INSTITUTO DE BIOLOGIA
ÉRICA MORAES SERNAGLIA
PAPEL DOS AGCCs E RECEPTOR FFAR2 NA MORTE DE
NEUTRÓFILOS INDUZIDA POR AGGREGATIBACTER
ACTINOMYCETEMCOMITANS
CAMPINAS
2017
ÉRICA MORAES SERNAGLIA
PAPEL DOS AGCCs E RECEPTOR FFAR2 NA MORTE
DE NEUTRÓFILOS INDUZIDA POR
AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na Área de Imunologia
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Ramirez Vinolo
CAMPINAS
2017
O arquivo digital corresponde àversão final da tese/dissertação defendida pelo aluno Érica Moraes Sernaglia e orientada pelo Prof. Dr Marco Aurélio Ramirez Vinolo.
Campinas, 06 de setembro de 2017
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marco Aurélio Ramirez Vinolo Profa. Dra. Ana Paula Duarte de Souza Prof. Dr. Marcelo Bispo de Jesus
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Inicialmente gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Marco Aurélio Ramirez Vinolo por ter aberto as portas de seu laboratório, em Janeiro de 2014, para que eu pudesse conhecer mais de perto o universo da pesquisa científica existente nas grandes universidades brasileiras. Além da oportunidade, agradeço também a dedicação, orientação, comprometimento e principalmente a paciência demonstrados no decorrer de todo esse período. E a seus alunos pelo auxílio e contribuição.
À Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP por ceder o espaço, a infraestrutura e por permitir a execução do projeto, bem como ao Programa de Pós Graduação do Instituto de Biologia, especificamente ao Programa de Genética e Biologia Molecular.
Em especial à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São de Paulo – FAPESP por ter acreditado em nossa capacidade em executar o projeto, por tê-lo financiado e consequentemente colaborado para a existência desta dissertação (Processo FAPESP 2014/22909-3).
Agradeço imensamente aos meus familiares e amigos pela acolhida, compreensão diante das ausências e por acreditarem neste objetivo desde o início.
Com imenso carinho agradeço à banca de qualificação, composta pela Profa. Dra. Liana
Verinaud (UNICAMP), Profa. Dra. Alexandra Ivo de Medeiros (UNESP) e Dra. Juliete Aparecida
Francisco (UNICAMP), pelas ideias, correções e dedicação demonstradas e aos suplentes por se colocarem à disposição, caso fosse necessário. Assim como agradeço à banca de defesa, composta
pela Profa. Dra. Ana Paula Duarte de Souza (PUC-RS) e Prof. Dr. Marcelo Bispo de Jesus
(UNICAMP) pelo aceite, contribuição e disponibilidade. E também aos suplentes Profa. Dra. Tarcília
Aparecida da Silva (UFMG) e Prof. Dr. José Luiz Proença Módena (UNICAMP) pela disponibilidade. Agradeço também aos professores Dr. Alessandro dos Santos Farias e Dra. Leonilda Maria Barbosa da Silva por permitirem o uso de diversos equipamentos como o citômetro Beckman Coulter, fundamental para as análises realizadas. Aos seus alunos Dr. Fernando Pradella, Ms. Vinícius Boldrini, Ms. Adriel dos Santos Moraes, Ms. Guilherme Morais, Ms. Gleidy Silva, Camila Vaz, João Paulo Guarnieri pelo auxílio na execução de técnicas e empréstimo de materiais.
À professora Dra. Liana Verinaud por ceder equipamentos e reagentes, e também às suas alunas Amanda Pires Bonfanti, Ms. Gabriela Peron e Lívia de Lima Thomaz pela colaboração.
Ao professor Dr. Marcelo Bispo de Jesus pelo suporte em diversas técnicas experimentais e também pelo empréstimo de materiais, assim como a seus alunos sempre muito solícitos Ms. Alan Radaic e Ms. Luiz Bandeira.
Ao professor Dr. Marcelo Lancellotti pelo suporte técnico para cultivo e manutenção da bactéria, parte fundamental a integrar o projeto.
Ao empréstimo salvador de 7-AAD providenciado por Dra. Ana Leda Longhini e Irene Santos. Além da ajuda e suporte técnico admiráveis na realização de separação celular via Cell
Aos amigos e parceiros de trabalho Ms. Aline Vieira, Ms. Renan Oliveira Corrêa, Pâmela Maximiano e Andressa Smaniotto pelo auxílio diário e por terem garantido, ao longo de todo esse tempo, suporte técnico e psicológico incríveis.
À Pontifícia Universidade Católica de Campinas por contribuir imensamente em minha formação profissional e pessoal. Em especial às professoras Dra. Márcia Regina de Souza Cossa Wenning e Ms. Michelle Carneiro Polli Parise pelos conselhos e incentivo; à professora Dra. Sílvia de Oliveira Santos Cazenave pela orientação e colaboração na construção do trabalho de conclusão de curso. À farmacêutica do Hemocentro e orientadora de estágio Hélia Aparecida de Sousa pela orientação, auxílio, atenção e aprendizado.
Ao aluno de iniciação científica e futuro biólogo Breno Pazzinatto pela dedicação e contribuição na execução dos experimentos de eferocitose.
Ao bioterista Marcos César Meneghetti por me auxiliar na criação e manutenção da
linhagem dos animais FFAR2-/-.
E não menos importante, agradeço a você, caro leitor, por dedicar seu tempo à leitura desta dissertação. Espero que ela contribua de alguma forma para a busca que está realizando.
“(…) The North is to South what the clock is to time There's east and there's west and there's everywhere life I know I was born and I know that I'll die The in between is mine I am mine (...)” (Pearl Jam – I am mine)
RESUMO
Os neutrófilos são as primeiras células a migrarem durante o processo inflamatório, atuando na internalização e killing de micro-organismos invasores. Neutrófilos possuem meia vida curta e, uma vez em apoptose, são engolfados e removidos dos tecidos por macrófagos pelo processo denominado eferocitose. Ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) são produtos do metabolismo bacteriano, os quais modulam a migração, ativação e função efetora de neutrófilos. Contudo, pouco é conhecido a respeito do seu efeito sobre a morte dessas células. Neste trabalho foram analisadas as vias envolvidas na ação dos AGCCs sobre a morte de neutrófilos e a implicação desse efeito no processo de eferocitose e no perfil de resposta frente a bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), bactéria esta que está associada à periodontite, condição inflamatória crônica dos tecidos de suporte dos dentes na qual há aumento da concentração local de AGCCs. Foram realizados experimentos com neutrófilos isolados de camundongos incubados com Aa e AGCCs (acetato e butirato) in vitro. Butirato induziu apoptose, mas não necrose de neutrófilos. Esse efeito foi observado na presença e na ausência da bactéria Aa e envolveu, em parte, a ativação do receptor FFAR2. Já o acetato, nas concentrações e tempos testados, não apresentou efeito sobre a viabilidade/morte de neutrófilos. Posteriormente, verificou-se que o butirato aumentou a atividade das caspases 8 e 9 e que seu efeito pró-apoptótico foi bloqueado na presença de inibidor de caspases. Utilizando neutrófilos FFAR2-/- a ativação de caspase 8 foi mantida. Os efeitos modulatórios do butirato sobre a produção de citocinas foram mantidos mesmo na presença do inibidor de caspases, indicando que são independentes da ação desses AGCCs sobre a apoptose de neutrófilos. Ao avaliar a eferocitose de neutrófilos pré-tratados com AGCCs por macrófagos in vivo e in vitro não foi observada alteração significativa. Contudo, a produção de citocinas pelos macrófagos após eferocitose foi distinta (menor produção de TNF-α). A adição de neutrófilos não modificou a capacidade fagocítica dos macrófagos frente à bactéria Aa. No modelo de infecção
in vivo, observou-se maior número de bactérias nas câmaras subcutâneas em que
foram inoculados neutrófilos FFAR2+/+ tratados com butirato, além de redução da concentração de TNF-α e aumento na produção de CXCL-1. Com uso de neutrófilos de animais FFAR2-/- previamente incubados com butirato, o número de bactérias viáveis foi semelhante entre as condições. Porém o efeito sobre a produção de
TNF-α (redução) nas câmaras foi mantido. Os resultados ora apresentados sugerem que o AGCC butirato induz apoptose de neutrófilos, efeito esse que reduz a atividade microbicida in vivo. No entanto, outros efeitos, tanto em neutrófilos quanto macrófagos (in vitro e in vivo), incluindo sua ação sobre a produção de mediadores inflamatórios, são independentes da ação pró-apoptótica do butirato sobre os neutrófilos. Com isso, concluímos que o AGCC butirato altera a viabilidade de neutrófilos e com isso modifica a resposta inicial a bactérias como a Aa, efeito esse que pode ser relevante para o desenvolvimento da periodontite.
