EFEITO DA TERAPIA COM CÉLULAS DENDRÍTICAS TRATADAS COM

ANIMAIS PORTADORES DE ENCEFALOMIELITE AUTOIMNUNE EXPERIMENTAL (EAE).

A encefalomielite autoimune experimental é o modelo animal mais comumente utilizado para mimetizar a doença humana desmielinizante conhecida como esclerose múltipla. Com o intuito de padronizarmos o modelo, camundongas da linhagem C57BL/6J foram estimuladas a desenvolver a doença, e sua severidade acompanhada diariamente, após o décimo dia de indução, com base em uma pontuação, de 0 a 5, dos sinais clínicos apresentados pelos animais. A saber: 0, sem sinal; 1, perda do tônus da cauda; 2, fraqueza nas patas traseiras (andar cambaleante); 3, paralisia das patas traseiras e início de fraqueza nas patas dianteiras; 4, paralisia parcial ou total dos membros dianteiros; 5, agonizando ou morto.

Os dados mostrados na figura 17 indicam que a indução do modelo, de acordo com o método escolhido, foi bem-sucedida e que os animais desenvolveram a doença de forma homogênea. O peso dos animais também foi acompanhado diariamente e a queda foi concomitante com o agravamento da doença.

Figura 17. Avaliação do desenvolvimento de Encefalomielite Autoimune Experimental. A indução da doença

foi realizada em camundongas C57BL/6J através da imunização, na base da nuca e da cauda, por via subcutânea, com uma emulsão contendo 200µg do neuro-peptídeo MOG35-55 juntamente com adjuvante Completo de Freund

contendo 3mg/ml de Mycobacteruim tuberculosis e duas doses, administradas por via intraperitoneal, em 0h e 24h, com 240ng de toxina de Pertussis. O quadro clínico e o peso dos animais foram acompanhados diariamente a partir do 10º dia da indução. Os dados obtidos mostraram o desenvolvimento progressivo da doença com aumento do escore clínico com o decorrer do tempo. (B) Os animais também apresentaram perda de peso, que é característico neste modelo. Dados representativos de três experimentos independentes com “n” de cinco animais cada.

A participação da via de sinalização mTOR no potencial terapêutico de DCs moduladas com cloroquina foi então investigada.

Para tal, DCs foram geradas in vitro, estimuladas com LPS e tratadas com cloroquina (mDC+CQ) ou com cloroquina e o inibidor da via mTOR (mDC+CQ+RAPA). Células dendríticas maduras, devido ao estímulo com LPS (mDCs), foram utilizadas como controle. Após 18 horas de tratamento, as DCs foram adotivamente transferidas, pela via retro orbital, para camundongas naïve e três dias depois (conforme protocolo estabelecido no nosso grupo) foi realizada a indução da EAE nestes animais. O quadro clínico foi acompanhado diariamente até o décimo oitavo dia, quando os animais foram submetidos à eutanásia e o cérebro e medula espinhal coletados para análises quanto ao infiltrado inflamatório (Figura 18A).

Os dados de observação do desenvolvimento dos sinais clínicos da doença mostraram que o bloqueio da via mTOR reverteu os efeitos moduladores da cloroquina sobre a atividade de DCs, uma vez que camundongs recipientes de mDC+CQ+RAPA desenvolveram quadro clínico tão severo quanto outros recipientes de mDC e, significativamente, mais agravado do que animais recipientes de mDC+CQ (Figura 18B). Entretanto, a perda de peso dos animais não foi evitada nos animais recipientes de mDC+CQ+RAPA, uma vez que se mostrou semelhante à perda de peso observada nos animais recipientes de mDC (Figura 18C).

A análise histopatológica (Figura 19) mostrou que a transferência das DCs maduras tratadas com cloroquina diminuiu o infiltrado inflamatório na medula espinhal, em comparação com o grupo controle, que recebeu DCs maduras após tratamento com LPS, ou ao grupo controle que não recebeu DCs transferidas adotivamente. Os animais que receberam transferência adotiva de DCs maduras e tratadas com cloroquina e rapamicina, o inibidor da via mTOR (mDC+CQ+RAPA), apresentaram infiltrado inflamatório mais evidente, se comparado com os animais que receberam as DCs maduras tratadas com cloroquina.

Estes resultados indicam que a inibição da via mTOR foi capaz de bloquear os efeitos moduladores da cloroquina sobre a atividade de DCs, sugerindo fortemente a participação desta via de sinalização na indução de DCs com perfil tolerogênico pela cloroquina e a manutenção de seu efeito mesmo após a transferência destas células para um sistema in vivo.

