4. RESULTADOS
4.2. PARTICIPAÇÃO DA VIA DE SINALIZAÇÃO mTOR NA FUNÇÃO DE CÉLULAS
Após constatação da participação da via mTOR nos efeitos da CQ sobre a maturação das DCs, e, consequentemente, sobre o perfil de repostas imunes a serem induzidas, os experimentos conduzidos nesta etapa tiveram por objetivo investigar a participação desta via de sinalização sobre a função de DCs.
Para tal, DCs estimuladas com o ativador microbiano LPS e, em seguida, tratadas com cloroquina e/ou rapamicina, foram avaliadas quanto à sua capacidade em induzir proliferação e diferenciação de células TCD4+ obtidas de animais naïve e também de animais portadores de
Encefalomielite Autoimune Experimental.
Assim, DCs, geradas in vitro, foram tratadas por 18 horas com um estímulo microbiano (LPS) para induzir seu amadurecimento (grupo controle). Estas células receberam, então, a denominação de DCs maduras (mDC). Os grupos experimentais incluíram então: células maduras tratadas com cloroquina (mDC+CQ) e células maduras tratadas com cloroquina e seu inibidor (mDC+CQ+RAPA). Um segundo controle (DCs imaturas) foi realizado utilizando DCs não estimuladas (iDC). Após vinte e quatro horas dos tratamentos, as DCs foram colocadas em cultura, por 72 horas, com linfócitos TCD4+, obtidos de baço de animais saudáveis
(linfócitos T naïve CD4+), ou com linfócitos encefalitogênicos (ativados) obtidos de animais
portadores de EAE (linfócitos T CD4+). Ao início da cocultura, para análise da proliferação
celular, os linfócitos T foram marcados com a sonda CFSE e estimulados com MOG35-55 e
Figura 10. Análise da proliferação de linfócitos T naïve CD4+ e T encefalitogênicos CD4+ em cocultura com
Células Dendríticas (DCs). (A) Esquema representativo do desenho experimental utilizado para análise de
proliferação e diferenciação de linfócitos T após cultura com DCs. Os resultados mostram que a proliferação de linfócitos T, tanto naïve quanto encefalitogênicos, diminui quando as células foram cultivadas na presença de mDC+CQ. A inibição da via mTOR bloqueou, ainda que parcialmente, o efeito da CQ sobre a proliferação dos linfócitos T encefalitogênicos. (B)Histogramas representativos de três experimentos independentes. (C)Resultados expressos como média ± erro padrão de, pelo menos, três experimentos diferentes. (*p<0,05, **p<0,01, ****p<0,0001).
Os resultados obtidos mostraram que o tratamento de DCs maduras com cloroquina (mDCs+CQ) inibiu, de forma significante, a proliferação dos linfócitos T, tanto naïve quanto encefalitogênicos. Surpreendentemente, este efeito foi parcialmente abolido, quando o inibidor da mTOR, rapamicina, foi adicionado à cultura (mDCs+CQ+RAPA), apenas nas culturas de linfócitos T ativados ou encefalitogênicos (Figura 10B e 10C).
Uma vez que DCs com perfil tolerogênico são conhecidas por sua capacidade de estimular a produção da citocina anti-inflamatória IL-10 e de inibir a secreção das citocinas inflamatórias IFN-γ e IL-17 pelos diferentes subtipos de linfócitos TCD4+, os experimentos
subsequentes foram realizados com o objetivo de avaliar o tipo de diferenciação destas células após contato com DCs com base no perfil de citocinas produzidas.
Assim, após a cultura de DCs e linfócitos T, conforme esquematizado na Figura 10A, o sobrenadante foi recolhido, para dosagens de citocinas secretadas, e as células T, coletadas e estimuladas com PMA, Ionomicina e Brefeldina A, por 4h a 37ºC. Este tratamento permite a tradução de transcritos de mRNA de citocinas pré-formados sem o efeito de expressão de novo. A análise de citocinas das IFN- γ, IL-10 e IL-17 presentes no citoplasma das subpopulações diferenciadas de linfócitos TCD4+ foi analisada por citometria de fluxo.
Os resultados obtidos mostraram que DCs maduras tratadas com cloroquina (mDC+CQ) induziram a diferenciação de uma porcentagem reduzida de linfócitos T positivos para a citocina IFN-γ (Figura 11A e 11B) e para a interleucina IL-17 (Figura 12A e 12B). O tratamento das DCs maduras com cloroquina e rapamicina (mDC+CQ+RAPA), reverteu em parte este efeito, uma vez que a porcentagem de linfócitos T produtores destas citocinas inflamatórias aumentou de forma parcialmente significante. Este efeito bloqueador foi observado nas duas populações de células T, naïve e encefalitogênicos, indicando a participação da via mTOR na modulação das células dendríticas pela cloroquina.
Figura 11. Análise da produção de IFN-γ por linfócitos T naïve CD4+ e encefalitogênicos CD4+ em cocultura
com Células Dendríticas (DCs). Os resultados mostram que a porcentagem de linfócitos T CD4+IFN-γ+ (subpopulação Th1) diminui quando cultivados com mDCs+CQ. A inibição da via mTOR bloqueou o efeito modulador da CQ, indicando o envolvimento desta via de sinalização na diferenciação dos linfócitos T. (A) ‘Dot Plots’ representativos de três experimentos independentes. (B) Resultados expressos como média ± erro padrão de, pelo menos, três experimentos diferentes. (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
Figura 12.Análise da produção de IL-17 por linfócitos T naïve CD4+ e encefalitogênicos CD4+ em cocultura
com Células Dendríticas (DCs). Os resultados mostram que a porcentagem de linfócitos T CD4+IL17+ (subpopulação Th17) diminui quando cultivados com mDCs+CQ. A inibição da via mTOR bloqueou o efeito modulador da CQ, indicando o envolvimento desta via de sinalização na diferenciação dos linfócitos T. (A) ‘Dot Plots’ representativos de três experimentos independentes. (B) Resultados expressos como média ± erro padrão de, pelo menos, três experimentos diferentes. (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
Os resultados obtidos com este experimento também mostraram que DCs maduras tratadas com cloroquina (mDC+CQ) induziram a diferenciação de uma porcentagem de linfócitos T positivos para IL-10 (Figura 13), indicando aumento do número de linfócitos T com perfil anti-inflamatório.
