UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
AMANDA PIRES BONFANTI
PAPEL DA VIA DE SINALIZAÇÃO mTOR (mammalian Target Of
Rapamycin) NO MECANISMO DE AÇÃO DA CLOROQUINA SOBRE
CÉLULAS DENDRÍTICAS
THE ROLE OF mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) SIGNALING IN
THE MECHANISM OF CHLOROQUINE ON DENDRITIC CELLS
CAMPINAS 2018
PAPEL DA VIA DE SINALIZAÇÃO mTOR (mammalian Target Of
Rapamycin) NO MECANISMO DE AÇÃO DA CLOROQUINA SOBRE
CÉLULAS DENDRÍTICAS
THE ROLE OF mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) SIGNALING IN
THE MECHANISM OF CHLOROQUINE ON DENDRITIC CELLS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de Imunologia. Dissertation presented to the Biology Institute of the State University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master's Degree in Genetics and Molecular Biology in the Immunology Area.
Orientador: Profa. Dra. Liana Verinaud Coorientador: Prof. Dr. Rodolfo Thomé
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna AMANDA PIRES BONFANTI e orientado pela PROFA. DRA. LIANA VERINAUD.
CAMPINAS 2018
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Liana Maria Cardoso Verinaud Dr. André Luís Bombeiro
Dra. Vânia Nieto Britto de Souza
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“Monsters are real and ghosts are real too.
They live inside us, and somentimes they win.”
Primeiramente à Deus, por ter me dado saúde, fé e conhecimento para trilhar meu caminho até aqui.
Á minha família, por todo apoio, amor e incentivo dado a mim durante toda minha vida, onde sem essa ajuda, eu não teria conseguido tudo que tenho até hoje.
Ao Pedro Abe, por todo apoio e companheirismo no tempo que estivemos juntos, sem essa ajuda, eu não teria alcançado grande parte das coisas que consegui até o hoje.
À Dra. Profa. Wirla Tamashiro, por toda ajuda e amizade durante a minha primeira Iniciação Científica, e por ter me apresentado à minha orientadora Profa. Dra. Liana Verinaud, o que possibilitou a chance de ter feito este Mestrado.
Á minha orientadora Profa. Dra. Liana Verinaud, por ter me aceitado como sua aluna, pela compreensão, ajuda, conselhos e amizade durante todo o Mestrado.
Ao meu coorientador Dr. Rodolfo Thomé, por toda ajuda, compreensão, conselhos e ajuda durante toda a minha Iniciação Científica e também no Mestrado.
Aos meus colegas de laboratório Thiago Alves da Costa, Lívia Thomaz, Gabriela Peron, Janine Silva, Larissa Camargo da Rosa, também agradeço aos colegas que já deixaram o laboratório, por todo conhecimento compartilhado e amizade durante o tempo trabalhando juntos. Em especial, agradeço à Dra. Catarina Raposo, pela amizade e ajuda em todos os momentos.
Agradeço também aos meus colegas de departamento e da Universidade, por toda a ajuda e conversas, principalmente nos momentos mais difíceis, especialmente ao Felipe Pinheiro e ao Marcos Cesar Meneghetti.
Aos meus colegas e professores dos outros departamentos do Instituto de Biologia, em que tive oportunidade de aprender várias técnicas diferentes e ganhar conhecimentos variados que me ajudaram em várias oportunidades.
À CAPES e ao CNPq pelas bolsas de estudo concedidas a mim e à FAPESP pelo auxílio financeiro.
direcionar a resposta imune tanto para um contexto inflamatório como para um contexto anti-inflamatório dependendo de seu estado de maturação e/ou ativação. DCs imaturas são caracterizadas pela baixa expressão de moléculas de classe II do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC-II) e moléculas coestimulatórias, como CD80 e CD86, e quando em contato com linfócitos T naïve estimulam sua diferenciação em células regulatórias. Por este motivo são também chamadas de DCs tolerogênicas. Já DCs maduras, por sua vez, expressam elevados níveis de MHC-II, CD80 e CD86, e induzem a geração de células T efetoras. Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que o fármaco Cloroquina, mais conhecido por ser usado no tratamento da malária, possui efeitos tolerogênicos sobre as funções das DCs. Embora um número crescente de estudos tenha buscado avaliar o potencial terapêutico de geração e transferência de DCs tolerogênicas, pouco se conhece a respeito das vias de sinalização envolvidas em sua atividade supressora. Recentemente, foi verificado que a via de controle metabólico denominada mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) desempenha importante papel na gênese de DCs tolerogênicas. Nesse contexto, o presente projeto tem o objetivo de avaliar a influência da via de sinalização mTOR sobre a atividade de Células Dendríticas tolerogências. Resultados apresentados nesta dissertação mostraram que a via de sinalização mTOR participa do mecanismo de ação da CQ sobre DCs uma vez que sua fosforilação se apresenta aumentada após o tratamento com este fármaco. Além disso, os efeitos moduladores da cloroquina sobre as DCs, visto por sua capacidade de inibir o completo amadurecendo destas células mesmo após um estímulo microbiano, foi revertido quando um inibidor da via mTOR foi adicionado na cultura. Embora parcial, este efeito inibidor foi demonstrado pela manutenção da morfologia das DCs após o estímulo, pela diminuição da expressão de moléculas apresentadoras de antígeno e de moléculas coestimulatórias, pela reduzida capacidade destas células de induzirem proliferação de linfócitos T e, ainda, por sua capacidade de induzir diferenciação de linfócitos T com perfil regulador. Em conjunto, estes resultados são sugestivos de um perfil tolerogênico das DCs. A via mTOR, entretanto, parece não estar envolvida no efeito da CQ sobre o perfil de liberação de citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias pelas DCs. Em adição, o bloqueio da via mTOR inibiu a eficácia terapêutica das DCs tolerogênicas sobre o Sistema Nervoso Central de camundongos C57BL/6 portadores de Encefalomielite Autoimune Experimental, um modelo experimental da esclerose múltipla, quando estas células foram, adotivamente, transferidas para os animais. Estes dados sugerem
Embora os efeitos da inibição da via mTOR tenham sido parciais, indicando a participação de outras vias de sinalização intracelular na indução do perfil tolerogênico das DCs, os resultados observados neste trabalho posicionam a via de sinalização celular mTOR como um dos mecanismos envolvidos na indução de tolerância imunológica.
response both to an context inflammatory and to an anti-inflammatory depending on their state of maturation and / or activation. Immature DCs are characterized by the low expression of Class II molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC-II) and costimulatory molecules, such as CD80 and CD86, and when in contact with naïve T lymphocytes stimulate their differentiation in regulatory cells. For this reason, they are also called tolerogenic dendritic cells. Mature DCs, in turn, express high levels of MHC-II, CD-80 and CD-86, and induce generation of effector T cells. Previous findings from our group showed that the drug Chloroquine (CQ), better known to be used in the treatment of malaria, has tolerogenic effects on the functions of DCs. Although a growing number of studies have sought to assess the therapeutic potential of generation and transfer of tolerogenic DCs, little is known about the signaling pathways involved in their suppressive activity. Recently, the metabolic control pathway named mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) was shown to play an important role in the genesis of tolerogenic DCs. In this context, the present project aimed to evaluate the influence of the mTOR signaling pathway on the activity of tolerogenic DCs. Results presented in this dissertation showed that the mTOR signaling pathway participates in the mechanism of action of CQ on DCs since its expression is increased after treatment of DCs with that drug. In addition, the modulating effects of chloroquine on dendritic cells, seen by their ability to inhibit the full maturing of these cells even after a microbial stimulus, was reversed when an inhibitor of the mTOR pathway was added to the culture. Although partial, this inhibitory effect was demonstrated by the maintenance of dendritic cell morphology after stimulation, by the decrease in the expression of antigen-presenting molecules and costimulatory molecules, by the reduced ability of these cells to induce proliferation of T lymphocytes, and by their ability to induce differentiation of T lymphocytes with regulatory profile. Taken together, these results are suggestive of a tolerogenic profile of DCs. The mTOR pathway, however, does not appear to be involved in the effect of CQ on the release profile of inflammatory and anti-inflammatory cytokines by DCs. In addition, blocking the mTOR pathway inhibited the therapeutic efficacy of tolerogenic DCs on the Central Nervous System of C57BL/6 mice bearing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, an experimental model of multiple sclerosis, when these cells were transferred to the animals. These data strongly suggest the participation of this signaling pathway in the induction of DCs with a tolerogenic profile and the maintenance of their effect even after the transfer of these cells to an in vivo system. Although the effects of inhibition of
position the mTOR cell signaling pathway as one of the mechanisms involved in the induction of immunological tolerance.