ABSTRACT
Neutrophils are the first cells to migrate during the inflammatory process, acting on the internalization and killing of invading microorganisms. They present a short half-life and once in apoptosis, they are engulfed and removed from the tissues by macrophages through a process called efferocytosis. Short chain fatty acids (SCFAs) are products of bacterial metabolism which modulate the migration, activation and neutrophil effector function. However, little is known about their effect on the death of these cells. In this work, we have analyzed the pathways involved in the action of SCFAs on the death of neutrophils and the implication of this effect in the process of efferocytosis and in the response profile to Aggregatibacter
actinomycetemcomitans (Aa), a bacterium that is associated with periodontitis, a
chronic inflammatory condition of the tooth supporting tissues in which there is an increase in the local concentration of SCFAs. Experiments were performed with neutrophils isolated from mice incubated with Aa and SCFAs (acetate and butyrate)
in vitro. Butyrate induces apoptosis but not neutrophil necrosis. This effect was
observed in the presence and absence of the Aa bacterium and involved, in part, the activation of the receptor FFAR2. Acetate, at the concentrations and time points tested, showed no effect on the viability/death of neutrophils. Subsequently, it was verified that butyrate increased the activity of caspases 8 and 9 and that its pro-apoptotic effect was blocked in the presence of caspase inhibitor. Using FFAR2 -/-neutrophils, the activation of caspase 8 was maintained. The modulatory effects of butyrate on cytokine production were maintained even in the presence of the caspase inhibitor, indicating that they are independent of the action of these AGCCs on neutrophil apoptosis. When evaluating the neutrophil efferocytosis pre-treated with SCFAs by macrophages in vivo and in vitro, no significant change was observed. However, the production of cytokines by macrophages after efferocytosis was distinct (lower production of TNF-α). The addition of neutrophils did not modify the phagocytic capacity of the macrophages. In the model of infection in vivo, a greater number of bacteria were observed in the subcutaneous chambers in which FFAR2+/+ -neutrophils treated with butyrate were inoculated, as well as a reduction of TNF-α concentration and an increase in CXCL-1 production. When using neutrophils from FFAR2-/- animals previously incubated with butyrate, the number of viable bacteria was similar between conditions. However, the effect on the production of
TNF-α (reduction) in the chambers was maintained. The results presented here suggest that the SCFA butyrate induces neutrophil apoptosis, which reduces microbicidal activity in vivo. Other effects on both neutrophils and macrophages (in
vitro and in vivo), including their action on the production of inflammatory mediators,
are independent of the pro-apoptotic action of butyrate on neutrophils. Thus, we conclude that SCFA butyrate alters the death of neutrophils and thereby modifies the initial response to bacteria such as Aa, which may be relevant for the development of periodontitis.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...14
1.1 Inflamação, Apoptose e Resolução ... 18
2. OBJETIVOS ...21
2.1 Objetivo geral ... 21
3. MATERIAIS E MÉTODOS...22
3.1 Animais ... 22
3.2 Bactérias ... 22
3.3 Obtenção dos neutrófilos elicitados com tioglicolato... 23
3.4 Quantificação de citocinas e da atividade de lactato desidrogenase presente no sobrenadante das culturas de neutrófilos ... 24
3.5 Análise de fragmentação de DNA ... 24
3.6 Análise da atividade de caspases 1, 8 e 9... 25
3.7 Análises de co-cultura de neutrófilos com macrófagos ... 26
3.8 Fagocitose de neutrófilos em apoptose in vitro (eferocitose) ... 27
3.9 Produção de citocinas derivadas de macrófagos previamente incubados com neutrófilos tratados com AGCCs ... 28
3.10 Análise da capacidade fagocítica de macrófagos após co-culturas com neutrófilos. ... 28
3.11 Experimentos in vivo ... 29
3.12 Análise estatística ... 33
4. RESULTADOS ...34
4.1 Efeito dos AGCCs sobre a morte de neutrófilos ... 34
4.2 Análise de viabilidade celular na presença de bactéria ... 38
4.3 Quantificação da atividade de lactato desidrogenase (LDH) no sobrenandante das culturas .... 42
4.4 Análise de fragmentação de DNA ... 43
4.5 Envolvimento de caspases no processo de morte de neutrófilos por AGCCs ... 45
4.6 Efeito dos AGCCs sobre a produção de citocinas por neutrófilos ... 51
4.7 Efeito dos AGCCs sobre a fagocitose de neutrófilos (eferocitose) e resposta efetora de macrófagos incubados com neutrófilos ... 53
4.7.1 Efeito da pré-incubação de neutrófilos com AGCCs sobre a eferocitose ... 54
4.8 Efeito da pré-incubação de neutrófilos com AGCCs sobre a produção de citocinas por macrófagos... 54
4.8.1 Efeito da pré-incubação de neutrófilos com AGCCs e inibidor de caspases sobre a produção de citocinas por macrófagos ... 58
4.8.2 Efeito da pré-incubação de neutrófilos com indutor de apoptose (roscovitina) e inibidor de
HDACs (SAHA) sobre produção de citocinas por macrófagos ... 60
4.9 Efeito da pré-incubação de neutrófilos com AGCCs sobre a capacidade fagocítica de macrófagos... 64
4.10 Modelo de infecção in vivo ... 64
4.11 Eferocitose in vivo ... 69
5. DISCUSSÃO ...71
6. CONCLUSÃO ...77
7. BIBLIOGRAFIA ...78
1. INTRODUÇÃO
Bactérias, vírus e fungos são micro-organismos presentes em locais como a pele, cavidade oral e nos tratos gastrointestinal, genital e respiratório sendo conjuntamente conhecidos como microbiota. A existência da microbiota é fundamental para o funcionamento adequado de vários processos fisiológicos no organismo que incluem desenvolvimento tecidual do hospedeiro, absorção de nutrientes e metabolismo (BRESTOFF, J.R., ARTIS, D., 2013; SOMMER, F., BACKHED, F., 2013). Além disso, a interação microbiota-hospedeiro é essencial para promover o funcionamento do sistema imune. O desenvolvimento de células imunes, assim como a produção de moléculas efetoras solúveis como os anticorpos, peptídeos antimicrobianos e a função de muitos componentes de defesa do hospedeiro são modulados por ela (KAMADA, N. et al, 2013).
