Envolvimento de caspases no processo de morte de neutrófilos por AGCCs

A importante participação das caspases na apoptose foi descoberta no nematoide Caenorhabditis elegans, 24 anos atrás. (YUAN et al, 1993). Desde então, evidências têm demonstrado que os mecanismos de apoptose são evolutivamente conservados e executados por estas caspases (ALNEMRI et al, 1996). Embora a primeira caspase descoberta em mamíferos, a caspase-1 ou enzima conversora de interlecina-1β (ICE), tenha sido identificada como um importante regulador da resposta inflamatória, ao menos 8 das 14 caspases existentes têm importante papel na ocorrência da apoptose (BUDIHARDJO et al, 1999; EARNSHAW et al, 1999; FESIK & SHI, 2001; SALVESEN & DIXIT, 1997; THORNBERRY & LAZEBINIK, 1998). Considerando o exposto, avaliamos a participação das caspases nos efeitos dos AGCCs ora observados em neutrófilos.

4.5.1 Análise de apoptose em células tratadas com pan-inibidor de caspases

Inicialmente, avaliou-se a possível dependência de caspases na ocorrência da apoptose em neutrófilos tratados com AGCCs. Para isso, foi utilizado o pan-inibidor de caspases QVDOPh. Uma vez que a indução de apoptose por butirato ocorreu tanto na presença quanto na ausência de bactérias, optamos neste experimento por utilizar neutrófilos incubados por 4 horas com AGCCs na ausência da bactéria Aa.

Conforme apresentado na figura 15, neutrófilos tratados com butirato apresentaram maior externalização de fosfatidilserina (aumento de 82% no caso das células tratadas com butirato 5 mM) em comparação a condição controle (Figura

15A). Contudo, não houve diferença entre os tratamentos quando da incubação dos neutrófilos com o inibidor de caspases (Figura 15B). Este resultado sugere que o efeito do butirato depende de ativação de caspases.

Figura 15 – Análise quantitativa da ocorrência de apoptose de neutrófilos, na ausência ou presença

de pan-inibidor de caspases, incubados por 4 horas com e sem butirato, na ausência de Aa,. Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com butirato nas concentrações 1 e 5 mM, além da adição (B) ou não (A) de 10uM de pan-inibidor de caspases (QVDOPh) . Os resultados foram obtidos por meio de citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 2 experimentos independentes (n=2). p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.

4.5.2 Análise de ativação das caspases 1, 8 e 9 em neutrófilos

Este experimento teve como objetivo quantificar a ativação de caspases 1, 8 e 9 em neutrófilos, após incubação com AGCCs. As análises (ativação de caspase 8 e 9) foram realizadas utilizando neutrófilos elicitados, provenientes do peritônio de animais que expressam ou não o receptor FFAR2. A análise de atividade de caspases foi realizada por citometria de fluxo e com o uso de substratos específicos para cada caspase analisada. Os resultados obtidos (média de fluorescência das amostras) foram normalizados pelos valores do controle (células incubadas sem tratamento), o qual foi considerado como 100%.

Para a caspase-1, os neutrófilos elicitados provenientes de animais FFAR2+/+ foram analisados com ou sem estimulação com LPS. Nas duas condições não houve diferença estatística quanto à ativação de caspase-1 entre neutrófilos tratados com AGCCs quando comparados ao controle contendo apenas neutrófilos cultivados em meio (Figura 16).

Figura 16 – Análise da ativação de caspase-1 em neutrófilos incubados por 4 horas com e sem

AGCCs, sem estímulo (A) e com LPS 1.25µg/mL. (B). Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com acetato 25 mM ou butirato 5 mM ou sem tratamento. A cultura foi mantida sem ou com estímulo por LPS, também por 4 horas. Após esse período foi adicionado FAM-FLICA específico para caspase-1, o qual se liga à caspase ativa desencadeando fluorescência, quantificada por meio de citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência na figura A, enquanto na figura B o LPS foi o parâmetro. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 2 experimentos independentes (n=4). p<0,05 diferença significativa por Kruskal-Wallis, seguido por teste de Dunnett.