4E-BP2 ACK AKT APC AR BCR cDC CD cDNA CEMIB CEUA CFA CFSE CO2 CQ CTLA-4 DAMPs DHA-P DC EAE ELISA EM
ABREVIATURAS E SIGLAS
do inglês, (eukaryotic translation initiation factor 4E)-binding proteins 2 do inglês, ammonium-chloride-potassium
do inglês, (conhecido como) protein kinase B (PKB) do inglês, antigen presenting cells
Artrite reumatóide
do inglês, B cell receptors
do inglês, conventional dendritic cells do inglês, cluster of differentiation
do inglês, complementary deoxyribonucleic acid Centro multidisciplinar para investigação biológica Comissão de Ética para o Uso de Animais
do inglês, Freund's Complete Adjuvant
do inglês, carboxyfluorescein succinimidyl ester Dióxido de carbono
do inglês, chloroquine
do inglês, cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
do inglês, damage-associated molecular patterns Dihidroartemisinina-piperaquina
do inglês, dendritic cell
do inglês, experimental autoimune encephalomyelitis do inglês, enzyme-linked immunosorbent assay Esclerose Múltipla
fDC GAP GDP GM-CSF GTP HCQ HIF-1α iDC IFN-γ iNOS IL ILT-3 IMDM i.p. KO LES L-NAME LPS mDC MFI MHC MOG mTOR
do inglês, folicular dendritic cell do inglês, GTPase-activating protein do inglês, guanosine diphosphate
do inglês, granulocyte macrophage colony-stimulating fator do inglês, guanosine triphosphate
Hidroxicloroquina
do inglês, hypoxia-inducible fator 1-alpha do inglês, immature dendritic cells
do inglês, Interferon gama
do inglês, inducible Nitric Oxide Synthase do inglês, Interleucin
do inglês, immunoglobulin-like transcript (ILT) 3 do inglês, Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium Intraperitoneal
do inglês, knockout
Lúpus eritematoso sistêmico
do inglês, N (G)-nitro-L- arginine methyl ester do inglês, lipopolysacchride
do inglês, mature dendritic cells do inglês, mean fluorescence intensity do inglês, major histocompatibility complex do inglês, myelin oligodendrocyte glycoprotein do inglês, mammalian target of rapamycin
MTT MyD88 NF-kB NO PAMPs PBS PCR pDC PDL-1 PIP2 PIP3 PH PKD PI3K/AKT PMA PRRs RAPA Raptor RHEB Rictor RNA RPM RTK S6K
do inglês, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide do do inglês, myeloid differentiation primary response 88
do inglês, nuclear fator kappa b do inglês, nitric oxide
do inglês, pathogen-associated molecular patterns do inglês, phosphate buffered saline
do inglês, polymerase chain reaction do inglês, plasmacytoid dendritic cell do inglês, programmed death-ligand 1
do inglês, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate do inglês, phospha- tidylinositol (3,4,5) trisphosphates do inglês, pleckstrin homology
do inglês, pyruvate dehydrogenase kinase
do inglês, phosphatidylinositol 3' -kinase/protein kinase B (PKB) do inglês, phorbol myristate acetato
do inglês, pattern recognition receptors do inglês, rapamycin
do inglês, regulatory-associated proteins of mTOR do inglês, Ras homologue enriched in brain
do inglês, rapamycin-insensitive companion of mTOR do inglês, ribonucleic acid
Rotações por minuto
do inglês, receptor tyrosine kinase
SFB SNC STAT TCD4 TCD8 TCR TGF-β Th1 Th17 Th2 TLR TNF-α tolDCs Treg TSC
Soro fetal bovino
Sistema Nervoso Central
do inglês, signal transducers and activators of transcription Célula T auxiliar
Célula T citotóxica do inglês, T cell receptor
do inglês, transforming growth factor-beta do inglês, type 1 T helper cell
do inglês, type 17 T helper cell do inglês, type 2 T helper cell do inglês, Toll-like receptor
do inglês, tumor necrosis factor alpha do inglês, tolerogenic dendritic cells do inglês, regulatory T cell
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática da via de sinalização intracelular PI3K/Akt/mTOR...29
Figura 2. Análise do percentual de células dendríticas mieloides (CD11c+MHC-II+)geradas in
vitro...43 Figura 3. Ensaio de toxicidade celular com Cloroquina (CQ) e Células Dendríticas (DCs)...44
Figura 4. Aumento da expressão de mTOR fosforilada em Células Dendríticas (DCs) tratadas
com Cloroquina (CQ)...45
Figura 5. Análise morfológica de Células Dendríticas (DCs) tratadas com Cloroquina e
Rapamicina (inibidor da via mTOR)...47
Figura 6. Análise de marcadores de ativação de Células Dendríticas (DCs) tratadas com
Cloroquina (CQ)...49
Figura 7. Análise da expressão gênica da isoforma induzível da enzima Óxido Nítrico Sintase
(iNOS) por Células Dendríticas (DCs) tratadas com Cloroquina...51
Figura 8. Análise da expressão gênica (qPCR-RT) de citocinas (A) pró e (B) anti-inflamatórias
secretadas por Células Dendríticas (DCs) tratadas com Cloroquina...53
Figura 9. Dosagem de citocinas (A) pró- e (B) anti-inflamatórias secretadas por Células
Dendríticas (DCs) tratadas com Cloroquina...54
Figura 10. Análise da proliferação de linfócitos T naïve CD4+ e T encefalitogênicos CD4+ em
cocultura com Células Dendríticas (DCs)...56
Figura 11. Análise da produção de IFN-γ por linfócitos T naïve CD4+ e encefalitogênicos CD4+
em cocultura com Células Dendríticas (DCs)...58
Figura 12. Análise da produção de IL-17 por linfócitos T naïve CD4+ e encefalitogênicos CD4+
Figura 13. Análise da produção de IL-10 por linfócitos T naïve CD4+ e encefalitogênicos CD4+
co-cultivados com Células Dendríticas (DCs)...61
Figura 14. Dosagem, por ELISA, de IFN-γ secretada em cocultura de linfócitos T naïve CD4+
e encefalitogênico CD4+ com Células Dendríticas (DCs)...63 Figura 15. Dosagem, por ELISA, de IL-17 secretada em cocultura de linfócitos T naïve CD4+
e encefalitogênico CD4+ com Células Dendríticas (DCs)...63 Figura 16. Dosagem, por ELISA, de IL-10 secretada em cocultura de linfócitos T naïve CD4+
e encefalitogênico CD4+ com Células Dendríticas (DCs)...64 Figura 17. Avaliação do desenvolvimento de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE).