A perda do equilíbrio entre o sistema imune e os componentes da microbiota leva a condição de disbiose, a qual está associada ao desenvolvimento de infecções e doenças inflamatórias como a doença periodontal, vaginose bacteriana, doença intestinal inflamatória, artrite reumatoide e obesidade (SRINIVASAN, S. et al, 2012; FERREIRA, C.M. et al, 2014; TROMPETTE, A. et al, 2014). A periodontite é uma doença inflamatória crônica, responsável por desencadear a destruição dos tecidos que sustentam os dentes. Essa condição, assim como as outras descritas anteriormente, está associada a alterações no equilíbrio da microbiota oral (ROSIER, B.T. et al, 2014). Basicamente, o acúmulo de biofilme bacteriano disbiótico leva ao aumento de infiltrado inflamatório, composto principalmente por neutrófilos, no interior do tecido subgengival. A presença dessas células ativadas juntamente com a produção de mediadores inflamatórios por elas e outros tipos celulares presentes no tecido, induz a ativação de fibroblastos e osteoclastos resultando no remodelamento e destruição do tecido conjuntivo e do osso subjacente, alterações essas que são importantes durante a periodontite (HAJISHENGALLIS, E., HAJISHENGALLIS, G., 2014).
Bactérias como a Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) e a
Porphyromonas gingivalis (Pg) são consideradas patógenos periodontais e estão
claramente associadas ao processo de disbiose oral e desequilíbrio na interação entre os micro-organismos e o sistema imune, o que leva ao desenvolvimento da doença periodontal (ASSUMA, R. et al, 1998; DELIMA, A.J. et al, 2002; HOLT, S.C.
& EBERSOLE, J.L., 2005; FINE, D.H. et al, 2006). Essas bactérias são encontradas em pacientes com periodontite agressiva e crônica (MOMBELLI, A. et al, 1994), sendo que a presença de Aa está mais associada a periodontite agressiva (SCHACHER, B. et al, 2007), enquanto a Pg está mais associada com a periodontite crônica (LÓPEZ, N.J., 2000)
A bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans é um cocobacilo, gram-negativo, capaz de proliferar na presença de baixas concentrações de O2.
Comumente é isolada da cavidade oral de indivíduos portadores de doença periodontal em estágio agressivo (NEWMAN, M.G. et al, 1976; SLOTS, J., 1976; SLOTS, J. et al, 1980). Além disso, também está envolvida em infecções não orais como: endocardite (NAKANO, K. et al, 2007), artrite bacteriana (CUENDE, E. et al, 1996), septicemia associada a gravidez (SHALINI, S. et al, 1995), abscesso cerebral (ZIJILSTRA, E.E. et al, 1992; STEPANOVIC, S. et al, 2005) e osteomielite (ANTONY, B. et al, 2009).
Esta bactéria apresenta uma variedade de fatores com potencial de virulência. A Toxina distensora Citoletal (CdT) é um deles e é composta por 3 subunidades: CdTA, CdTB e CdTC (MAYER, M.P. et al, 1999). Após a translocação da subunidade B em direção ao núcleo, ocorre dano no DNA e consequente alteração do ciclo celular, além do desencadeamento de apoptose em alguns tipos celulares (LARA-TEJERO, M., GALAN, J.E., 2001; HASSANE, D.C., LEE, R.B., PICKETT, C.L., 2003; MCSWEENEY, L.A., DREYFUS, L.A., 2005; DAMEK-POPRAWA, M. et al, 2012; GUIDI, R. et al, 2012;). Outro fator de virulência é a leucotoxina, que apresenta efeito tóxico sobre neutrófilos. Ela é encontrada principalmente nas cepas do sorotipo b, que inclui a cepa JP2, com alta expressão dessa toxina devido a mutação por deleção do par de base 530 na região promotora (BROGAN, J.M. et al, 1994; PERMPANICH, P., KOWOLIK, M.J., GALLI, D.M., 2006).
Além de alterações na resposta imune e estruturais locais destacadas acima, a disbiose desencadeada por bactérias periodontopatogênicas culmina na alteração da produção local de importantes moléculas que atuam como elo entre a microbiota e as células do hospedeiro, os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) (CORRÊA, R.O. et al, 2016). Estes compostos são ácidos carboxílicos constituídos por menos de seis carbonos na cadeia principal e apresentam diversas funções fisiológicas, conforme destacado a seguir.
O acetato (C2), propionato (C3) e butirato (C4) são os principais AGCCs e
são produzidos durante o metabolismo bacteriano, na fermentação de carboidratos e proteínas fornecidos pela dieta ou do hospedeiro (ANDOH, A., TSUJIKAWA, T., FUJIYAMA, Y., 2003; WONG, J.M.W., et al, 2006). Além de serem encontrados em altas concentrações no trato gastrointestinal, tem sido relatada sua presença em outros tecidos. Qiqiang et al (2012), constatou alterações importantes na produção de AGCCs durante a periodontite. Ao comparar o fluido gengival crevicular de pacientes com periodontite severa e indivíduos saudáveis, observou-se aumento da produção de ácido propiônico de 5,87 ± 3,35 mM em pacientes saudáveis para 11,68 ± 8,84 mM em pacientes com periodontite. Já as concentrações de butirato variaram de 3,11 ± 1,86 mM em quadros de periodontite a 1,10 ± 0,87 mM na ausência do quadro. Elevadas concentrações dos ácidos acético, propiônico e butírico também foram encontradas em indivíduos com periodontite agressiva: 26 vs. 11,3 mM; 8,8 vs. 2,1 mM e 2,5 vs. 0.0 mM, respectivamente (LU, R. et al, 2014).
Os ácidos graxos não são apenas fontes energéticas importantes para as células, mas também atuam como moduladores de muitas funções celulares como: proliferação, migração, apoptose, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), óxido nítrico, eicosanoides, citocinas e hormônios (RODRIGUES, H.G., et al, 2010; HANSEN, K.B., et al, 2011; KEANE, D.C., et al, 2011; TAKAHASHI, H.K., et al, 2012). Essas moléculas têm importantes ações sobre componentes do sistema imunológico incluindo células dendríticas, linfócitos T, macrófagos e, principalmente, neutrófilos, as células alvo deste estudo, conforme relatado a seguir.
A capacidade dos AGCCs de modular respostas biológicas no hospedeiro depende principalmente de dois mecanismos: a inibição direta das histonas deacetilases (HDACs) regulando a expressão gênica, função essa realizada principalmente pelo butirato e propionato; e a sinalização através dos receptores acoplados a proteína-G (GPCRs), sendo que os principais ativados por AGCCs são FFAR3 (GPR41), FFAR2 (GPR43) e GPR109A (TAN, J. et al, 2014). Nesse contexto, vale ressaltar que o receptor FFAR2 é altamente expresso em neutrófilos, sendo capaz de modular a resposta imune e inflamatória. Além de estar envolvido no efeito quimiotático dos ácidos graxos de cadeia curta em neutrófilos in vitro (MASLOWSKI, K.M., et al, 2009; SINA, C., et al, 2009; VINOLO, M.A.R., et al, 2011). Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) possuem ações anti-inflamatórias desencadeadas através da modulação da migração e recrutamento de
células imunes, liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e também de citocinas. O butirato tem diversos efeitos anti-inflamatórios incluindo a inibição de IL-12 e aumento da produção de IL-10 em monócitos humanos (SAEMANN, M.D. et al, 2000), redução da produção de moléculas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, óxido nítrico (NI, Y.F. et al, 2010) e a atividade de NF-κB. (SEGAIN, J.P. et al, 2000; NI, Y.F. et al, 2010). As reduções das atividades de NF-κB e também da produção de TNF-α pelos AGCCs foram observadas em neutrófilos estimulados com LPS (VINOLO, M.A.R. et al., 2011).
