Efeito da pré-incubação de neutrófilos com AGCCs e inibidor de caspases sobre a produção

Com os experimentos descritos acima, constatou-se que a co-cultura de macrófagos com neutrófilos resulta em modulação da produção de citocinas pelos mesmos e que o sobrenadante de neutrófilos previamente incubados com AGCCs não interferiu com a resposta dos macrófagos. Deste modo, passou-se a avaliar se o efeito dos AGCCs sobre a produção de citocinas seria dependente da sua ação via ativação de caspases em neutrófilos. Para isso, utilizou-se novamente o pan-inibidor de caspases QVDOPh, o qual foi adicionado e mantido na cultura dos neutrófilos, por 4 horas, juntamente com os AGCCs. Após adição dos neutrófilos à cultura de BMDMs por 1 hora, foi feita a retirada dos neutrófilos não eferocitados e estimulação com a bactéria Aa ou LPS e posteriormente a análise de citocinas no sobrenandante.

Nestes experimentos verificou-se que a incubação do neutrófilos com o inibidor de caspases não alterou o efeito dos mesmos sobre a produção das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 por macrófagos (Figura 32). Em todas as condições, independente do tratamento com o inibidor de caspases, houve aumento da produção de citocinas pelos macrófagos em resposta a estimulação. O pré- tratamento com butirato e, em menor grau, com acetato reduziu a produção de TNF-α pelos macrófagos, efeito esse que não foi modificado pelo inibidor.

Figura 32 – Produção de citocinas por macrófagos, mantidos em conjunto com neutrófilos pelo tempo

de 1 hora, com posterior estimulação utilizando a bactéria Aa e pan-inibidor de caspases. Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com acetato na concentração 25 mM ou butirato 5 mM, além do uso de 10 uM do pan-inibidor de caspases QVDOPh (colunas hachuradas). Após esse período, foram adicionados à cultura de macrófagos, onde permaneceram em contato por 1 hora. Foi feita a retirada das células não internalizadas por meio de lavagens e adicionada Aa (1 neutrófilo para 10 bactérias). Após 24 horas, foi coletado o sobrenadante das culturas que posteriormente foi quantificado pela técnica de ELISA com uso de espectrofotômetro. A linha tracejada é uma referência aos valores obtidos da cultura de macrófagos estimulados com Aa, sem inserção dos neutrófilos, o qual foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=5-7). p<0,05 diferença significativa por Kruskal-Wallis, seguido por teste de Mann-Whitney.

4.8.2 Efeito da pré-incubação de neutrófilos com indutor de apoptose (roscovitina) e inibidor de HDACs (SAHA) sobre produção de citocinas por macrófagos

Com o intuito de verificar se o fato de induzir apoptose nos neutrófilos seria suficiente para alterar o perfil de produção de citocinas por macrófagos, conforme observado com o butirato, repetimos os experimentos de co-cultura utilizando neutrófilos previamente tratados com r-roscovitina (concentração final de 20 µM). A roscotivitina é um potente e seletivo inibidor de ciclinas dependentes de quinases e induz in vitro a apoptose em neutrófilos (ROSSI, A.G. et al, 2006).

Conforme apresentado na figura 33A, a roscovitina na concentração utilizada, desencadeou a apoptose de neutrófilos em taxas semelhantes às observadas com butirato. Já em células obtidas de animais que não expressam o receptor FFAR2, a taxa de apoptose do butirato foi de 18%, enquanto que a da r- roscovitina foi de 28% (Figura 33B). Esses resultados indicam que a proteção parcial contra a apoptose induzida pelo butirato em neutrófilos FFAR2-/- é um efeito específico e não geral contra qualquer agente pró-apoptótico.

Figura 33 – Efeito do butirato 5 mM e da r-roscovitina 20 uM sobre a apoptose de neutrófilos

FFAR2+/+ (Figura A) e FFAR2-/- (Figura B), após 4 horas de incubação. Os neutrófilos foram incubados

por 4 horas com butirato 5 mM, Roscovitina 20 uM ou DMSO (diluente da Roscovitina). Após esse período, as células foram retiradas da placa e marcadas com anti-Ly6G- APC e Anexina-V FITC. A análise de viabilidade celular foi realizada através de citometria de fluxo, sendo o controle utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=3). Bt 5 mM e Rosco 20 uM (Fig. A e B) = p<0,05 diferença significativa por Kruskal-Wallis, seguido por teste de Mann-Whitney.

A seguir repetimos os experimentos de co-cultura com neutrófilos pré- tratados com butirato ou roscovitina. Os neutrófilos tratados com butirato 5 mM reduziram a produção de TNF-α pelos macrófagos (Figura 34A). Enquanto que as produções de IL-1β e IL-10 não foram diferentes (Figuras 34B e 34C, respectivamente). Esses resultados foram similares aos observados nos

experimentos anteriores. Já no caso dos neutrófilos incubados com r-roscovitina, os quais apresentaram taxas de apoptose semelhantes às desencadeadas pelo butirato (Figura 33A), não se observou alteração da produção de citocinas pelos macrófagos. Ou seja, mesmo a r-roscovitina sendo um indutor de apoptose em neutrófilos, a modulação da produção de TNF-α nos macrófagos não foi modificada. Esse resultado indica que o efeito do butirato depende de outros fatores que não apenas a apoptose e as vias de sinalização por ela desencadeadas.