Figura 18. Participação da via de sinalização mTOR no potencial terapêutico de DCs moduladas com Cloroquina na EAE. (A) Esquema representativo do desenho experimental. (B). Os resultados mostram que a

transferência de DCs maduras tratadas com cloroquina (mDC+CQ) reduziu, de forma significativa, a severidade da doença, em comparação com o grupo de animais que receberam apenas DCs maduras. Os animais que receberam DCs maduras tratadas com cloroquina e o inibidor da via mTOR (mDC+CQ+RAPA) desenvolveram quadro clínico tão severo quanto os camundongos recipientes de DCs maduras. Estes resultados indicam a participação desta via metabólica na indução de DCs com perfil tolerogênico e a manutenção de seu efeito mesmo após a transferência destas células para um sistema in vivo. (C). Os animais tratados com mDCs+CQ+RAPA apresentaram perda de peso semelhante ao grupo que recebeu mDC. Dados representativos de três experimentos independentes com “n” de cinco animais cada.

mDC mDC+CQ mDC+CQ+RAPA

Figura 19. Alterações histopatológicas no Sistema Nervoso Central (medula espinhal) após transferência adotiva de Células Dendríticas (DCs). A transferência adotiva de das DCs maduras tratadas com cloroquina

(mDC+CQ) diminuiu o infiltrado inflamatório e os danos à morfologia da medula, em comparação com o controle (animais que não receberam adotivamente DCs) e com animais que receberam DCs maduras (mDC). O grupo que recebeu DCs maduras cloroquina e rapamicina (mDC+CQ+RAPA) mostrou maior infiltrado inflamatório em comparação com aqueles que receberam células dendríticas maduras tratadas com cloroquina, sugerindo que a inibição da via mTOR bloqueou o efeito terapêutico induzido pela CQ. Coloração Hematoxilina-Eosina. Corte transversal da medula espinhal mostrando as regiões do corno ventral anterior da substância branca (direia) e sulco médio anterior (esquerda). Aumentos usados: 20X e 40X.

A análise das células T inflamatórias infiltrantes no cérebro dos animais portadores de EAE e que receberam células dendríticas transferidas adotivamente foi realizada por citometria de fluxo.

Os resultados mostraram uma redução na população de linfócitos TCD4+ _infiltrantes

no SNC produtores das citocinas inflamatórias, IFN-γ e IL-17, nos animais recipientes de DCs moduladas com cloroquina (mDC+CQ). Já os animais que receberam DCs tratadas com cloroquina e o inibidor da via metabólica mTOR (mDC+CQ+RAPA) mostraram aumento significativo de linfócitos TCD4+ infiltrantes produtores de IL-17, indicando novamente que o bloqueio da via metabólica mTOR reverteu parcialmente os efeitos moduladores da cloroquina sobre a atividade de DCs (Figura 20).

Figura 20. Análise do perfil de células T infiltrantes no Sistema Nervoso Central após transferência adotiva de Células Dendríticas (DCs). Os resultados mostram que os animais que receberam células tratadas com

mDC+CQ apresentavam menor porcentagem de células T infiltrantes produtoras das citocinas IFN-γ e IL-17. Já os animais que receberam DCs tratadas com rapamicina (mDC+CQ+RAPA) apresentavam infiltrado maior de células T produtoras de IL-17. (A) Histogramas representativos de três experimentos independentes. (B). Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, três experimentos diferentes. (**p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, ns: não significativo).

A porcentagem de células TCD4+CD25+FOXP3+, ou seja, com perfil regulador da inflamação, bem como a porcentagem de células T produtoras de IL-10 (TCD4+CD25+FOXP3+IL-10+), também foram avaliadas no SNC de animais portadores de EAE e recipientes de células dendríticas tratadas in vitro.

Nossos resultados mostram aumento, tanto da porcentagem quanto da intensidade média de fluorescência, de células T expressando os marcadores CD25+FOXP3+ (célula T reguladora) e a citocina IL-10 armazenada no citoplasma quando os animais receberam células dendríticas moduladas com cloroquina (mDC+CQ). Os animais recipientes das células dendríticas moduladas com cloroquina, mas tratadas com o inibidor da via mTOR (mDC+CQ+RAPA), apesar de não mostrarem queda significativa na porcentagem de células TCD4+CD25+FOXP3+, mostraram queda significativa na intensidade média de fluorescência tanto de células TCD4+CD25+FOXP3+ como de células TCD4+CD25+FOXP3+IL-10+ (Figura

Figura 21. Análise do infiltrado de linfócitos TCD4+_CD25+_FoxP3+ _{e produtoras de IL-10 no Sistema Nervoso}

Central após transferência adotiva de Células Dendríticas (DCs). Os resultados mostram que os animais que

receberam DCs tratadas com cloroquina (mDC+CQ) apresentaram um maior infiltrado de células reguladoras expressando os marcadores CD25+_FoxP3+_{.A intensidade média de fluorescência foi maior nos animais tratados} com mDC+CQ em relação aos animais que receberam somente células dendríticas tratadas com LPS (mDC). As células T infiltrantes também apresentaram intensa marcação para a citocina anti-inflamatória IL-10 nos animais recipientes de mDC+CQ. Animais que receberam DCs moduladas com CQ, mas tratadas com o inibidor da via mTOR (mDC+CQ+RAPA) apresentaram menor intensidade média de fluorescência com relação a estes marcadores. (A) ‘Dot plots’ representativos de três experimentos independentes. (B). Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, três experimentos diferentes. (*p<0,05, **p<0,01, ns: não significativo).