Além de modular a função de neutrófilos e outros componentes do sistema imune, sabe-se que os AGCCs também podem modificar a sobrevivência ou morte dessas células. Nesse sentido, constatou-se que o butirato, assim como o propionato, pode induzir apoptose em neutrófilos não estimulados e também em neutrófilos estimulados com LPS ou TNF-α, através das vias de caspase-8 e caspase-9 (AOYAMA, M., KOTANI, J., USAMI, M., 2010). Este trabalho mostrou que o butirato e propionato quando adicionados na concentração de 4 mM à cultura de neutrófilos isolados da corrente sanguínea de indivíduos saudáveis são capazes de desencadear apoptose nessas células (após 20 horas de cultura). Por outro lado, o acetato, nessa mesma concentração, não apresentou essa capacidade. Ao avaliarem se esse comportamento era mantido em neutrófilos ativados com LPS (1 µg/mL) ou TNF-α (0,1 µg/mL), incubados também pelo período de 20 horas, os autores desse trabalho constataram aumento da ocorrência de apoptose, tanto na presença quanto na ausência dos ativadores, em neutrófilos tratados com butirato. O propionato teve um perfil semelhante, porém menos efetivo. E o acetato novamente não induziu apoptose na concentração de 4 mM. Deste modo, eles demonstraram que o butirato e o propionato na concentração de 4 mM são capazes de induzir apoptose em neutrófilos ativados ou não com LPS ou TNF-α via ativação de caspases 8 e 9 (AOYAMA, M., KOTANI, J., USAMI, M., 2010). Assim como Aoyama
et al (2010), Maslowski et al (2009) também observaram efeito apoptótico dos
AGCCs, porém neste último caso, o efeito pró-apoptótico foi atribuído a ação do acetato via FFAR2 (os outros AGCCs não foram estudados nesse trabalho).
O efeito dos AGCCs sobre a indução de morte em neutrófilos apesar de já ter sido demonstrado, ainda não foi explorado a fundo. Vale ressaltar que a ação desses compostos sobre sobrevivência dos neutrófilos pode ter importantes consequências para o processo inflamatório, conforme descrito adiante.
1.1 Inflamação, Apoptose e Resolução
A inflamação é uma resposta fisiológica essencial para a manutenção da homeostase tecidual, cuja finalidade é proteger o hospedeiro contra micro-organismos invasores, substâncias estranhas ou distúrbios do próprio hospedeiro, como as moléculas que derivam de células danificadas. Após o estímulo inicial, vários eventos na microcirculação ocorrem, devido à liberação de diversos mediadores pró-inflamatórios que contribuem para o aumento tanto da permeabilidade vascular como no recrutamento de leucócitos (MEDZHITOV, R., 2015). Leucócitos, como macrófagos e neutrófilos, têm função importante na resposta inflamatória por liberarem mais mediadores inflamatórios, agirem como células efetoras e na remoção de estímulos ou agentes com caráter inflamatório (SILVA, M.T., CORREIA-NEVES, M., 2012).
Mesmo apresentando ação efetiva em defesa do hospedeiro, os neutrófilos podem causar dano tecidual e por isso, devem ter sua ativação e sobrevivência/morte adequadamente reguladas (HALLET, J.M. et al, 2008; HEADLAND, S.E., NORLING, L.V., 2015). Após migrar e exercer suas funções, os neutrófilos e moléculas pró-inflamatórias produzidas no local da inflamação devem ser removidos de modo eficiente, o que acontece através da ação dos fagócitos. Estes iniciam o processo de resolução por meio da inibição da produção de mediadores inflamatórios, da degradação dos já produzidos e da produção de moléculas capazes de reduzir a ativação endotelial, reduzindo assim o influxo de leucócitos, além de ativarem a apoptose em neutrófilos (GILROY, D., MAEYER, DE R., 2015). Este último evento é seguido pela remoção segura realizada pelos macrófagos, através de um processo denominado eferocitose, a fagocitose de células apoptóticas (HEADLAND, S.E., NORLING, L.V., 2015).
A eferocitose inicia-se com a indução da apoptose de uma célula alvo, a qual é caracterizada pela externalização de fosfatidilserina, fragmentação do DNA e formação de bolhas na membrana, culminando na fagocitose realizada pelas células presentes nas imediações (TAK, T. et al, 2013). Para dar início a apoptose dos neutrófilos, existem duas vias principais de sinalização: as vias intrínseca e extrínseca. A primeira é dependente da perda de integridade da membrana mitocondrial, desencadeada pelo desequilíbrio de fatores pró e anti-apoptóticos na célula, seguida da liberação do citocromo c, existente na mitocôndria, a qual facilita a montagem do apoptossomo, formado por caspase-9 e Apaf-1, que pode
desencadear a ativação da caspase-3. Já a via extrínseca, reage à sinalização extracelular através de receptores de morte que levam a ativação de caspase-3, através da caspase-8 (GEERING, B., SIMON, H.U., 2011; GABELLONI, M.L. et al, 2013).
A apoptose dos neutrófilos pode ser acelerada ou atrasada durante condições inflamatórias e infecciosas. Alguns patógenos virais e bacterianos aceleram a ativação da apoptose, enquanto outros iniciam e de modo precipitado geram lise (KOBAYASHI, S.D. et al, 2003; GREENLEE-WACKER, M.C. et al, 2014). Entretanto, o tempo de vida dos neutrófilos pode ser aumentado por outras substâncias como: fator estimulador de colônia granulocítica (G-CSF) e o de colônia macrofágica granulocítica (GM-CSF), IL-8, componentes bacterianos, proteína C reativa, amilóide sérica A, entre outros mediadores pró-inflamatórios (LEE, A., WHYTE, M.K., HASLETT, C., 1993; SIMON, H.U., 2003). Esse aumento no tempo de vida dos neutrófilos pode contribuir para a eliminação dos patógenos antes da ocorrência da apoptose. Por outro lado, alguns patógenos que aceleram a apoptose utilizam-se desta para acessarem silenciosamente o interior dos macrófagos através da eferocitose (THWAITES, G.E., GANT, V., 2011).
Os fagócitos apresentam papel importante durante a homeostase tecidual, pois migram e fagocitam rapidamente as células senescentes. Vários são os fagócitos capazes de engolfarem neutrófilos apoptóticos, entre eles os macrófagos tecido-residente, macrófagos infiltrados, células dendríticas, neutrófilos, além de fagócitos não profissionais (HART, S.P., DRANSFIELD, I., ROSSI, A.G., 2008).
Durante a apoptose dos neutrófilos, proteínas intracelulares são liberadas, incluindo Anexina-1 e calrecticulina, que se associam à membrana e atuam como ligantes para eferocitose (HOCHREITER-HUFFORD, A., RAVICHANDRAN, K.S., 2013). Os neutrófilos não apoptóticos não apresentam fosfatidilserina ou apenas transitoriamente, no folheto externo da membrana celular (GREENLEE-WACKER, M.C, 2016). Desta maneira, a ingestão de células apoptóticas está vinculada com a perda da assimetria fosfolipídica e o aparecimento da fosfatidilserina no folheto externo da membrana plasmática (FADOK, V.A. et al, 1992; FADOK, V.A. et al, 1998; FADOK, V.A. et al, 2001). Sendo a fosfatidilserina, presente na superfície de células apoptóticas, o sinal melhor caracterizado de “eat me”, o seu reconhecimento
favorece interações que conduzem ao engolfamento de células apoptóticas (FADOK, V.A. et al, 1998).
