotamento cristalino da LMW-PTP causa oclusão do sítio ativo, cuja vizinhança está sujeita a contatos cristalinos com moléculas vizinhas. Isso impossibilita utilizar a técnica de
soaking, na qual ligantes acessam os sítios de interação por difusão através de canais
de solvente. Apesar de todos os esforços, não conseguimos outra forma cristalina, de modo que, no caso desta fosfatase, as tentativas de obtenção de complexos foram feitas principalmente por cocristalização, quando o composto é adicionado diretamente ao meio de cristalização, antes da formação dos cristais propriamente ditos.
Condições de cristalização contendo tampão MT (ácido málico e Tris, 1:2) foram testadas na presença dos compostos 1 e 2 (com relação à Figura 3.1). Formaram-se alguns cristais, sendo que dois conjuntos foram coletados, um para cada composto. A Tabela 3.1 apresenta as condições de crescimento destes cristais.
Tabela 3.1 - Condições de cristalização dos complexos de LMW-PTP
Conjunto Solução de cristalização
A
• PEG 5000 32%, MT 0,1 mol L-1 pH 7.0
• LMW-PTP (purificação sem PMSF) 9 mg mL-1 e 1,45 mmol L-1 composto 1
• Método: difusão de vapor - gota suspensa
B
• PEG 2000 27%, MT 0,1 mol L-1 pH 7.0
• LMW-PTP (purificação sem PMSF) 9 mg mL-1 e 1,45 mmol L-1 composto 2
• Método: difusão de vapor - gota sentada
Após a redução de dados, as estruturas foram resolvidas por substituição molecular utilizando como modelo a estrutura contendo PMS (seção 2.2.2.1). Dados de coleta e estatísticas de refinamento são apresentados na Tabela 3.2. A qualidade dos dados foi suficiente para confirmar de forma inequívoca a presença dos ligantes esperados e modelá-los de forma adequada.
A estrutura da LMW-PTP humana consiste de quatro folhas centrais e paralelas acompanhadas de hélices em ambos os lados. Parte da cauda de expressão (proveniente da cauda de histidina) aparece fazendo contato cristalino com a molécula
91
vizinha da unidade assimétrica (ASU), em ambas as estruturas, A e B – Figura 3.6a e 3.6b. Esta região de contato é a mesma referida em estrutura depositada no Protein
Data Bank (PDB ID 3N8I) como sendo um sítio secundário – Figura 1.2b e 3.7a.
Tabela 3.2 - Parâmetros e estatísticas da coleta de dados e refinamento estrutural. Valores entre parênteses referem-se à última camada de resolução.
Estruturas
A B
Parâmetros e estatísticas de coleta de dados
Temperatura 100 K 100K Grupo de espaço P212121 P212121 Conteúdo de solvente (%) 47.87 50.00 Dimensões de cela (Å) a 32.088 32.667 b 54.287 54.157 c 97.468 100.05 Faixa de resolução (Å) 27.88-2.41 36.75-2.30
Faixa de mais alta resolução (Å) 2.41-2.45 2.30-2.35
I/σ 16.34 (2.94) 7.43 (2.00)
Redundância (última faixa) 11.84 (11.58) 8.57 (7.94)
Rsym (%) 14.55 (56.18) 22.62 (62.10)
CC1/2 (%) 73,11 (61.40) 37,20 (10,60)
Estatísticas de refinamento
No. de reflexões no refinamento 6641 7967
Completeza (%) 99.26 99.68
No. reflexões usadas para Rfree (5%) 325 385
Rfactor (todas reflexões) (%) 22.24 19.69
Rfactor (excluindo conjunto de teste) (%) 21.85 19.20
Rfree (%) 30.53 30.30
Átomos na proteína 1262 1314
Moléculas de água 65 112
Átomos de ligante 11 ---
B-factor médio para os átomos de proteína (Å2) 34.597 25.228
Desvio RMS da idealidade
Comprimento de ligação (Å) 0.012 0.014
Ângulo de ligação (graus) 1.492 1.586
Gráfico de Ramachandran
Regiões Favoráveis (%) 96.7 98.8
Regiões Permitidas (%) 3.3 1.2
92
Figura 3.6 – a) sítio secundário na estrutura A, b) sítio secundário na estrutura B. Em ciano é destacado o loop catalítico. É destacada também a cauda de expressão (Tabela 2.3), o mapa
de trabalho (2Fobs-Fcalc) é apresentado a 1.2 sigma (em azul).
a
93
Figura 3.7 – a) superposição da estrutura PDB ID 3N8I com os resíduos F-1 e E-2 da estrutura A e b) modo de interação predito para os resíduos da cauda de expressão no sítio secundário.