...65
Figura 18. Participação da via de sinalização mTOR no potencial terapêutico de DCs
moduladas com Cloroquina...67
Figura 19. Alterações histopatológicas no Sistema Nervoso Central (medula espinhal) após
transferência adotiva de Células Dendríticas (DCs)...68
Figura 20. Análise do perfil de células T infiltrantes no Sistema Nervoso Central após
transferência adotiva de Células Dendríticas (DCs)...71
Figura 21. Análise do infiltrado de linfócitos TCD4+CD25+FoxP3+ e produtoras de IL-10 no
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 20
1.1. CÉLULAS DENDRÍTICAS ... 20
1.2. ENCEFALOMIELITE AUTOIMUNE EXPERIMENTAL ... 23
1.3. CLOROQUINA ... 25
1.4. VIA DE SINALIZAÇÃO: mTOR ... 28
2. OBJETIVOS ... 32
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 33
3.1. ANIMAIS ... 33
3.2. GERAÇÃO E MODULAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCS) ... 33
3.2.1. Diferenciação a partir de precursores de medula óssea. ... 33
3.2.2. Modulação de Células Dendríticas in vitro... 34
3.2.3. Inibição farmacológica da via mTOR pela Rapamicina. ... 34
3.3. ENSAIO DE TOXICIDADE DA CLOROQUINA (CQ) SOBRE CÉLULAS DENDRÍTICAS. ... 34
3.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA DE CÉLULAS DENDRÍTICAS ... 35
3.5. DETECÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA ... 35
3.5.1. Extração de RNA e conversão em DNA complementar ... 35
3.5.2. Reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real ... 35
3.6. ENSAIOS DE COCULTURA DE LINFÓCITOS T CD4+ COM CÉLULAS DENDRÍTICAS ...36
3.6.1. Cocultura de linfócitos T CD4+ com Células Dendríticas ... 36
3.6.2. Avaliação da proliferação dos linfócitos T CD4+. ... 37
3.6.3. Avaliação do perfil de diferenciação dos linfócitos T CD4+ ... 37
3.7. ENSAIO DE DETECÇÃO DE CITOCINAS SECRETADAS EM CULTURA DE CÉLULAS DENDRÍTICAS E COCULTURA DE DCS E LINFÓCITOS T ... 38
3.9. INDUÇÃO E AVALIAÇÃO DA ENCEFALOMIELITE AUTOIMUNE
EXPERIMENTAL (EAE) ... 39
3.10. ANÁLISE DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL ...39
3.10.1.Análise histológica da medula espinal ... 39
3.10.2.Análise de subpopulações de células T infiltrantes no SNC ... 40
3.11. Detecção da expressão de marcadores de superfície e intracelular... 41
3.12.ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 42
4. RESULTADOS ... 43
4.1. PARTICIPAÇÃO DA VIA mTOR SOBRE O FENÓTIPO E A ATIVIDADE APRESENTADORA DE ANTÍGENO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS TRATADAS COM CLOROQUINA ... 43
4.1.1. Geração de Células Dendríticas ... 43
4.1.2. Ensaio de toxicidade da Cloroquina sobre Células Dendríticas ... 44
4.1.3. Participação da via de sinalização mTOR nos efeitos da Cloroquina sobre Células Dendríticas...44
4.1.4. Participação da via de sinalização mTOR na indução de fenótipo tolerogênico de Células Dendríticas pela Cloroquina ... 45
4.1.5. Participação da via de sinalização mTOR nos efeitos da Cloroquina sobre a expressão gênica da isoforma induzível da enzima Óxido Nítrico Sintase (iNOS) ... 50
4.1.6. Participação da via de sinalização mTOR nos efeitos da Cloroquina sobre a expressão gênica e secreção de citocinas pró- e anti-inflamatórias pelas DCs. ... 52
4.2. PARTICIPAÇÃO DA VIA DE SINALIZAÇÃO mTOR NA FUNÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS TRATADAS COM CLOROQUINA ... 55
4.3. EFEITO DA TERAPIA COM CÉLULAS DENDRÍTICAS TRATADAS COM CLOROQUINA SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE ANIMAIS PORTADORES DE ENCEFALOMIELITE AUTOIMNUNE EXPERIMENTAL (EAE)...65
6. CONCLUSÃO ... 80
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 81
ANEXOS ... 95
ANEXO – Declaração da Comissão de Ética no Uso de Animais...132
1. INTRODUÇÃO
1.1. CÉLULAS DENDRÍTICAS
O sistema imunológico é, provavelmente, uma das mais complexas organizações celulares do corpo humano. Sua capacidade vai além de reconhecer um repertório variado de antígenos e patógenos, ou de detectar lesões neoplásicas de tecidos, pois a manutenção da tolerância periférica, suprimindo respostas prejudiciais contra tecidos saudáveis, é também sua atribuição (BENITEZ-RIBAS et al, 2012). Uma característica fundamental para o adequado funcionamento do sistema imunológico, e manutenção do equilíbrio entre ativação e supressão, é, portanto, o reconhecimento de antígenos próprios e não próprios pelos linfócitos T mediado por células apresentadoras de antígenos (APCs). Vários tipos celulares são capazes de realizar apresentação de antígenos, como os macrófagos, células dendríticas (DCs) e linfócitos B. Entretanto, apenas as DCs são capazes de ativar linfócitos T naïve, ou linfócitos T “virgens” (BANCHEREAU & STEINMAN, 1998).
A célula dendrítica foi descrita pela primeira vez como tendo pseudópodes longos, uniformes e de terminações bruscas, o que lhe confere uma aparência estrelada ou conhecida mais comumente como “dendrítica”. O citoplasma contém grânulos, núcleo grande, contorcido e de fase densa, e processos que podem se estender e se retrair (STEINMAN & COHN, 1973). As DCs foram identificadas, por microscopia de contraste de fase e eletrônica, nos órgãos linfoides periféricos de camundongos, constituindo de 1,0 a 1,5% da população total no baço e, em menor quantidade, nas placas de Peyers e linfonodos. São encontradas, ainda, nos epitélios da pele e dos tratos gastrointestinal e respiratório, assim como no interstício da maioria dos órgãos parenquimatosos, mas não é encontrada no Sistema Nervoso Central (STEINMAN & COHN, 1974).
As células dendríticas possuem um papel altamente relevante no desenvolvimento da imunidade adaptativa por ativarem linfócitos T contra antígenos virais, tumorais, bacterianos dentre outros, gerando uma resposta imune específica contra determinado antígeno (AKIRA, UEMATSU & TAKEUCHI, 2006). Diferentemente dos macrófagos, as DCs podem degradar o antígeno fagocitado de forma lenta, controlando a degradação lisossomal para preservar peptídeos e acomoda-los na fenda de moléculas do tipo I ou II do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC I ou MHC II) para o posterior reconhecimento pela célula T citotóxica (TCD8) ou T auxiliar (TCD4), através de seu receptor de antígeno (TCR, T cell
Existem três principais subtipos de células dendríticas – as DCs foliculares, as DCs plasmocitoides e as DCs convencionais (comumente chamadas de DCs mieloides) - que são caracterizadas em função de suas diferentes origem, função e expressão de receptores (também chamados de marcadores) (SHORTMAN & LIU, 2002).
Células dendríticas foliculares (fDCs), são encontradas em áreas ricas em células B ativadas, os chamados centros germinativos, presentes nos tecidos linfoides. Estas células não são derivadas de precursoras da medula óssea e, é importante ressaltar, que não estão relacionadas com as DCs apresentadoras de antígenos, elas se originam das células murais vasculares do estroma. As fDCs retêm, em seus prolongamentos, antígenos solúveis, complexados com anticorpos ou produtos do sistema complemento, possibilitando seu reconhecimento pelos receptores de antígenos (BCR, B cell receptors) presentes na superfície dos linfócitos B (SHORTMAN & LIU, 2002).
As células dendríticas plasmocitóides (pDCs) são assim chamadas por apresentarem morfologia similar à dos plasmócitos (células produtoras de anticorpos), na qual é uma célula maior que a dendrítica convencional, mais ovalada e possui maior quantidade de citoplasma. Sua morfologia plasmocitoide e as propriedades de uma DC funcional são adquiridas após sua ativação. Desenvolve-se na medula óssea, a partir do mesmo precursor que as DCs mieloides, e são encontradas no sangue e, em pequeno número, nos órgãos linfoides, particularmente nas zonas de células T do baço e dos gânglios linfáticos. A principal função das pDCs é a secreção de grandes quantidades de Interferon do tipo I em resposta a infecções virais (SWIECKI & COLONNA, 2015).
As células dendríticas convencionais (cDCs), são as mais conhecidas e numerosas dentre as DCs e são responsáveis por estimular respostas intensas das células T.
Derivam de progenitores da medula óssea e podem ser obtidas a partir desses ou do sangue, incluindo monócitos circulantes. Dão origem à população tecidual residente de DC (OZINSKY, 2000). As cDCs também são chamadas de células de Langerhans quando estão localizadas nos epitélios e nos gânglios linfáticos; ocupam até 25% da superfície da epiderme em virtude dos seus longos prolongamentos citoplasmáticos, porém constituem menos de 1% da população celular local. Nos epitélios intestinais, as cDCs emitem projeções citoplasmáticas que atravessam as células epiteliais e projetam-se na luz do órgão, onde podem atuar na captura de antígenos microbianos.
A ativação das cDCs acontece através de sua interação com um microrganismo e com citocinas. Após capturar um antígeno, a DC o processa e degrada enquanto migra para gânglios linfáticos, ou outros tecidos linfoides secundários, onde inicia a apresentação antigênica às
células T que possuem receptores específicos para o antígeno apresentado (TCR – T cell
receptor).