Conforme abordado anteriormente, os neutrófilos apresentam substâncias nocivas, as quais incluem enzimas proteolíticas e padrões moleculares associados a dano, que podem difundir a inflamação e causar dano tecidual ao hospedeiro. Nesse contexto, a eferocitose de neutrófilos apoptóticos por fagócitos é essencial para o restabelecimento da homeostase tecidual e resolução da inflamação (GREENLEE-WACKER, M.C, 2016).
Considerando o exposto, neste trabalho investigamos a ação dos AGCCs sobre a sobrevivência/morte de neutrófilos e as consequências dessa ação sobre o processo de retirada dos mesmos por macrófagos e o perfil de resposta destas últimas células. Também analisamos in vivo a relevância do efeito dos AGCCs sobre os neutrófilos utilizando para tanto bactérias A. actinomycetemcomitans, as quais conforme já descrito, estão associadas a infecção periodontal, condição essa na qual há geração de grandes quantidades de AGCCs em decorrência da disbiose.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Investigar o papel dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) e seu receptor free fatty acids receptor 2 (FFAR2) na morte de neutrófilos e as possíveis implicações desse processo na função efetora dos macrófagos.
2.1.1 Objetivos específicos
- Avaliar o efeito dos AGCCs sobre a morte de neutrófilos e a participação do receptor FFAR2 nesse processo;
- Examinar a participação das caspases na indução de apoptose por AGCCs em neutrófilos;
- Analisar a participação das caspases no efeito dos AGCCs sobre a produção de citocinas por neutrófilos;
- Avaliar se o pré-tratamento dos neutrófilos com AGCCs altera a capacidade dos macrófagos em eferocitar estas células e sua resposta efetora após estimulação com LPS ou com bactérias Aa (in vitro e in vivo);
- Investigar os mecanismos envolvidos na modulação da produção de citocinas por macrófagos após eferocitose;
- Analisar o perfil de migração celular, resposta microbicida e produção de mediadores inflamatórios após inoculação de neutrófilos tratados ou não com butirato em modelo de infecção subcutânea por A. actinomycetemcomitans.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos machos C57/Bl6 e C57/Bl6 GFP heterozigotos adultos, adquiridos junto ao centro multidisciplinar para investigação biológica (CEMIB-UNICAMP) e mantidos no Biotério de Animais Transgênicos do DGEB/IB. Os animais knockout para o receptor FFAR2 (FFAR2-/-) e seu respectivo controle, animais tipo selvagem (wild type), portadores do receptor (FFAR2+/+) foram adquiridos em colaboração com a Profa. Angélica Vieira (UFMG). A autorização para a utilização dos animais transgênicos descritos no presente projeto foi obtida junto a Comissão Interna de Biossegurança (CIBio). Todos os procedimentos desse estudo seguiram os princípios éticos de experimentação animal. Os protocolos necessários foram previamente submetidos a Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do Instituto de Biologia da UNICAMP (protocolo nº 3739-1 e 3891-1).
3.2 Bactérias
Bactérias Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) JP2 foram fornecidas pelo Laboratório de Anaeróbios, coordenado pelo Prof. Mário Júlio Ávila Campos (ICB, USP) e foram cultivadas em microaerobiose, utilizando meio BHI chocolate (Kasvi) suplementado com hemina (5 μg/mL, Sigma Aldrich, Germany) e menadiona (1 μg/mL, Sigma Aldrich, Germany) a 37°C. Dois dias antes da realização do experimento, as bactérias presentes na placa foram transferidas para caldo BHI (Kasvi), suplementado com hemina e menadiona. Parte da suspensão de bactérias (100 uL) foi plaqueada em meio ágar chocolate, através da técnica de esgotamento, com o intuito de garantir que a bactéria cultivada era a de interesse, eliminando assim possíveis contaminações. Este procedimento foi realizado em todos os experimentos em que houve uso da bactéria. No dia do experimento, as bactérias foram retiradas da placa, centrifugadas a 12.000 rpm por 5 minutos e lavadas duas vezes com PBS estéril (pH=7,3). As bactérias foram então ressuspendidas na concentração de 12 x 108 CFUs/mL em PBS utilizando-se para tanto a escala de MacFarland.
3.3 Obtenção dos neutrófilos elicitados com tioglicolato
Os neutrófilos foram obtidos através de lavagens do peritônio. A obtenção foi realizada após 18 horas da inoculação de solução estéril de tioglicolato a 4%, que desencadeia inflamação com caráter estéril na região (peritônio). Para a coleta das células, a cavidade intraperitoneal dos animais foi lavada com 10 mL de solução salina estéril (PBS). As células obtidas foram transferidas para tubos cônicos, centrifugadas (1200 rpm, 10 min., 4ºC) e ressuspendidas em 2 mL de solução hipotônica de cloreto de amônio para retirada de hemácias. Posteriormente, as células foram centrifugadas, ressuspendidas em meio RPMI (Vitrocell, Campinas/SP) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Vitrocell, Campinas/SP) e antibiótico (PS – Penicilina e Estreptomicina, Gibco, ThermoFisher Scientific). As células foram contadas em câmera de Neubauer. Lâminas de citocentrifugado foram confeccionadas e coradas com Giemsa para posterior análise da pureza da preparação. A concentração dos neutrófilos obtidos foi ajustada de acordo com o tipo de experimento realizado.
3.3.1 Incubação das células
Os neutrófilos obtidos conforme descrito no item anterior foram incubados por 4 horas na presença de diferentes concentrações de acetato (10 e 25 mM) ou butirato (1 e 5 mM). As bactérias Aa foram adicionadas na proporção de 10 bactérias para 1 neutrófilo, e as amostras foram incubadas em estufa a 5% de CO2, 37°C, por
4 horas.
Para esses ensaios foram utilizadas placas de cultura de 24 poços, cuja superfície foi tratada para haver baixa adesão celular (Ultra Low Attachment surface®, Corning, MA, EUA). A justificativa para o uso das mesmas é que após a adição das bactérias há a ativação dos neutrófilos e adesão à superfície da placa de cultura. Uma vez que a adição de tratamentos para o desprendimento dessas células como solução de tripsina afetaria a sua sobrevivência, optamos por utilizar as placas de baixa adesão.
A escolha do tempo de incubação dos neutrófilos se baseia tanto em relatos da literatura, quanto em resultados obtidos em experimento piloto no qual, verificou-se que esse foi o tempo mínimo de incubação para haver um aumento significativo de neutrófilos com externalização de fosfatidilserina (analisada pela ligação a anexina V) em relação ao momento da coleta das células.
3.3.2 Marcação das células
Após incubação, as células foram retiradas da placa e acondicionadas em microtubos previamente identificados. A placa utilizada foi lavada com 200 uL de PBS por poço para retirada das células que poderiam ter permanecido aderidas. As amostras foram centrifugadas a 2000 rpm, por 5 minutos, à 4ºC. O sobrenadante obtido foi descartado e as células ressuspendidas em 100 uL de tampão para marcação com anexina V (Binding Buffer, BD, CA).
Todas as amostras foram marcadas com anticorpo Ly6G-PE (PE anti-mouse Ly6G PE, clone 1A8, Biolegend, EUA); Anexina V-FITC (Biolegend, EUA) e 7-AAD (Sigma, Alemanha). Amostras com marcação simples e sem marcação foram utilizadas para a setagem do citômetro. Foram adquiridos 10.000 eventos em citômetro Gallios (Beckman Coulter, CA, EUA). Os resultados foram posteriormente analisados utilizando o programa FlowJo vX.0.7.
