Efeito dos AGCCs sobre a morte de neutrófilos

Este primeiro experimento foi realizado com o intuito de elucidar quais os tipos de morte celular que poderiam ser desencadeados nos neutrófilos quando na presença dos ácidos graxos. Os neutrófilos elicitados, provenientes de lavado intraperitoneal, após 18 horas de inoculação de tioglicolato 4% (i.p.) foram incubados com os ácidos graxos nas seguintes concentrações: acetato 10 e 25 mM, butirato 1 e 5 mM, e permaneceram incubados pelo período de 4 horas, na ausência de bactérias. A escolha do tempo de incubação dos neutrófilos se baseia tanto em relatos da literatura, quanto em resultados obtidos em experimento piloto no qual, verificou-se que esse foi o tempo mínimo de incubação para haver um aumento significativo de neutrófilos com externalização de fosfatidilserina (analisada pela ligação a anexina V) em relação ao momento da coleta das células.

Após análise por citometria de fluxo, verificou-se que a viabilidade das células na presença de butirato nas concentrações de 1 e 5 mM foi significativamente reduzida, enquanto que as células tratadas com acetato não sofreram efeito significativo em comparação a condição controle (Figura 3).

Figura 3 – Efeito dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) sobre a viabilidade de neutrófilos. Os

neutrófilos foram tratados isoladamente com acetato nas concentrações 10 e 25 mM ou butirato 1 e 5 mM, durante 4 horas. A análise de viabilidade celular foi realizada por citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=8). Bt 1 mM e Bt 5mM = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.

Além da viabilidade das células, foi detectada e quantificada a ocorrência de apoptose, apoptose tardia e necrose utilizando os marcadores 7-AAD e anexina V-FITC. A apoptose de neutrófilos foi evidenciada na presença de butirato nas concentrações de 1 e 5 mM, com tendência a apresentar um perfil dose dependente

da concentração de butirato (Figura 4A). A apoptose tardia definida pela marcação tanto de anexina V quanto de 7-AAD foi significativamente maior nas células incubadas na presença de butirato 5 mM em comparação com o controle. A porcentagem de células em necrose foi baixa e não houve alteração quando na presença dos ácidos graxos (Figura 4C).

Figura 4 - Efeito dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) sobre a apoptose (A), apoptose tardia

(B) e necrose (C) de neutrófilos. Os neutrófilos foram tratados isoladamente com acetato nas concentrações 10 e 25 mM ou butirato 1 e 5 mM, durante 4 horas. A análise dos tipos de morte desencadeadas pelos AGCCs foi caracterizada por citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=8). Bt 1 mM e Bt 5mM (A); Bt 5 mM (B) = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.

A seguir, estão os perfis das populações celulares, frente aos tratamentos utilizados: acetato 10 e 25 mM; butirato 1 e 5 mM após incubação de 4 horas e também no tempo 0 (Figura 5). As células incubadas na presença da bactéria apresentaram perfil semelhante e por isso, não são apresentados resultados representativos dessas análises.

Figura 5 - Gráficos representativos das amostras de neutrófilos incubadas com e sem AGCCs, nos

tempos 0 e 4 horas, na ausência da bactéria Aa. Análise realizada através de citometria de fluxo. Os gráficos foram gerados pelo programa FlowJo v. X.0.7. A figura 5A é composta pela população total de células obtidas durante a análise; à partir da população de células obtidas na figura 5A, foi determinada a população de neutrófilos (células Ly6G+) (5B) e a partir dessa população determinou- se a positividade para os marcadores Anexina V FITC e 7-AAD. A porcentagem de células em apoptose (Anexina V +, quadrante superior esquerdo), apoptose tardia (Anexina e 7-AAD +, quadrante superior direito), necrose (7-AAD +, quadrante inferior direito) e viáveis (Anexina-V e 7- AAD -, quadrante inferior esquerdo), são apresentadas à partir da figura 5C, na qual a análise representa os neutrófilos obtidos no tempo 0, sem tratamento. A figura 5D representa neutrófilos incubados sem AGCCs por 4 horas, assim como as demais amostras de neutrófilos tratadas com AGCCs. Os neutrófilos foram incubados com acetato nas concentrações de 10 mM (Figura 5E) e 25 mM (Figura 5F), e com butirato 1 mM (Figura 5G) e 5 mM (Figura 5H).

4.1.2 Viabilidade de neutrófilos FFAR2-/- tratados com ácidos graxos de cadeia curta

As células provenientes do sistema imune são alvos importantes dos ácidos graxos de cadeia curta, os quais atuam sobre elas através de diferentes

Anexina + 7-AAD + Anexina + 7-AAD + Anexina – 7-AAD - A B C D E F G H

mecanismos, como os receptores acoplados à proteína G, como por exemplo, FFAR2, FFAR3, GPR109A e Olfr78. (CORRÊA, R.O. et al, 2016). Diante deste fato, avaliou-se a capacidade dos ácidos graxos acetato (25 mM) e butirato (1 e 5 mM) em alterar a viabilidade de neutrófilos provenientes de animais que não possuíam o receptor FFAR2, principal receptor de AGCCs expresso nesse tipo celular. As células também foram incubadas por 4 horas com os ácidos graxos, utilizados de modo isolado. Após análise por citometria de fluxo, constatou-se que na ausência do receptor, os neutrófilos incubados com butirato 5 mM apresentaram redução da viabilidade celular (Figura 6).

Figura 6 – Efeito dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) sobre a viabilidade de neutrófilos

FFAR2-/-.Os neutrófilos foram tratados isoladamente com acetato na concentração 25 mM ou butirato

1 e 5 mM, durante 4 horas. A análise de viabilidade celular foi realizada por citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=8). Bt 5mM = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.

Conforme apresentado na figura 7, observou-se efeito apoptótico do butirato em células que não expressam o receptor FFAR2. Na maior concentração utilizada de butirato houve aumento da taxa de apoptose, que se mostrou significativo frente às análises estatísticas utilizadas. Não houve alteração significativa nessas células quanto a apoptose tardia e necrose (Figura 7B e 7C). Nesses experimentos, vale ressaltar que o butirato apesar de ter induzido apoptose nos neutrófilos que não expressam FFAR2, o seu efeito foi menos evidente do que o observado em neutrófilos de animais WT, uma vez que somente na maior concentração apresentou essa ação. Além disso, mesmo considerando essa condição a porcentagem de células apoptóticas foi inferior ao observado em células portadoras do receptor FFAR2 (Figura 7D).

Figura 7 – Efeito dos AGCCs sobre a apoptose (A), apoptose tardia (B) e necrose (C) de neutrófilos

FFAR2-/-, comparação das taxas de apoptose entre neutrófilos WT e KO quando tratados com butirato

5 mM (D). Os neutrófilos foram tratados isoladamente com acetato na concentração 25 mM ou butirato 1 e 5 mM, durante 4 horas. A análise dos tipos de morte desencadeadas pelos AGCCs foi caracterizada por citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=8). Bt 5mM (A)= p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.