Para que a apresentação de antígeno ao linfócito T auxiliar, ou T helper, seja eficiente, gerando a completa ativação celular, é necessária a emissão de três sinais pelas DCs. O primeiro deles é gerado pela interação entre moléculas de MHC- do tipo I ou II complexadas ao peptídeo antigênico já processado, presentes nas DCs, e os receptores de antígenos de linfócitos T (TCR); o segundo sinal é gerado por moléculas coestimuladoras presentes na superfície das DCs (como CD80 e CD86 - conhecidas por B7 1 e B7 2) que se ligam ao CD28 (para ativação) e/ou CTLA-4 (para uma resposta anérgica) e também o CDCTLA-40L (que se liga ao CDCTLA-40 do linfócito T); já o terceiro sinal é gerado por citocinas secretadas pelas DCs e que influenciam na ativação, diferenciação e proliferação de linfócitos T específicos para o antígeno através das citocinas se secretadas por esta e também pela ativação de fatores de transcrição específicos para cada tipo celular nas células T (BANCHEREAU & STEINMAN, 1998; GUERMONPREZ et al, 2002). Como dito acima, dependendo do tipo de citocina secretada pelas DCs, um fator de transcrição específico vai ser ativado na célula t naïve e irá se diferenciar em um tipo específico celular. Se a citocina secretada foi a IL12p70, o fator de transcrição ativado será o T-bet, assim a célula T será diferenciada para o perfil efetor do tipo T helper (Th) 1 (caracterizado pela produção de IFN-γ; o mesmo acontece se for a citocina IL-4, o fator ativado será o GATA3, diferenciando a célula para o perfil do tipo T helper (Th) 2 (caracterizado pela também produção de IL-4); já no caso da secreção da citocina TGF-β e IL-6, o fator ativado será o RORγt e o perfil que irá se diferenciar será o de linfócito T helper (Th) 17 (caracterizado pela produção de IL-17 e IL-22); se a citocina secretada também foi o TGF-β, mas o fator ativado foi o Foxp3, o perfil de diferenciação será para células T reguladoras (Treg – caracterizada pela produção de TGF-β e IL-10. Existe um último tipo de “ativação” para o linfócito T, onde o antígeno apresentado pelas DCs, não é apresentado corretamente, assim o linfócito T é levado à anergia, um estado de não-ativação. (BANCHEREAU et al., 2000; EMMER et al., 2006; GUERMONPREZ et al., 2002; HEATH et al., 2009; HUANG et al., 2010; LEVIN et al., 1993; LU et al., 2012; SHORTMAN et al., 2002).
Em condição de repouso, ou seja, sem estimulação do antígeno, as DCs são consideradas imaturas por apresentarem baixa expressão de moléculas de MHC e de moléculas coestimulatórias. DCs imaturas têm se mostrado eficientes na indução de tolerância por causarem anergia e/ou deleção de células T ou por direcionarem a diferenciação de linfócitos T em linfócitos T regulatórios, e por este motivo são também chamadas de DCs tolerogênicas (tolDCs) (EZZELARAB & THOMSON, 2011). Este tipo de célula possui baixa ativação das
moléculas coestimulatórias, o que leva à baixa ativação de linfócitos T ou até mesmo na ativação para o perfil regulatório, assim como a produção de citocinas anti-inflamatórias, ajudando a proporcionar um ambiente tolerogênico.
Neste contexto, a modulação de DCs pode se tornar uma abordagem interessante tanto na estimulação de resposta imune em situações de imunodepressão, como canceres, quanto no controle de doenças inflamatórias, prevenção de respostas deletérias e no controle de doenças autoimunes. Entretanto, tendo em vista a plasticidade fenotípica e funcional das DCs, em decorrência dos estímulos presentes no microambiente, a identificação de novos compostos com capacidade imunomoduladora é complexa.
Abordagens terapêuticas utilizando DCs moduladas têm se mostrado uma ferramenta bastante promissora no tratamento de doenças inflamatórias. A literatura mostra que DCs tratadas com formulações sintéticas, ou extratos derivados de patógenos, são capazes de manter um fenótipo imaturo e suprimirem a gravidade da inflamação em doenças como a artrite experimental induzida por colágeno e a Encefalomielite Autoimune Experimental (MOSER et al., 1995; REA et al., 2000; TERNESS et al., 2008; UNGER et al., 2009; KO et
al., 2010). Outros compostos como dihidroartemisinina, vitamina D e CTLA-4-Ig (um
conjugado de porção Fc de anticorpo com molécula de CTLA-4), também se mostraram capazes de interferir na maturação de DCs, que, quando transferidas para camundongos, foram capazes de suprimir a inflamação crônica em diversos modelos experimentais (ZHAO et al., 2012; BAHRI et al., 2009; KO et al., 2010; MELLOR et al., 2004; FARIAS et al., 2013).
DCs tornadas tolerogênicas após tratamento com dexametasona, um composto sintético análogo ao cortisol, adquirem um fenótipo supressor e induzem a expansão de células T com perfil regulatório (EMMER et al., 2006; MOSER et al., 1995; REA et al., 2000; UNGER
et al., 2009) e quando transferidas adotivamente para animais experimentais, as DC moduladas
com dexametasona reduziram significativamente a severidade do quadro clínico de Encefalomielite Autoimune Experimental, um modelo experimental da esclerose múltipla em camundongos (PENA et al., 2013).
1.2. ENCEFALOMIELITE AUTOIMUNE EXPERIMENTAL
A Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) é uma neuroinflamação mediada por células T que, em muitos aspectos, mimetiza a doença humana Esclerose Múltipla (EM). Basicamente a EM é uma doença autoimune desmielinizante do Sistema Nervos Central, que acomete principalmente mulheres na idade de 15 à 50 anos, os pricipais
sintomas são: fraqueza muscular, formigamente, sinal de Lhermite, neurite óptica e até cegueira, os principais remédios para o tratamento incluem corticosteroides, Interferons beta 1A e 1B, ácido glatirâmico, entre alguns anticorpos monoclonais como Natalizumab e Fingolimob (PALLE et al., 2017).
É o modelo mais bem estudado e abrangente da EM uma vez que o antígeno, o tempo de desenvolvimento da doença e o local da resposta autoimune são conhecidos (Constantinescu
et al, 2011). No entanto, a EM é uma doença espontânea, altamente imprevisível, e envolve
muito mais variáveis do que somente as identificadas na EAE (BATOULIS et al, 2010). A EAE pode ser induzida em camundongos de algumas linhagens, através da imunização com neuroantígenos próprios derivados de componentes do SNC, como myelin
basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP), myelin-associated glycoprotein (MAG), myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) (WEIR et al, 2002) ou S-100 protein
(Constantinescu et al, 2011). O antígeno é administrado juntamente com o adjuvante completo de Freund (uma emulsão oleosa contendo Mycobacterium tuberculosis usado para agravar a resposta imune) e a toxina de Pertussis (a toxina utilizada é a da Bordetella pertussis, utilizada para ter a quebra da barreira hematoencefálica, deixando assim o infiltrado inflamatório adentrar o SNC). Isso resulta no reconhecimento e destruição de componentes do SNC, desencadeando a evolução da doença (THOMÉ et al, 2013).
O modelo de EAE em camundongos da linhagem C57BL/6J caracteriza-se por lesões inflamatórias e desmielinizantes. A seguinte escala arbitrária é utilizada para reconhecer o desenvolvimento clínico da doença: 1 - cauda flácida; 2 - fraqueza dos membros posteriores; 3 - paralisia completa dos membros posteriores e fraqueza dos membros anteriores; 4 - paralisia completa dos membros posteriores e parcial dos anteriores; 5 - paralisia completa ou morte.
Seu padrão é altamente reprodutível e previsível na maioria dos camundongos, apresentando paralisia de caráter ascendente, mas apresentando também a fase crônica progressiva com remissões com o passar do tempo (BATOULIS et al, 2010).
Embora os mecanismos da EM não sejam ainda totalmente compreendidos, devido a sua etiologia complexa em termos de processo autoimune, o desenvolvimento do modelo de EAE tem sido útil, uma vez que esclarece alguns processos imunológicos relevantes da doença, contribui para a compreensão científica das doenças autoimunes desmielinizantes, o tráfego de linfócitos e a função da barreira hematoencefálica em inflamações do Sistema Nervoso Central (Constantinescu et al, 2011). A EAE também tem sido utilizada no desenvolvimento de medicamentos, ajudando a identificar novos agentes terapêuticos que possam vir a ser benéficos na EM e outros distúrbios semelhantes. Nesse sentido, a identificação de compostos com
capacidade de modular células dendríticas e, consequentemente, direcionar respostas de células T para um perfil anti-inflamatório ou regulador é altamente desejável.