3.4 Quantificação de citocinas e da atividade de lactato desidrogenase presente no sobrenadante das culturas de neutrófilos
A atividade de lactato desidrogenase foi mensurada a partir do sobrenadante das culturas utilizando kit (Labtest, MG, Brasil) de acordo com as especificações do fabricante. Para calcular a atividade de lactato desidrogenase no sobrenadante das culturas utilizou-se o valor da leitura das amostras (comprimento de onda 340 nm) obtido no tempo 0 e após 2 minutos. O valor obtido após a subtração das leituras foi divido por 2 e multiplicado por 8095, conforme descrito na bula do kit.
A quantificação de citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-10) no sobrenadante das culturas celulares foi realizada pelo método de ELISA, utilizando o Kit Duo Set (R&D System, Mineapolis, MN, USA) de acordo com procedimento descrito pelo fabricante. Tanto no caso da lactato desidrogenase quanto das citocinas, os neutrófilos elicitados foram incubados com os AGCCs na presença ou não de Aa. Após a incubação por 4 horas, os sobrenadantes foram coletados e armazenados a -80ºC até o momento da quantificação.
3.5 Análise de fragmentação de DNA
Os neutrófilos foram plaqueados em placas de baixa adesão (Corning), na concentração de 1x106 células por poço, tratados com acetato (25 mM) ou butirato
nas concentrações de 1 e 5 mM. Após 4 ou 18 horas de incubação em estufa a 37ºC, 5% CO2, o conteúdo dos poços foi aspirado e o próprio meio no qual as
células estavam foi utilizado para retirada das células aderentes existentes no fundo da placa. As amostras foram acondicionadas em microtubos, centrifugadas a 2000 rpm, por 5 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 200 uL de solução hipotônica contendo 50 ug/mL de iodeto de propídio, 0,1% de citrato de sódio e 0,1% de triton X-100. As amostras foram homogeneizadas com uso de vórtex, por 30 segundos. Após incubação de 30 minutos, ao abrigo da luz, em temperatura ambiente, as amostras foram transferidas para tubos de citometria e foi realizada a leitura das mesmas no citômetro Gallios (Beckman Coulter, CA, EUA).
3.6 Análise da atividade de caspases 1, 8 e 9
Neutrófilos elicitados foram plaqueados (0,5 x 106 células) em placas de baixa adesão e tratados separadamente com acetato 25 mM ou butirato 5 mM. As células foram então incubadas por 4 horas, em estufa a 37ºC.
Após esse período, as células foram retiradas da placa de cultivo, acondicionadas em microtubos e centrifugadas a 1200 rpm, por 10 minutos; ressuspendidas em 145 uL de meio RPMI suplementado com 10% de SBF. Adicionou-se 5 uL de Flica 30x (ImmunoChemistry Technologies, EUA) a cada uma das amostras, as quais foram então mantidas 30 minutos a 37ºC, sob agitação. Após esse período, foi adicionado 1 mL de tampão apoptose 1x, presente no kit de detecção de caspase. As células foram centrifugadas a 1200 rpm, por 10 minutos, ressuspendidas em 500 uL de tampão para apoptose, novamente centrifugadas a 1200 rpm, por 10 minutos e ressuspendidas em 300 uL de tampão. Foi adicionado anticorpo anti-Ly6G-APC (anticorpo anti-mouse Ly6G, clone 1A8, Biolegend) para marcação da população de neutrófilos. Após 15 minutos, foi realizada análise das células por citometria de fluxo. Para esta análise considerou-se a população de células positivas para o marcador Ly6G-APC. Dentro dessa população foi considerada a média de fluorescência das células, sendo que, para a comparação entre as amostras, a condição controle (células incubadas apenas com meio de cultura, sem tratamento) foi considerada como 100%. Em todos os experimentos foram feitos tubos sem marcação e com marcação simples para setagem dos parâmetros no citômetro.
3.6.1 Experimentos com inibidor de caspases (QVDOPh)
Análises de viabilidade celular e produção de citocinas por neutrófilos foram realizadas na presença de inibidor de caspases QVDOPh (Sigma Aldrich, Alemanha), o qual é eficaz em inibir a apoptose em neutrófilos (WARDLE et al, 2011). Nesses experimentos, o inibidor (concentração final de 10 uM) foi adicionado primeiro e logo em seguida cada um dos tratamentos isolados (acetato 10 e 25 mM e butirato 1 e 5 mM). O inibidor permaneceu em contato com as células por todo o período de incubação.
3.7 Análises de co-cultura de neutrófilos com macrófagos
3.7.1 Diferenciação de macrófagos da medula óssea
Células da medula óssea foram obtidas após lavagem do interior do fêmur e tíbia de camundongos, utilizando meio RPMI suplementado com 10% de SBF e antibiótico. As células obtidas foram centrifugadas a 1200 rpm, por 10 minutos e ressuspendidas em 2 mL de solução hipotônica de cloreto de amônio para a retirada das hemácias. Foram centrifugadas a 2000 rpm, por 8 minutos e ressuspendidas em 5 mL de meio RPMI suplementado com SBF e antibiótico, suspensão da qual foi retirada uma alíquota para contagem em câmara de
Neubauer. Após a contagem, as células foram plaqueadas em garrafas de 75 cm2
(Corning, EUA) na concentração máxima de 2 x 107 células/garrafa em meio específico para diferenciação composto por: 60% meio RPMI com antibiótico, 10% SBF e 30% de meio condicionado proveniente do sobrenadante do cultivo de células L929, conforme protocolo previamente estabelecido na literatura (WEISCHENFELDT & PORSE, 2008). O meio das células foi trocado no terceiro e quinto dias de cultivo.
Após os 5-7 dias de diferenciação, o meio foi descartado, as garrafas foram lavadas duas vezes com solução de PBS, e foram adicionados 7 mL de Tripsina 1x (Gibco, EUA), aquecida a 37ºC. As garrafas foram mantidas por 15 minutos em estufa, a 37ºC. Após esse período, foram adicionados 7 mL de meio RPMI suplementado com 10% SBF para neutralização da tripsina e as células das garrafas foram retiradas com auxílio de Cell Scraper (Corning, EUA). As células foram acondicionadas em tubos cônicos e centrifugadas a 2000 rpm, por 8 minutos. Ressuspendidas em 5 mL de meio RPMI suplementado, uma alíquota foi retirada para a contagem em Câmara de Neubauer. Após a contagem, as células foram
plaqueadas em placas de 24 e 96 wells, de acordo com o protocolo do experimento realizado. Os macrófagos obtidos segundo esse protocolo só foram utilizados após 24 horas de incubação. Utilizando esse procedimento obtivemos uma preparação com mais de 90% das células positivas para os marcadores F4/80 e CD11b (RAZOLLI et al, 2015).