Figura 17 – Gráficos representativos das taxas de ocorrência de caspase-1 ativa em neutrófilos

incubados com ou sem AGCCs, no tempo de 4 horas, estimulados ou não com LPS. Análise realizada por citometria de fluxo. Os gráficos foram gerados pelo programa FlowJo v.X.0.7.

Com relação à caspase-8, verificou-se aumento significativo da fluorescência em neutrófilos tratados com butirato 5 mM, enquanto que nos neutrófilos tratados com acetato na concentração de 25 mM não houve diferença estatística (Figura 18). O mesmo padrão de resposta foi observado para caspase-9 (Figura 20).

Figura 18 – Análise da ativação de caspase-8 em neutrófilos incubados por 4 horas com e sem

AGCCs, Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com acetato 25 mM ou butirato 5 mM. Após esse período foi adicionado FAM-FLICA específico para caspase-8, o qual se liga à caspase ativa desencadeando fluorescência, quantificada por meio de citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=6). Bt 5 mM = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Dunnett.

Figura 19 – Gráficos representativos das taxas de ocorrência de caspase-8 ativa em neutrófilos

incubados com ou sem AGCCs, no tempo de 4 horas. Análise realizada por citometria de fluxo. Os gráficos foram gerados pelo programa FlowJo v.X.0.7.

Figura 20 – Análise da ativação de caspase-9 em neutrófilos incubados por 4 horas com e sem

AGCCs. Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com acetato 25 mM ou butirato 5 mM. Após esse período foi adicionado FAM-FLICA específico para caspase-9, o qual se liga à caspase ativa desencadeando fluorescência, quantificada por meio de citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=6). Bt 5 mM = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Dunnett.

Figura 21 – Gráficos representativos das taxas de ocorrência de caspase-9 ativa em neutrófilos

incubados com ou sem AGCCs, no tempo de 4 horas. Análise realizada por citometria de fluxo. Os gráficos foram gerados pelo programa FlowJo v.X.0.7.

4.5.3 Análise da ativação das caspases 8 e 9 em neutrófilos FFAR2-/-

Considerando os resultados obtidos anteriormente, analisamos também a ativação de caspase 8 e 9 em neutrófilos FFAR2-/-. Nesses experimentos verificou-se aumento significativo da média de fluorescência para caspase 8 quando realizado tratamento dos neutrófilos FFAR2-/- com butirato 5 mM (Figura 22), comportamento semelhante ao observado em neutrófilos que expressam esse receptor. Assim, constatou-se que tanto na presença quanto na ausência do

receptor, o butirato na concentração de 5 mM foi capaz de ativar essa caspase. Ou seja, a ação do butirato para a ativação de caspase 8 não dependente do receptor.

Figura 22 – Análise da ativação de caspase-8 em neutrófilos FFAR2 -/-

incubados por 4 horas com e sem AGCCs, Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com butirato 5 mM. Após esse período foi adicionado FAM-FLICA específico para caspase-8, o qual se liga à caspase ativa desencadeando fluorescência, quantificada por meio de citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=6). Bt 5 mM = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Dunnett.

Esta mesma análise foi realizada para caspase-9. Porém, diferentemente do observado em neutrófilos FFAR2+/+, o butirato na concentração de 5 mM não foi capaz de ativar a caspase-9, na ausência do receptor (Figura 23). Deste modo, ao contrário da ativação da caspase-8, a ativação da caspase-9, pelo butirato 5 mM, demonstrou ser dependente do receptor FFAR2.

Figura 23 – Análise da ativação de caspase-9 em neutrófilos FFAR2 -/- incubados por 4 horas com e

sem AGCCs. Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com butirato 5 mM. Após esse período foi adicionado FAM-FLICA específico para caspase-9 o qual se liga à caspase ativa desencadeando fluorescência, quantificada por meio de citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=6). p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Dunnett.