Recentemente, formulações empregadas no controle do parasita Plasmodium, o agente causador da malária, mostraram-se eficazes na modulação de alguns parâmetros do sistema imune. Dentre estas formulações, destaca-se a cloroquina (CQ).
1.3. CLOROQUINA
A Cloroquina (CQ) foi introduzida em 1941 como uma alternativa de antimalárico aos tratamentos utilizados na época de intenso contágio, este medicamento entrou no mercado com o nome de Resochim®. A CQ, juntamente com seus análogos estruturais, como a hidroxicloroquina, a primaquina, a mefloquina ou a ferroquina (análogos ferrocênicos da CQ), tem sido utilizada há décadas como o principal e mais bem-sucedido medicamento contra a malária.
Além de seu efeito antimalárico, tem sido observado que a CQ pode modular células do sistema imune e processos inflamatórios distintos, exercendo parte de seu potencial anti-inflamatório através da inibição/supressão da produção e sinalização do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) em macrófagos ( JEONG et al., 1997; WEBER & LEVITZ, 2000), bem como através da alteração do padrão de citocinas secretadas por células apresentadoras de antígenos (KARRES, 1998). Por exemplo, a administração de CQ foi capaz de reduzir a inflamação deletéria em modelo murino de Doença do Enxerto versus Hospedeiro e amenizar as manifestações clínicas de artrite reumatoide (RINTELEN et al., 2006; SCHULTZ et al., 2002). Na artrite reumatoide (AR), a CQ tem sido utilizada, com relativo sucesso, como uma segunda linha de fármaco apresentando menos efeitos tóxicos do que o metotrexato, um dos fármacos mais empregados no tratamento desta doença (FELSON et al., 1990). O uso da CQ na AR reduziu a infiltração das articulações, bem como a dor, e aumentou as funções físicas dos pacientes sem que efeitos colaterais fossem registrados após 36 semanas de tratamento (SCOTT et al., 1989; MCCARTY & CARRERA, 1982; GIBSON et al., 1987).
A CQ tem sido utilizada também no tratamento de doenças associadas ao aumento da secreção de citocinas pró-inflamatórios como, por exemplo, o Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) (Zhu et al, 2002), a Artrite reumatoide e também em infecções virais. Estudos têm demonstrado que o uso da CQ, bem como da hidroxicloroquina (HCQ), é capaz de reduzir os sinais do LES em lesões epidérmicas e articulações (KUHN et al., 2011). Um grupo de pesquisa
no Japão mostrou que o tratamento com HCQ reduziu os sintomas clínicos do LES sem o desenvolvimento de efeitos colaterais (MOMOSE et al., 2013).
Nosso laboratório estabeleceu, recentemente, uma linha de pesquisa envolvendo a modulação do sistema imune em condições inflamatórias crônicas, utilizando a EAE como modelo experimental e a CQ como agente modulador. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com CQ promove a geração de células T reguladoras e a redução da frequência de DCs em camundongos naïve (THOMÉ et al., 2013). Quando administrada em camundongos portadores de EAE, o quadro clínico da doença foi significativamente melhorado em comparação com os grupos de animais tratados com o veículo (tratados com Tampão Fosfato - PBS). Análises subsequentes demonstraram que a frequência de células T reguladoras, em animais tratados com CQ, apresentou-se elevada em relação aos animais não tratados (THOMÉ
et al., 2013). Na ocasião, postulamos que os achados indicavam uma possível modulação de
DCs após administração de CQ.
Análises posteriores mostraram que DCs diferenciadas in vitro e tratadas com CQ apresentam alterações morfológicas importantes, como redução dos prolongamentos celulares em análises ultraestruturais por microscopia eletrônica de varredura e diminuição da expressão de moléculas envolvidas na apresentação de antígenos a linfócitos T. Nossos resultados também mostraram que o tratamento com CQ estimulou a produção de óxido nítrico, NO (Nitric Oxide) por DCs (VERINAUD et al., 2014). Quando transferidas adotivamente, as DCs moduladas com CQ foram capazes de reduzir o quadro clínico de EAE por meio da supressão da resposta a neuro-antígenos e diminuição da inflamação no sistema nervoso central (THOMÉ
et al., 2014).
Experimentos de cocultivo de DC com linfócitos T naïve mostraram que as DCs moduladas com CQ foram pouco eficientes em estimular a proliferação celular frente peptídeo MOG35-55. Interessantemente, quando as coculturas foram realizadas na presença de N
(G)-nitro-L- arginine methyl ester (L-NAME), um inibidor da enzima iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase), indutora da produção de NO, a capacidade supressora de DCs foi abolida (THOMÉ et al., 2014).
Embora a produção de NO seja reconhecida como uma das características da resposta imune na eliminação de microrganismos, estudos recentes têm demonstrado que o óxido nítrico pode exercer efeitos imunomoduladores. Camundongos nocautes para iNOS desenvolvem EAE mais severa quando comparados com animais selvagens (NIEDBALA et al., 2011). Aparentemente, a produção de NO estimula a diferenciação de células T naïve em Tregs ao passo que inibe a geração de células Th1 e Th17 (NIEDBALA et al., 2007; 2011). Os
mecanismos moleculares envolvidos ainda não estão esclarecidos. No entanto, verificou-se que células T regulatórias geradas em ambiente rico em NO suprimem células Th17, que estimulam um quadro severo de EAE (MCKENZIE et al., 2006; O'CONNOR et al., 2008; PARK et al., 2005).
Interessantemente, nossos resultados mostraram que a função tolerogênica de DCs tratadas com CQ é parcialmente dependente da produção de óxido nítrico, uma vez que DCs geradas a partir de camundongos KO (knockout) para iNOS mostraram-se incapazes de suprimir a evolução da neuro-inflamação bem como a diferenciação de células T reguladoras (VERINAUD et al., 2014). Tomados em conjunto, esses achados indicam que a CQ é capaz de modular a atividade de DCs, induzindo um perfil tolerogênico. Entretanto, os mecanismos envolvidos nesse efeito ainda não foram esclarecidos.
Dentre as características da neuroinflamação observada na EAE está a migração de DCs ao sistema nervoso central, ativação de micróglia, produção de citocinas inflamatórias, como Interferon-gama (IFN-γ), Interleucina-1 beta (IL-1), IL-6 e IL-17, ativação e morte de oligodendrócitos e neurônios (PETERMANN & KORN, 2011; ZOZULYA et al., 2009). Diversos estudos demonstraram que a CQ exerce efeito sobre a sinalização das vias que utilizam receptores do tipo Toll, os chamados TLRs (Toll-like Receptors), promovendo imunossupressão em macrófagos e células dendríticas ( THOMÉ et al., 2013b; ZHU et al., 2012; YASUDA et al., 2008). A estimulação de receptores TLRs por padrões associados a patógenos (PAMPs) induz a ativação de macrófagos e DCs, culminando na produção de diversos mediadores inflamatórios.
Os TLRs utilizam a proteína MyD88 como um adaptador intracelular capaz de facilitar a ativação de cascatas de sinalização distintas (O'NEILL & BOWIE, 2007). Já foi observado anteriormente que a CQ, bem como o artesunato, outro fármaco também empregado no tratamento da malária, são capazes de inibir a função de TLRs em ratos portadores de artrite (LI et al., 2013). Neste trabalho, os autores demonstraram que a administração de artesunato reduzia a expressão e a secreção de citocinas inflamatórias IL-1, TNF-α, IL-17 e do fator inibidor de hipóxia-1alfa (HIF1α). Em estudos com ambos os compostos (cloroquina e artesunato), a supressão da sinalização de TLR foi diretamente alcançada pela interferência na sinalização da proteína adaptadora MyD88 (myeloid differentiation primary response 88).
Muitos tipos de TLR acoplados a MyD88 levam à ativação da via de sinalização intracelular chamada mTOR (mammalian Target Of Rapamycin), um complexo multifuncional que pode ser ativado por diversos estímulos e que controla muitos processos celulares envolvendo a geração ou o uso de grandes quantidades de energia e nutrientes. Evidencias
crescentes mostram que a via de sinalização mTOR tem grande impacto em funções celulares básicas importantes, como proliferação e crescimento (WULLSCHLEGER et al., 2006).