3.8 Fagocitose de neutrófilos em apoptose in vitro (eferocitose)
Neutrófilos elicitados de camundongos que expressam GFP (heterozigotos) foram cultivados na presença de acetato (25 mM) ou butirato (5 mM). As células foram mantidas por 4 ou 18 horas em placas de 24 wells, de baixa adesão (Corning), em estufa a 37ºC e 5% CO2. Após esse tempo, as células foram
retiradas da placa, acondicionadas em microtubos, centrifugadas a 2000 rpm, por 5 minutos e ressuspendidas em 100 uL de meio RPMI 1620 suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF). Para este experimento os macrófagos, provenientes de diferenciação de células de medula óssea, obtidos conforme protocolo descrito anteriormente, foram plaqueados na concentração de 0,3 x 106 células por poço, em placas de 24 wells. Em cada um dos poços contendo macrófagos foram adicionados 100 uL de suspensão de neutrófilos na concentração de 1,5x106 células (razão 1:5). Após 1 hora de incubação das células, o meio da placa contendo os macrófagos e neutrófilos foi descartado. Os poços foram lavados com 1 mL de PBS, por 3 vezes. Na última lavagem foram acrescentados 300 uL de PBS. Os macrófagos foram então retirados da placa por raspagem com o uso da parte posterior da ponteira. O conteúdo total dos poços foi aspirado, a ele foi adicionado 0,5 uL de anticorpo anti-F4/80 (anticorpo anti-mouse anti-F4/80 APC, Biolegend, CA, USA). Após 15 minutos as amostras foram lidas (10.000 eventos) em citômetro de fluxo Beckman Coulter.
O controle negativo deste experimento consistiu de macrófagos não incubados com neutrófilos. Essas células foram utilizadas como referência para definição de fagocitose e para a setagem de populações celulares do equipamento. Utilizou-se como parâmetro de atuação dos AGCCs o controle positivo, no qual foram adicionados neutrófilos sem tratamento aos macrófagos. A análise dos resultados foi realizada considerando a população composta apenas por células positivas para F4/80 (macrófagos). A partir desta população foi analisada a porcentagem de células com dupla marcação (positivas para F4/80 e para GFP).
3.9 Produção de citocinas derivadas de macrófagos previamente incubados com neutrófilos tratados com AGCCs
Neutrófilos elicitados de camundongos C57BL6 foram coletados e plaqueados na concentração de 1,5 x 106 células/mL, por 4 horas na presença de AGCCs: acetato 25 mM e butirato 5 mM. Após esse período, as células foram retiradas das placas de baixa adesão e lavados duas vezes com 1 mL de PBS estéril. Os neutrófilos foram então incubados com macrófagos, previamente coletados e plaqueados em placas de 96 wells na concentração de 0,3 x 106, conforme protocolo descrito anteriormente. Após 1 hora de incubação conjunta das células, os neutrófilos não fagocitados foram retirados através de três lavagens utilizando PBS. Os macrófagos foram então incubados na presença de LPS (1 ug/mL, Sigma Aldrich, EUA). Após a incubação de 24 horas, o sobrenadante das culturas foi coletado e armazenado para a quantificação de mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-1β, IL-10 e IL-12) por técnica de ELISA.
3.10 Análise da capacidade fagocítica de macrófagos após co-culturas com neutrófilos.
Macrófagos foram incubados com neutrófilos previamente tratados conforme já descrito em item anterior, na proporção de 1:5 neutrófilos. Após uma hora de incubação dos macrófagos e neutrófilos, a placa foi lavada três vezes com PBS para a retirada das células que não foram eferocitadas. À placa foi adicionada a bactéria Aa opsonizada e marcada conforme descrito adiante.
Bactérias foram retiradas com auxílio de alça descartável estéril da placa de ágar chocolate preparada dois dias antes do experimento, conforme descrito anteriormente. Utilizou-se como parâmetro a escala 4 de Mac Farland, na qual encontra-se a concentração de 12x108 células/mL. Deste volume foi retirada a quantidade suficiente para preparar todas as condições de análise, nas quais foram acrescentadas 5x106 bactérias por poço. O volume de bactéria pipetado foi centrifugado a 12.000 rpm, por 5 minutos e posteriormente, as bactérias foram opsonizadas com 100 uL de soro de camundongo em agitador térmico a 37ºC por 20 minutos.
Após opsonização, o tubo contendo as bactérias foi centrifugado a 12.000 rpm, por 5 minutos, lavado duas vezes com PBS pH 7,4. Novamente centrifugado, e ressuspendido em 200 uL de solução PBS pH = 9,0 e adicionado 1 uL de sonda
pHRodo (Invitrogen ThermoFisher Scientific Waltham, MA, EUA). O microtubo foi mantido em agitador térmico a 37ºC, sob agitação por 30 minutos. Posteriormente, foi feita a lavagem com 1 mL de solução de PBS, e as bactérias foram novamente centrifugadas a 12.000 rpm, por 5 minutos e ressuspendidas em 2 mL de meio RPMI modificado – sem antibiótico. A suspensão de bactérias obtida foi adicionada na concentração de 5x106 bactérias em 100 uL por poço. Após duas horas da adição das bactérias, a placa foi lavada três vezes com solução de PBS para a retirada das bactérias que não foram fagocitadas. Foram adicionados 200 uL de solução de PBS em cada um dos poços para auxiliar na retirada das células da placa. As células foram removidas da placas com auxílio de scrapper. As amostras foram transferidas para tubos microtubos, nos quais foram adicionados 5 uL de anticorpo anti-F4/80 APC diluído 10x para detecção dos macrófagos. Após incubação de 15 minutos, as amostras foram transferidas para tubos de citometria, e foram adicionados 5 uL de Azul de Tripan 4% (Sigma Aldrich- MO, EUA). A adição de Azul de Tripan foi realizada, pois é parte da técnica de quenching fluorescence, que auxilia na diferenciação entre partículas aderidas e internalizadas.(HED,J. et al, 1987).
3.11 Experimentos in vivo 3.11.1 Câmara subcutânea
A adoção do modelo de câmara subcutânea, idealizado por Genco e colaboradores (1991), para avaliar processos infecciosos, permitiu investigar a ação de neutrófilos previamente tratados com butirato 5 mM, frente ao processo inflamatório desencadeado pela bactéria A. actinomycetemcomitans. A intenção foi avaliar se o pré-tratamento dos neutrófilos com butirato 5 mM, que desencadeia aumento da taxa de apoptose nas células, favoreceria a resolução da inflamação desencadeada pela bactéria ou colaboraria ainda mais para acentuar o processo inflamatório.
A câmara apresenta estrutura semelhante a uma mola, com diâmetro aproximado de 0,5 cm e comprimento de 1 cm, feita em aço inoxidável e foi autoclavada antes da sua inserção nos animais. Para os experimentos, animais C57Bl6 foram utilizados como aceptores da câmara. Para tal, os animais foram anestesiados com xilazina (Anasedan, Ceva, 2 g/mL) e quetamina (Dopalen, Ceva, 1 g/mL), concentração de 1:2 (10 e 100 mg/kg de peso, respectivamente) aplicados via intraperitoneal.
Iniciada a ação dos medicamentos, a região do dorso dos animais foi higienizada com álcool 70% e os pêlos foram retirados com auxílio de lâmina de barbear. Um corte horizontal de cerca de 1 cm foi realizado na região (1 cm acima da região da cauda) para a inserção da câmara. O corte foi fechado com cola instantânea (Super Bonder, Henkel), além da adição, na superfície do corte, de solução degermante de iodopolividona (Riodeine, Rioquímica, 1% de iodo). Após a cirurgia, os animais receberam 5 mg/kg de Cetoprofeno (Medley, 20 mg/mL), que apresenta ação analgésica e anti-inflamatória, por via subcutânea.
Ao longo dos 10 dias após a inserção da câmara, um tecido passou a revestir o interior da câmara, porém não o revestiu por completo, ficando a parte central livre para inoculação da bactéria e dos neutrófilos. Decorrido esse período, os animais foram anestesiados, através da via inalatória, com Isoflurano a 2% (BioChimico).