O tratamento das DCs maduras com cloroquina e rapamicina, o inibidor da via mTOR, (mDC+CQ+RAPA), reverteu este efeito, uma vez que a porcentagem de linfócitos T produtores desta citocina anti-inflamatórias diminuiu de forma significante. Este efeito bloqueador foi observado nas duas populações de células T, naïve e encefalitogênicos.
Figura 13. Análise da produção de IL-10 por linfócitos T naïve CD4+ e encefalitogênicos CD4+ cocultivados
com Células Dendríticas (DCs). Os resultados mostram que a porcentagem de linfócitos T CD4+IL-10+ aumentou quando as células T foram cocultivadas com mDCs+CQ. A inibição da via da mTOR bloqueou o efeito modulador da CQ, indicando a participação da via mTOR na diferenciação de linfócitos T com perfil anti-inflamatório. (A) ‘Dot Plots’ representativos de três experimentos independentes. (B) Resultados expressos como média ± erro padrão de, pelo menos, três experimentos diferentes. (**p<0,01).
Para análise do perfil de citocinas secretadas por linfócitos T em cultura com DCs, o sobrenadante foi coletado para dosagem de IFN-γ, IL-17 e IL-10 pelo método de ELISA.
Os resultados mostraram que os níveis das citocinas pró-inflamatórias IFN-γ (Figura
14) e IL-17 (Figura 15) estavam significativamente reduzidos no sobrenadante das culturas de
DCs maduras tratadas com cloroquina (mDC+CQ), quando comparados com os resultados obtidos com o sobrenadante das culturas sem tratamento com cloroquina (mDC).
Interessantemente, o sobrenadante das culturas de DCs tratadas com cloroquina e com rapamicina, o inibidor da via mTOR (mDC+CQ+RAPA), não mostrou aumento destas citocinas como o esperado. Em relação ao IFN-γ, observou-se até mesmo queda nos níveis desta citocina no sobrenadante das coculturas com linfócitos T encefalitogênicos (Figura 14). Já em relação à interleucina IL-17, os resultados mostraram queda significante no sobrenadante das culturas tanto com linfócitos T naïve quanto com linfócitos T encefalitogênicos (Figura 15).
Figura 14. Dosagem, por ELISA, de IFN-γ secretada em cocultura de linfócitos T naïve CD4+ e
encefalitogênico CD4+ com Células Dendríticas (DCs). Os resultados mostram redução na concentração de IFN- γ no sobrenadante das culturas em que linfócitos T foram cultivados com DCs maduras e cloroquina (mDC+CQ) em comparação com a cultura sem cloroquina (mDC). O sobrenadante das culturas de DCs tratadas com cloroquina e com rapamicina (mDC+CQ+RAPA), não mostrou aumento destas citocinas. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, três experimentos diferentes. (**p<0,01, ***p<0,001, ns: não significativo).
Figura 15. Dosagem, por ELISA, de IL-17 secretada em cocultura de linfócitos T naïve CD4+ e
encefalitogênico CD4+ com Células Dendríticas (DCs). Os resultados mostram redução na concentração de IL- 17 no sobrenadante das culturas em que linfócitos T foram cultivados com DCs maduras e cloroquina (mDC+CQ) em comparação com a cultura de DCs sem tratamento com cloroquina (mDC). O sobrenadante das culturas de DCs tratadas com cloroquina e com rapamicina (mDC+CQ+RAPA), não foi capaz de reverter a modulação induzida pela cloroquina. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, três experimentos diferentes. ((*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
Em relação à concentração da citocina anti-inflamatória IL-10 no sobrenadante das coculturas (Figura 16), observou-se aumento no sobrenadante obtido das culturas em que os linfócitos T, naïve e encefalitogênicos, foram cultivados com DCs maduras e cloroquina (mDC+CQ).
O tratamento das culturas de DCs com cloroquina e o inibidor da via mTOR (mDC+CQ+RAPA) não induziu alteração significante nos níveis de IL-10 secretados por linfócitos T naïve, mas induziu significante diminuição nas culturas com os linfócitos encefalitogênicos (Figura 16).
Figura 16. Dosagem, por ELISA, de IL-10 secretada em cocultura de linfócitos T naïve CD4+ e
encefalitogênico CD4+ com Células Dendríticas (DCs). Os resultados mostram aumento da concentração de IL- 10 no sobrenadante das culturas de linfócitos T cultivados com DCs tratadas com CQ (mDC+CQ). Uma significante diminuição na concentração desta citocina foi observada nas culturas de linfócitos T encefalitogênicos quando o inibidor da via mTOR foi adicionado à cultura de DCs (mDC+CQ+RAPA). Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, três experimentos diferentes. (**p<0,01, ***p<0,001, ns: não significativo).
4.3. EFEITO DA TERAPIA COM CÉLULAS DENDRÍTICAS TRATADAS