1.4. VIA DE SINALIZAÇÃO: mTOR
A descoberta da via de sinalização mTOR teve início na década de 60, quando pesquisadores descobriram, no solo da Ilha de Rapa Nui (Chile), ou Ilha de Páscoa, uma bactéria, a Streptomyces Hygroscopius, com potente ação antifúngica e imunossupressora (VÉZINA, KUDELSKI & SEHGAL, 1975). Mais tarde, descobriu-se que tais propriedades estavam associadas a um composto produzido por essas bactérias, denominado de rapamicina (SEHGAL, 2003), que apresentava potente atividade antiproliferativa, inclusive numa grande variedade de organismos eucarióticos (LOEHBERG et al, 2011). Posteriormente, esse efeito regulador do crescimento foi atribuído à capacidade da rapamicina de inibir a sinalização de duas serina/treonina quinases presentes em leveduras, que foram inicialmente denominadas de
target of rapamyin (TOR) 1 e 2. Como um gene ortólogo foi mais tarde identificado em
mamíferos, essas quinases passaram a ser denominadas de mammalian target of rapamycin (mTOR) (SABATINI et al., 1994). Em virtude da percepção da grande complexidade dos mecanismos regulados por proteínas acopladas à estas quinases em associação com a rapamicina, Laplante e Sabatini propuseram, em 2012, a mudança da nomenclatura da via para
mechanistic target of rapamycin.
A sinalização através da via mTOR permite ao organismo lidar com os sinais do ambiente e, assim, controlar vários processos celulares, como, por exemplo, regular o metabolismo e o crescimento celular em resposta a diferentes estímulos ambientais, bem como inibir a autofagia e a proliferação acelerada, entre outros (SAXTON & SABATINI, 2017).
A via mTOR está fortemente conectada a outra via de ativação intracelular denominada PI3K(Phosphatidylinositol-3-Kinase)/Akt (conhecida como PKB - protein kinase B) que, não raro, elas são consideradas como uma só via de sinalização (PI3K/Akt/mTOR).
A cascata de transdução de sinais tem início quando a ligação de diferentes estímulos, tais como fatores de crescimento, citocinas ou hormônios, aos receptores tirosina quinases (RTK) induz a translocação de PIK3 do citoplasma para a membrana promovendo a fosforilação de PIP2 (phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate), na posição 3’-OH do anel inositol, para gerar o segundo mensageiro PIP3 (phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate), que recruta um grupo de proteínas sinalizadoras com domínio PH (pleckstrin homology), incluindo PKD (Pyruvate dehydrogenase kinase) e Akt.
Akt ativada exerce funções tanto estimuladoras quanto inibidoras através da fosforilação de seus alvos. A fosforilação, por Akt, da molécula TSC2 (Tuberous Sclerosis
Complex 2), inibe a formação do complexo TSC1/2, um regulador negativo da via de
sinalização mTOR através da proteína Rheb, que tem atividade GTPase e oscila entre as formas Rheb (Ras homologue enriched in brain)/GDP (guanosine diphosphate) (inativa) e Rheb/GTP (guanosine triphosphate) (ativa). Sem a formação do complexo TSC1/2, a forma ativa de Rheb pode, então, ativar a via mTOR (Figura 1).
Figura 1: Representação esquemática da via de sinalização intracelular PI3K/Akt/mTOR.
(Figura feita inteiramente por mim em:https://mindthegraph.com/)
A via de sinalização mTOR possui dois complexos multiproteicos distintos, mTORC1 -formado pela interação com proteínas raptor (regulatory-associated proteins of mTOR), e mTORC2 – formado pela interação com a proteína rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR. (ZONCU et al., 2011).
mTORC1 é conhecido por sua sensibilidade à rapamicina; entretanto, os mecanismos envolvidos nesta atividade não estão, até o momento, esclarecidos. Além de um importante
antifúngico e droga anticancerígena, foi demonstrado recentemente que a inibição de mTORC1 pode exercer atividade imunossupressora sobre DCs, reduzindo a produção de citocinas inflamatórias e a expressão de moléculas coestimulatórias como, por exemplo, B7 (Rosborough
et al., 2013).
Inicialmente, o complexo mTORC2 foi identificado como insensível aos efeitos da rapamicina uma vez que a tratamento agudo com este inibidor não afetava sua atividade. Entretanto, estudos subsequentes mostraram que a exposição crônica à rapamicina era capaz de promover a inibição do complexo mTORC2 através do bloqueio da formação de novos complexos (SARBASOV et al., 2005).
Tendo em vista que a via de sinalização mTOR encontra-se desregulada em diversas patologias humanas, como canceres, diabetes do tipo II, obesidade e doenças degenerativas do sistema nervoso central, grandes esforços têm sido feitos visando esta via como alvo de manipulação por diversos fármacos.
Zhao e colaboradores, em 2012, verificaram que produtos derivados de artesininas, como a dihidroartemisinina-piperaquina (DHA-P) - também utilizada no tratamento da malária -, suprimem a EAE através da modulação da via de sinalização mTOR. Anteriormente, foi demonstrado que cloroquina exerce efeitos tumoricidas por meio da inibição da via mTOR em células de câncer mamário (LOEHBERG et al., 2012). Além disso, a interação das vias mTOR e MyD88 na produção de óxido nítrico por macrófagos após contato com lipopolissacarídeo já é conhecida também (LOPEZ-PELAEZ et al., 2011). Interessantemente, a inibição da via mTOR em células ativadas por TLR promove um aumento na expressão de iNOS (DIAZ-GUERRA et al., 1999; GUHA & MACKMAN, 2002).
Um aumento crescente de evidências tem sugerido que a manipulação da via mTOR em células dendríticas facilita a apresentação de antígenos em contexto de geração de células T reguladoras ao passo que inibe a formação de células Th1/Th17 (ROSBOROUGH et al., 2015).
Assim, muito embora nosso grupo já tenha demonstrado, utilizando o modelo experimental de EAE, que o tratamento com a cloroquina é capaz de modular células dendríticas para um perfil tolerogênico induzindo redução da inflamação com nítida melhora dos sinais clínicos da doença, mais estudos são necessários para determinar, com maior precisão, seus mecanismos de ação.
Neste contexto, o presente projeto se propôs a investigar a influência da via de sinalização mTOR na função moduladora de células dendríticas tratadas com cloroquina. Acreditamos que um melhor entendimento da participação das vias de sinalização intracelular,
que governam a geração de células dendríticas tolerogênicas, poderá contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes no controle das respostas inflamatórias.
2. OBJETIVOS
O objetivo do presente trabalho foi o de explorar novos conhecimentos no sentido de se esclarecer o mecanismo de ação da Cloroquina sobre a atividade de Células Dendríticas. Para tal, as seguintes metas foram cumpridas:
Investigar a participação da via mTOR sobre o fenótipo de Células Dendríticas
tratadas com Cloroquina através da análise da:
(I) Expressão de moléculas envolvidas na apresentação de antígenos (MHC-II, CD86, IL-7R, e CD8-α);
(II) Expressão de mTOR fosforilada,
(III) Expressão genica da isoforma induzível da enzima Oxido Nítrico Sintase (iNOS), e (III) Expressão gênica e detecção de citocinas secretadas (IL-10, IL-6, TNF-α, TGF-β).
Investigar a participação da via mTOR sobre a função de Células Dendríticas
tratadas com Cloroquina e/ou Rapamicina em cocultura com linfócitos T CD4+
naïve e encefalitogênicos avaliando-se a:
(I) Diferenciação de linfócitos T em subpopulações;
(II) Proliferação antígeno-específica de linfócitos T na presença de MOG35-55, e
(III) Produção de IL-17, IL-10 e IFN-γ.
Investigar a influência de mTOR no potencial terapêutico de Células Dendrítcas
tolerogênicas (tratadas com Cloroquina) avaliando-se:
(I) A evolução clínica da doença após a transferência das células moduladas in vivo, e (II) O infiltrado celular inflamatório no Sistema Nervoso Central.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. ANIMAIS
Camundongos fêmea C57BL/6, de seis a oito semanas de idade, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB/UNICAMP), foram mantidos em condições S.P.F. (specific-pathogen
free) com água e ração estéreis e oferecidas ad libitum, tendo a temperatura e o fotoperíodo em
ciclos de 12 horas controlados durante todo o experimento. Os animais foram separados em grupos experimentais distintos, sendo cada grupo constituído por cinco animais (n=5). Os protocolos envolvendo o uso de animais de laboratório foram conduzidos de acordo com as normas da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL/COBEA) e aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UNICAMP, #3650-1 – ANEXOS).