Tal região é formada por um bolsão hidrofóbico constituído pelos resíduos T78, I77, F82, V106, com entorno formado pelos resíduos polares Q76, K79, R101, K102,
a
94
Q105. Assim, como se pode observar na Figura 3.7b a cadeia lateral do resíduo de fenilalanina foi bem acomodada dentro deste bolsão através de interações de van der Waals. Além disso, o ácido carboxílico do resíduo de ácido glutâmico estabiliza-se por ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas com a cadeia lateral dos resíduos R101, K102 e Q105, que são polares ou carregados positivamente. No entanto, estudos adicionais ainda são necessários para verificar se esse sítio desempenha alguma função biologicamente relevante, como a ancoragem do substrato durante a catálise, uma vez que se trata de uma região que, em princípio, tem afinidade por peptídeos.
Na estrutura A, verificou-se, no sítio ativo, a presença do ligante 1 (existente no PDB com designação B85). O modelo refinado contém 157 resíduos de aminoácidos. O ligante 1 foi encontrado no bolsão do sítio ativo (Figura 3.8a). Os átomos de oxigênio do grupo fosfonato, localizados na parte inferior do bolsão, no sítio de ligação de fosfato, formam múltiplas ligações de hidrogênio com os átomos de nitrogênio do loop que representa o sítio ativo, bem como com a cadeia lateral do resíduo R18. O anel benzílico forma interações de van der Waals com os resíduos C12, L13, G14, D129, Y131 e E50 da proteína (Figura 3.8b). Além disso, foi observada interação de van der Waals com o resíduo R97 da molécula vizinha da unidade assimétrica (ASU), proveniente de contato cristalino. Nenhuma densidade eletrônica foi observada para os primeiros quatro resíduos do N-terminal, diferentemente do que se observa na estrutura B.
O ligante 1 (Figura 3.1) foi reportado na estrutura cristalina PDB ID 3IP8. Trata- se de uma estrutura da enzima AMDase (arilmalonato descarboxilase). O B85 aparece ligado ao sítio ativo desta enzima, mimetizando o substrato natural (-arilmalonato) [149].
95
Figura 3.8 – a) Estrutura A contendo o ligante B85 no sítio ativo. Mapas de trabalho (2Fobs-Fcalc)
desenhados a 1.2 sigma (em azul) mostrando regiões adequadamente modeladas.
Na outra estrutura, B, não se observa ligante, porém, de forma bastante interessante, há a presença de moléculas de água em posições próximas às dos
a
96
átomos de oxigênio do ligante na primeira estrutura, conforme observado na Figura 3.9a e 3.9b. Mesmo sem a presença de ligante no sítio, esta estrutura também é inédita, pois não há a presença de nenhum ligante em sítio algum. Nesta estrutura, 164 resíduos de aminoácido foram modelados. Nas Figuras 3.9b e 3.9c é possível observar que as moléculas de água presentes no sítio realizam uma rede de interações de hidrogênio com resíduos do loop que compõe o sítio ativo, semelhante às interações dos oxigênios do ácido benzenofosfônico.
Na tentativa de evidenciar alguma importância biológica para esse sítio secundário, ensaio de cinética enzimática na presença e ausência do composto NLA (5 mmol L-1) para a LMW-PTP, foram conduzidos (resultados não mostrados). Nenhum
efeito foi observado na atividade da proteína. Esse resultado não implica em dizer que o sítio secundário não tenha importância biológica, uma vez que neste modelo de ensaio utilizamos um substrato sintético de tamanho pequeno, que interage apenas no sítio ativo da LMW-PTP. Além disso, analisando a estrutura PDB ID 3N8I, não é possível observar alterações conformacionais decorrentes do processo de interação deste ligante, sendo que a mesma situação pode estar ocorrendo em solução, quando do processo de interação do NLA com o sítio ativo da proteína.