Figura 34 – Comparação entre o efeito da indução de apoptose desencadeada pelo butirato 5 mM e

pela roscovitina 20 uM em neutrófilos FFAR2+/+ e a capacidade destes em modular a produção de

citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-10) nos macrófagos. Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com butirato 5 mM ou roscovitina 20 uM. Após esse período, foram adicionados à cultura de macrófagos, onde permaneceram em contato por 1 hora. Foi feita a retirada das células não internalizadas por meio de lavagens e adicionado LPS (1.25 ug/mL). Após 24 horas, foi coletado o sobrenadante das culturas que posteriormente foi quantificado pela técnica de ELISA com uso de espectrofotômetro. A linha tracejada é uma referência aos valores obtidos da cultura de macrófagos estimulados com LPS, sem inserção dos neutrófilos. Como referência utilizamos a condição MØs+NØs para avaliarmos a ação da apoptose sobre a produção de citocinas. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=3). MØs+NØs+Bt 5 mM (Fig. A) = p<0,05 diferença significativa por Kruskal-Wallis, seguido por teste de Mann-Whitney.

Experimentos utilizando LPS, como estimulante para a produção de citocinas por parte dos macrófagos, também foram realizados com neutrófilos FFAR2-/-. Conforme previamente observado, neutrófilos provenientes de animais nocautes para FFAR2 tratados com butirato 5 mM reduziram a produção de TNF-α

proveniente pelos macrófagos (Figura 35A). Este resultado foi similar ao obtido na presença do receptor, o que indica que o mesmo não é relevante para esse efeito. Uma vez mais neutrófilos incubados com roscovitina não alteraram a produção das citocinas derivadas dos macrófagos (Figura 35B). Em conjunto estes dados indicam que o efeito do butirato sobre a produção de TNF-α por macrófagos independe da sua capacidade de induzir apoptose em neutrófilos.

Figura 35 – Comparação entre o efeito da indução de apoptose desencadeada pelo butirato 5 mM e

pela roscovitina 20 uM em neutrófilos FFAR2-/- e a capacidade destes em modular a produção de

citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-10) nos macrófagos. Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com butirato 5 mM ou roscovitina 20 uM. Após esse período, foram adicionados à cultura de macrófagos, onde permaneceram em contato por 1 hora. Foi feita a retirada das células não internalizadas por meio de lavagens e adicionado LPS (1.25 ug/mL). Após 24 horas, foi coletado o sobrenadante das culturas que posteriormente foi quantificado pela técnica de ELISA com uso de espectrofotômetro. A linha tracejada é uma referência aos valores obtidos da cultura de macrófagos estimulados com LPS, sem inserção dos neutrófilos. Como referência utilizamos a condição MØs+NØs para avaliarmos a ação da apoptose sobre a produção de citocinas. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=3). MØs+NØs+Bt 5 mM (Fig. A) = p<0,05 diferença significativa por Kruskal-Wallis, seguido por teste de Mann-Whitney.

A seguir repetimos os experimentos de co-cultura com neutrófilos previamente tratados com o composto SAHA (Vorinostat) (concentração final de 10 µM). Vale ressaltar que esse composto é um potente inibidor de histonas deacetilases (HDACs) (classe I e classe II), efeito também desencadeado pelo butirato e também induz apoptose em neutrófilos (resultados não mostrados). Neste

caso, os macrófagos previamente incubados com neutrófilos foram estimulados com Aa. Após quantificação das citocinas produzidas pelos macrófagos, verificou-se que neutrófilos tratados com butirato (5 mM) ou SAHA (10 µM) reduziram a produção da TNF-α pelos macrófagos (Figura 36A). Para IL-1β, houve aumento da produção em neutrófilos tratados com SAHA (Figura 36B), mesmo perfil encontrado na quantificação de IL-10 (Figura 36C). Estes resultados demonstraram que a inibição das histonas deacetilases nos neutrófilos, pode interferir na modulação destas células frente à produção de citocinas por parte dos macrófagos em casos de eferocitose.

Figura 36 – Comparação entre o efeito da inibição de HDACs desencadeada pelo butirato 5 mM e

pelo SAHA 10 uM em neutrófilos FFAR2+/+ e a capacidade destes em modular a produção de

citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-10) nos macrófagos. Os neutrófilos foram incubados por 4 horas com butirato 5 mM ou SAHA 10 uM. Após esse período, foram adicionados à cultura de macrófagos, onde permaneceram em contato por 1 hora. Foi feita a retirada das células não internalizadas por meio de lavagens e adicionada Aa (concentração 1 neutrófilo para 10 bactérias). Após 24 horas, foi coletado o sobrenadante das culturas que posteriormente foi quantificado pela técnica de ELISA com uso de espectrofotômetro. A linha tracejada é uma referência aos valores obtidos da cultura de macrófagos estimulados com Aa, sem inserção dos neutrófilos. Como referência utilizamos a condição MØs+NØs. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=3). MØs+NØs+Bt 5 mM (Fig. A) = p<0,05 diferença significativa por Kruskal-Wallis, seguido por teste de Mann-Whitney.

4.9 Efeito da pré-incubação de neutrófilos com AGCCs sobre a