3.2. GERAÇÃO E MODULAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCS)
3.2.1. Diferenciação a partir de precursores de medula óssea.
Células precursoras de medula óssea foram coletadas dos fêmures e tíbias dos camundongos, utilizando-se seringa com agulha de calibre 26G e 10 ml de meio de cultura, conforme protocolo estabelecido por LUTZ et al. (1999) (com modificação na origem do GM-CSF utilizado - Granulocyte-macrophage colony-stimulating fator). Após centrifugação (1500rpm/ 4ºC por 10min), a suspensão foi ajustada para a concentração de 1x106 células/mL, em meio de cultura IMDM completo (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, Sigma) contendo 10% de Soro Fetal Bovino (SFB; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 50 mg/mL de L-glutamina, Penicilina e Etreptomicina (Gibco Inc., Billings, MT, USA) e suplementado com 10% de sobrenadante de cultura de Células L929 (linhagem celular conhecida por produzir quantidades elevadas de GM-CSF). A cultura foi incubada em placas de petri por sete dias à 37ºC, em estufa com 5% de CO2 e, durante esse tempo, 90% do meio de cultura foi descartado
e substituído por um novo meio a cada dois dias. O processo de diferenciação foi acompanhado por marcação celular através de citometria de fluxo (ver com detalhes no item 3.11) com a marcação para células CD11c+/MHC-II+.
3.2.2. Modulação de Células Dendríticas in vitro.
Para modulação de sua atividade funcional, no sétimo dia de incubação das células o meio de cultura foi substituído por meio IMDM incompleto (contendo 10% SFB e 50 mg/mL de L-glutamina, Penicilina e Etreptomicina) e as culturas foram separadas em três grupos de acordo com o tratamento recebido: Grupo controle (ausência de qualquer estímulo, apenas DCs); Grupo DC+LPS (Dcs tratadas com lipopolissacarídeo de E. coli - Escherichia coli (LPS – Lipopolissacarídeo - cepa 026:B6/ 100ng/ml), e Grupo DC+LPS+CQ (Dcs tratadas com LPS e Cloroquina (CQ - 50µM)). Após incubação a 37°C por 18 horas, em estufa contendo 5% de CO2, alíquotas dessas células foram coletadas e avaliadas quanto a expressão de moléculas de
superfície, expressão gênica de citocinas e ensaios de transferência adotiva, capacidade de apresentação de antígenos e linfoproliferação. Sobrenadantes das culturas também foram coletados para análise da produção de citocinas secretadas.
3.2.3. Inibição farmacológica da via mTOR pela Rapamicina.
Alternativamente, as DCs também foram tratadas com o inibidor farmacológico de mTORC1 (Rapamicina - RAPA, 50 µM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) na presença de CQ (50µM) e LPS (100ng/ml) – Grupo DC+LPS+CQ+RAPA. Após a incubação, alíquotas dessas células, e seu sobrenadante, foram coletados das culturas para avaliação dos parâmetros citamos acima.
3.3. ENSAIO DE TOXICIDADE DA CLOROQUINA (CQ) SOBRE CÉLULAS
DENDRÍTICAS.
Para validação do efeito não-citotóxico da CQ sobre as DCs, foi realizado ensaio de viabilidade celular utilizando o método rápido colorimétrico de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazólico) estabelecido por Mosmann (1983). Para tanto, no sétimo dia de cultura das DCs em placas de 96 poços, o meio condicionado foi retirado e acrescentado 200µl de meio IMDM Completo (contendo 10% SFB e 50 mg/mL de L-glutamina, Penicilina e Estreptomicina) juntamente com Cloroquina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) nas concentrações de 0 (Controle), 5, 10, 25, 50 e 100µM. Após incubação por 18hs em estufa contendo 5% de CO2, e à 37ºC, o meio foi retirado e foram adicionados 90µl de meio IMDM
completo, juntamente com 10µl de MTT (5mg/ml). A cultura foi, então, incubada novamente, em estufa à 37ºC com 5% de CO2, por 4hs. Em seguida, o meio foi aspirado e 100µl de
composto azul-escuro gerado pela clivagem do anel de tetrazólio por desidrogenases mitocondriais, presentes apenas em células vivas. A análise foi realizada em leitor de placas de ELISA (Termo Scientific MultskanGO, software SkanIT RE for Multiskan GO 3.2.). com comprimento de onda de 540 e 690nm.
3.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
Culturas de DCs tratadas com LPS (DCs-LPS), LPS e cloroquina (DCs-LPS-CQ) e com LPS, cloroquina e rapamicina (DCs-LPS-CQ-RAPA) foram analisadas nos aumentos de 10X e 40X (barra de escala 50um), quanto a seu aspecto morfológico, em microscópio óptico (Leica DM5500B acoplado a uma câmera Leica DFC345 FX).
3.5. DETECÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
3.5.1. Extração de RNA e conversão em DNA complementar
A extração de RNA foi realizada conforme instrução do fabricante do reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). A amostra, contendo 1x106 de DCs, foi centrifugada a 300g e, posteriormente, ressuspensa em 700 µl de trizol. Em seguida, foram adicionados 200 µl de clorofórmio gelado (Merck, Campinas, SP, Brasil) e a mistura foi homogeneizada por 15 segundos em um vórtex. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 12000g, por 15 minutos, a 4˚C, e a fase aquosa transferida para um novo tubo. Após adição de 500 µl de isopropanol gelado, o tubo foi incubado a -800C por uma noite. No dia seguinte, a amostra foi incubada em temperatura ambiente por 10 minutos e, na sequência, centrifugada a 12000g, por 30 minutos, a 4˚C. O pellet foi lavado com 1 ml de etanol 75% gelado e submetido a centrifugação a 8000g, por 5 minutos, a 4˚C. As amostras de RNA foram suspensas em 20 µl de água deionizada e livre de RNase, e quantificadas em espectrofotômetro (Termo Scientific MultiskanGO,
software SKanIT RE for Multiskan GO 3.2.). Após tratamento com com DNase I (DNase I
Amplification Grade, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), conforme instruções do fabricante, o DNA complementar foi sintetizado seguindo orientações do fabricante do High Capacity
cDNA Reverse Transcript Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
3.5.2. Reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real
Para preparação das amostras, foram seguidas as recomendações do fabricante do reagente TaqMan Gene Expression Master Mix™ (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). Os seguintes primers foram utilizados nas reações: (IL)-10 (Mm01288386_m1), IL-6 (Mm00446190_m1), fator de crescimento e transformação-beta (TGF-β, transforming growth
factor beta) (Mm00441729_g1) e fator de necrose tumoral -alfa (TNF-α, tumor necrosis factor alfa) (Mm00443258_m1), iNOS (Mm01208059_m1) e arginase (Mm00475988_m1).
A expressão gênica da enzima glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH; Mm99999915_g1) foi utilizada como controle endógeno. Todos os reagentes foram adquiridos da empresa Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). A expressão dos genes nas DCs foi analisada utilizando os sistemas TaqMan em equipamento ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Os resultados foram analisados com base no valor de CT (cicle threshold ou ciclo limiar), sendo este o ponto correspondente ao número de ciclos no qual a amplificação atinge um dado limiar, que permite a análise quantitativa da expressão do fator avaliado. A expressão gênica dos genes de interesse, nos diferentes grupos, foi representada como número relativo de cópias através do método do ciclo delta threshold (2-ΔΔCt).