Ensaios de viabilidade celular foram conduzidos (seção 3.1.4), na tentativa de se verificar uma possível alteração da atividade da LMW-PTP em célula, na presença de NLA. Na presença do ligante nas concentrações 50 e 100 M, houve alteração da viabilidade celular de 32 e 21%, respectivamente, em relação ao controle. Esses resultados não são significativos para o prosseguimento em ensaios celulares mais detalhados. Por outro lado, isso não significa que a presença do composto não tenha interferência da atividade da LMW-PTP na célula, uma vez que o NLA é pouco solúvel em água. Isso fez com o que o ensaio fosse realizado em DMSO, que pode ser tóxico à célula, limitando seu uso. Além disso, outro fator limitante é a permeabilidade de membrana, que pode ter sido baixa, fazendo assim com que o resultado não reflita efetivamente a função do sítio secundário para o processo de interação da LMW-PTP com seus substratos na célula.
97
Os resultados apresentados neste capítulo revelaram-se promissores. As estruturas inéditas obtidas estão sendo depositadas no PDB e um artigo encontra-se em fase final de preparação.
Figura 3.9 – a) Estrutura B contendo águas no sítio ativo. Mapas de trabalho (2Fobs-Fcalc)
desenhados a 1.2 sigma (em azul) mostrando regiões adequadamente modeladas. b) Sobreposição com a estrutura contendo o composto 1. c) Modo de interação predito para as moléculas de água ocupando o sítio ativo da estrutura B, formando uma rede de ligações de
hidrogênio.
a
b
99
CAPÍTULO 4
101
4. Conclusões e Perspectivas
Neste trabalho, partindo de uma biblioteca virtual, estratégias computacionais foram utilizadas para selecionar pequenas moléculas com potencial de inibir proteínas tirosina fosfatases, mais especificamente LMW-PTP e CDC25B. A partir de um banco com quase 14 milhões de compostos, em torno de meio milhão de fragmentos foram pré-selecionados, os quais levaram, após a inspeção visual de milhares de posições resultantes de docking, à aquisição de 19 promissores compostos candidatos a inibidores.
Como resultado, um composto, dentre oito planejados para a fosfatase LMW- PTP, inibiu a enzima. Quatro compostos, dentre oito planejados para a fosfatase CDC25B, inibiram esta enzima. Se considerarmos todos os compostos, dentre os 19 adquiridos (sendo 2 insolúveis), 9 inibiram a LMW-PTP, 6 inibiram a CDC25B e 13 inibiram a PTP1B (tomando uma inibição de 40% ou mais na atividade de cada enzima, nas condições utilizadas). Dentre os 17 solúveis, apenas dois não inibiram nenhuma das fosfatases: EM35 e EM36. Vale comentar que essa taxa de sucesso pode ser considerada boa quando se fala de planejamento de inibidores enzimáticos por métodos in silico. Como comparação, Montes e colaboradores [135] selecionaram 1500 compostos por virtual screening, dos quais 99 inibiram a CDC25 em pelo menos 20% e apenas 11 inibiram a fosfatase em mais de 50% da atividade. Em trabalho de Homan e colaboradores [26] com a LMW-PTP, dentre 52 compostos selecionados, 13 foram insolúveis e 5 inibiram a proteína em pelo menos 10%.
A partir de todos os esforços na tentativa de obtenção de estruturas cristalográficas de complexos fosfatase:fragmento, importantes avanços foram dados com a obtenção de condições de cristalização adequadas. Para a LMW-PTP, foi obtida uma nova condição na qual o sítio não se encontra ocupado pelo tampão MES, como era antes relatado na literatura [14]. Já para a CDC25B, obtivemos cristais que difratam até 1.9 Å e com características ideais para estudos por soaking, sem que a cisteína catalítica se oxide.
Outro ponto de destaque está na obtenção de estruturas cristalográficas de complexos da LMW-PTP e caracterização cinética de derivados do ácido
102
benzenofosfônico. Estas serão algumas das poucas estruturas publicamente disponíveis no PBD, para estudos da proteína, uma vez que atualmente apenas duas estruturas de complexo (com o tampão MES no sítio ativo e o ligante NLA no sítio secundário) dessa fosfatase estão disponíveis no banco. Interações de resíduos em sítio já reportado como secundário, mas ainda não explorado, foram pela primeira vez identificadas, sendo este um indicativo de um possível ponto de ancoramento da enzima com seu substrato biológico.
103
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