3.6. ENSAIOS DE COCULTURA DE LINFÓCITOS T CD4+ COM CÉLULAS
DENDRÍTICAS
3.6.1. Cocultura de linfócitos T CD4+ com Células Dendríticas
DCs diferenciadas e tratadas in vitro, conforme descrito anteriormente (item 3.2), foram cultivadas com linfócitos T CD4+ naïve e linfócitos T CD4+ encefalitogênicos, na
proporção de 1:10 (DC:T). Para tanto, as DCs foram semeadas em placas de 96 poços de fundo em ‘U’ na contagem de 2x104 cells em 100µl de Meio IMDM Completo. Em seguida, as células
T naïve foram isoladas por esferas magnéticas a partir do baço de camundongos C57BL/6 fêmeas naïve, utilizando-se do kit específico para isolamento dessas células (Naive CD4+ T Cell Isolation kit Miltenyi Biotec, Alemanha). Para a obtenção de linfócitos T CD4+
encefalitogênicos, camundongos C57BL/6 fêmeas que foram imunizadas para desenvolver EAE, conforme descrito adiante, e, entre os dias 7 - 10 após a imunização, tiveram seus baços retirados e os linfócitos T ativados foram isolados com esferas magnéticas conforme instruções do fabricante, utilizando-se kit de isolamento de células TCD4+ (CD4 - L3T4 – MicroBeads
Miltenyi Biotec, Alemanha). O linfócitos foram colocados na contagem de 2x105 cell em 100µl
de meio IMDM encima das DCs na placa de 96 poços com fundo em ‘U’, separando as células
naïve das encefalitogênicas em placas diferentes. Em adição nessa cocultura, foi colocado o
células foram mantidas em cocultura por 72h à 37ºC, em estufa contendo 5% de CO2 e em
seguidaanalisadas quanto ao perfil de proliferação e diferenciação.
3.6.2. Avaliação da proliferação dos linfócitos T CD4+.
Para ensaios envolvendo proliferação, linfócitos T foram contados e ressuspendidos em 1ml de PBS estéril contendo a sonda CSFE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester, 5μM) na densidade de 1x106 células /ml e deixados em temperatura ambiente no escuro por cinco
minutos. Em seguida, foi adicionado o Meio IMDM Completo para cessar a marcação da sonda e as suspensões foram lavadas 2 vezes por 1500 rpm à 4ºC por 10 minutos, descartado o sobrenadante, ressuspensas no volume de 1x105 em 200µl por poço em placa de 96 poços com
fundo em ‘U’ com IMDM Completo contendo 50µg/mL de MOG35-55 (Myelin Olygodendrocyte
Glycoprotein) e o estímulo anti-CD3 NA/LE (0,5 µg/ml, BD Bioscience) e distribuídas nas
placas de cultura (lembrando que estes poços já estavam com 100µl de 2x104 de DCs em meio completo, como descrito no item 3.6.1 acima). Antes da adição dos antígenos, foi efetuada a análise de uma alíquota das células marcadas com CSFE por citometria de fluxo, para definir o valor máximo de incorporação da sonda. As placas de cultura foram incubadas em estufa de CO2 5% a 37ºC por 72 hors. Em seguida, as células em cada poço foram lavadas com PBS,
transferidas para tubos apropriados, marcadas com anti-CD4 (ver marcação detalhada no item
3.11) e analisadas em citômetro de fluxo (Gallios, Becman-Coulter) localizado no
Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, do Instituto de Biologia da UNICAMP. A proliferação foi analisada pelo decaimento da fluorescência da sonda nas subpopulações de linfócitos T pertinentes a cada experimento.
3.6.3. Avaliação do perfil de diferenciação dos linfócitos T CD4+
Após o término da incubação (descrito no item 3.6.1), as células foram estimuladas com PMA (Phorbol Myristate Acetato) 1mg/ml, Ionomicina (5mg/ml) e Brefeldina A (5mg/ml) por 4h a 37ºC. Estes reagentes foram adquiridos de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA. Os linfócitos foram, então, imunomarcados com anticorpos anti-CD4, incubados por 30 min à 4ºC, lavados com PBS e centrifugadas à 1500rpm 4ºC por 10min, fixados com paraformaldeído 1% por 20 min no escuro em temperatura ambiente, lavadas e centrifugadas novamente, permeabilizados com tampões comerciais eBioscience por 30min à 4ºC, foi repetido o processo de lavagem. Posteriormente, as células foram incubadas overnight à 4ºC, com os seguintes anticorpos intracelulares: anti-IL17, anti-IFN-γ e anti-IL10. Todos os anticorpos foram adquiridos da empresa eBioscience (USA) e apresentavam-se conjugados com diferentes
fluorocromos conforme descrito no item 3.11 (ver marcação detalhada neste item mencionado), lavadas novamente e ressuspensas em 500µl de PBS. As preparações foram adquiridas em citômetro de fluxo (BD FACSVerse, localizado no Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Instituto de Biologia, UNICAMP) e os dados analisados utilizando o programa FlowJo VX.
3.7. ENSAIO DE DETECÇÃO DE CITOCINAS SECRETADAS EM
CULTURA DE CÉLULAS DENDRÍTICAS E COCULTURA DE DCS E LINFÓCITOS T
A análise quantitativa da produção das citocinas IL-10, IL-6, TNF-α, TGF-β, secretadas pelas DCs diferenciadas e moduladas in vitro com Cloroquina e Rapamicina, e de IL-10, IL-17 e INF-γ, secretadas por linfócitos T diferenciados na presença de DCs, foi realizada no sobrenadante das cultura e coculturas por meio de kits ELISA (DuoSet® ELISA;
R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). A densidade óptica foi medida em comprimento
de onda de 450 nm em espectrofotômetro (Termo Scientific Multskan GO, software SkanIT RE for Multiskan GO 3.2.).
3.8. TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE DCS PARA CAMUNDONGOS
NAÏVE
Após geração e modulação das DCs com cloroquina, conforme descrito anteriormente (item 3.4 de M&M), 1,5x106 células, contidas em 100 µl, foram transferidas, via plexo retro-orbital para camundongos C57BL6/J naïve. Depois de três dias, foi realizada a indução de EAE e os animais acompanhados durante 18 dias para acompanhamento do desenvolvimento da doença através da análise do escore clínico. Findo o período de observação, os animais foram anestesiados, com xilazina (10mg/Kg) e Quetamina (80mg/Kg), por via intramuscular, e, em seguida, perfundidos com solução de NaCl 0,15 M, contendo tampão fosfato 0,02 M, pH 7,4, para remoção do cérebro, ou com parafolmaldeído 4%, para remoção do medula espinal (região lombar), e processados para análises quanto ao infiltrado inflamatório.
3.9. INDUÇÃO E AVALIAÇÃO DA ENCEFALOMIELITE AUTOIMUNE EXPERIMENTAL (EAE)
Para indução da EAE nos animais, o protocolo descrito por FARIAS et al (2011) foi seguido com pequenas modificações. Cada camundongo recebeu uma emulsão de 200 µg do peptídeo do neuroantígeno MOG35-55 (GenScript USA Inc., Piscataway, NJ, USA)emulsionado
em 100µl de adjuvante completo de Freund (CFA, complete Freund adjuvant, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) contendo 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (Difco). Metade da emulsão foi administrada na base da cauda e o restante na base da nuca dos animais, ambos por via subcutânea. Além da emulsão, os animais receberam, intraperitonealmente (i.p.), uma dose (240 ηg/ml) de toxina Pertussis (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) para indução de quebra da barreira hematoencefálica. Outra dose da toxina foi administrada nos animais 48 horas depois. O desenvolvimento e a severidade da EAE foram avaliados diariamente a partir do décimo dia após a indução da doença, de acordo com a progressão de pontuação baseada nos sinais clínicos dos animais (escore clínico). A saber: 0, para o animal não doente; 1, para perda de tônus da cauda; 2, para fraqueza dos membros posteriores; 3, para paralisia dos membros posteriores; 4, para fraqueza ou paralisia dos membros anteriores juntamente com os posteriores, e 5, para o animal agonizando ou morto. Os sinais clínicos e o peso corporal dos animais foram acompanhados ao longo de todo o período do experimento. Ao término do período de acompanhamento, os animais foram anestesiados e perfundidos. A região lombar do medula espinal, onde se localizam os moto-neurôneos que enervam os membros posteriores, e o cérebro foram devidamente processados para análise de infiltrado inflamatório utilizando-se técnicas histológicas e de citometria de fluxo.
3.10. ANÁLISE DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3.10.1. Análise histológica da medula espinal
As medulas espinais, obtidas de animais portadores de EAE, foram desidratados em concentrações crescentes de álcool (70%, 80%, 95%, 100%), por 5min em cada concentração, colocados em solução xilol / álcool 100% (1:1) por 10 min, diafanizados em xilol por 15min, xilol/ parafina (1:1) por 1h e, finalmente, incluídos em parafina. Logo em seguida, cortes de 5µm foram obtidos em micrótomo. Após desparafinização com xilol por 15min e hidratação em gradiente decrescente de álcool (100%, 95%, 80% e 70%) por 5min em cada concentração,