A região onde a câmara foi implantada foi desinfectada com álcool 70% e inoculou-se 1x108 UFCs/100 uL da bactéria A. actinomycetemcomitans. Após 4 horas, neutrófilos na concentração de 1x106/100 uL, tratados ou não com butirato 5 mM, foram inoculados nesta mesma região. Em alguns animais, no lugar dos neutrófilos, foram adicionados 100 uL de PBS, determinando deste modo a condição controle do experimento, que continha apenas bactéria.
Decorridas 20 horas, os animais foram eutanasiados, com uso de Isoflurano a 2% (BioChimico) e realização de deslocamento cervical. O exsudato formado no interior da câmara foi coletado conjuntamente com 40 uL de EDTA 0,5 M estéril. Este exsudato foi aliquotado da seguinte maneira: 20 uL para diluição seriada e plaqueamento, através do qual foi avaliada a sobrevivência bacteriana; 20 uL para confecção de lâminas em citocentrífuga, com posterior análise qualitativa e quantitativa das células que migraram para a câmara; 10 uL para contagem de células totais presentes na região; o restante do exsudato obtido, foi centrifugado e o sobrenadante foi armazenado para quantificação de citocinas. A seguir está uma figura que representa o delineamento experimental realizado (Figura 1).
Figura 1- Esquema de delineamento experimental da inserção de câmara subcutânea.
3.11.2 Eferocitose in vivo com posterior separação de células por
Cell Sorting
Com o intuito de avaliar se o pré-tratamento de neutrófilos com butirato (5 mM) poderia alterar a eferocitose in vivo realizada pelos macrófagos, adotamos experimentos nos quais os neutrófilos foram inoculados no peritônio de animais que anteriormente foram inoculados com tioglicolato 4% (i.p.) e apresentavam aumento do recrutamento de macrófagos nessa região. Os macrófagos coletados do peritônio foram analisados tanto quanto a fagocitose de neutrófilos, assim como a responsividade destes a estímulo bacteriano (LPS, 1 µg/mL).
Nesses experimentos foi injetado 1 mL de solução de tioglicolato a 4%, através da via intraperitoneal, em animais C57Bl6, 72 horas antes da realização do experimento. Decorridas 48 horas, foi inoculado 1 mL de tioglicolato 4%, no peritônio de animais C57Bl6 GFP Het. Após 18 horas da inoculação nos animais GFP, estes foram eutanasiados e as células presentes no peritônio foram removidas por meio
de lavagem com PBS. As células obtidas, cerca de 70% de neutrófilos, foram ressuspendidas na concentração de 1x106, tratadas ou não (controle) com butirato 5 mM por 4 horas, em estufa a 37°C, para indução de apoptose. Após esse período, as células foram centrifugas a 1200 rpm, por 10 minutos e ressuspendidas com PBS. Estas células foram ressuspendidas e posteriormente inoculadas por via intraperitoneal nos animais (3x106/animal) que receberam tioglicolato. Após 2 horas da inoculação intraperitonial dos neutrófilos obtidos anteriormente, os animais foram eutanasiados e foram feitas lavagens da região peritoneal com PBS. As células coletadas foram quantificadas. Esta suspensão de células foi ajustada para 2x106 células/mL e foi feito o bloqueio de receptores de Fc utilizando anticorpo anti-CD16/32 e, posterior marcação com anticorpo anti-F4/80 APC (Biolegend, CA, EUA).
As células foram separadas no Sorting (BD FACS Aria™ll), coletadas em soro bovino fetal e mantidas no gelo até a sua utilização. Através da separação realizada pelo equipamento, foram obtidas quatro populações: uma composta por macrófagos que eferocitaram neutrófilos tratados com butirato 5 mM (células positivas para F4/80 e GFP); outra por macrófagos que eferocitaram neutrófilos que não receberam tratamento (células positivas para F4/80 e GFP), ou seja, incubados apenas com meio de cultura; e outras duas compostas por macrófagos que não eferocitaram em nenhuma das condições de neutrófilos (tratados ou não com butirato 5 mM; apenas positivas para F4/80).
Essas populações foram cultivadas em placas de 96 wells, na concentração de 5,5 x103 células, por 24 horas, para que houvesse adesão celular. Após esse período, os macrófagos foram estimulados com LPS (1 µg/mL). Decorridas 24 horas, o sobrenadante foi coletado e armazenado a -80°C para posterior quantificação de citocinas por método de Elisa. A seguir está o esquema contendo o delineamento realizado nestes experimentos (Figura 2).
Figura 2- Esquema de delineamento experimental de eferocitose in vivo.
3.12 Análise estatística
Os resultados são apresentados como média + erro padrão da média. Comparações entre os diferentes grupos experimentais foram realizadas por análise de variância de uma via (ANOVA) e pós-teste de Tukey ou teste de Kruskal Wallis e pós teste de Dunns (resultados que não passaram no teste de normalidade). Em alguns casos Teste-t não pareado foi utilizado. Para a realização das análises estatísticas foi utilizado o programa Graph Pad Prisma 5.0 (GraphPad Software, Inc., CA, USA). As diferenças foram consideradas significativas para p<0,05.
4. RESULTADOS
4.1 Efeito dos AGCCs sobre a morte de neutrófilos 4.1.1 Análise de viabilidade celular
Este primeiro experimento foi realizado com o intuito de elucidar quais os tipos de morte celular que poderiam ser desencadeados nos neutrófilos quando na presença dos ácidos graxos. Os neutrófilos elicitados, provenientes de lavado intraperitoneal, após 18 horas de inoculação de tioglicolato 4% (i.p.) foram incubados com os ácidos graxos nas seguintes concentrações: acetato 10 e 25 mM, butirato 1 e 5 mM, e permaneceram incubados pelo período de 4 horas, na ausência de bactérias. A escolha do tempo de incubação dos neutrófilos se baseia tanto em relatos da literatura, quanto em resultados obtidos em experimento piloto no qual, verificou-se que esse foi o tempo mínimo de incubação para haver um aumento significativo de neutrófilos com externalização de fosfatidilserina (analisada pela ligação a anexina V) em relação ao momento da coleta das células.
Após análise por citometria de fluxo, verificou-se que a viabilidade das células na presença de butirato nas concentrações de 1 e 5 mM foi significativamente reduzida, enquanto que as células tratadas com acetato não sofreram efeito significativo em comparação a condição controle (Figura 3).
Figura 3 – Efeito dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) sobre a viabilidade de neutrófilos. Os
neutrófilos foram tratados isoladamente com acetato nas concentrações 10 e 25 mM ou butirato 1 e 5 mM, durante 4 horas. A análise de viabilidade celular foi realizada por citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=8). Bt 1 mM e Bt 5mM = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.
Além da viabilidade das células, foi detectada e quantificada a ocorrência de apoptose, apoptose tardia e necrose utilizando os marcadores 7-AAD e anexina V-FITC. A apoptose de neutrófilos foi evidenciada na presença de butirato nas concentrações de 1 e 5 mM, com tendência a apresentar um perfil dose dependente
da concentração de butirato (Figura 4A). A apoptose tardia definida pela marcação tanto de anexina V quanto de 7-AAD foi significativamente maior nas células incubadas na presença de butirato 5 mM em comparação com o controle. A porcentagem de células em necrose foi baixa e não houve alteração quando na presença dos ácidos graxos (Figura 4C).
Figura 4 - Efeito dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) sobre a apoptose (A), apoptose tardia
(B) e necrose (C) de neutrófilos. Os neutrófilos foram tratados isoladamente com acetato nas concentrações 10 e 25 mM ou butirato 1 e 5 mM, durante 4 horas. A análise dos tipos de morte desencadeadas pelos AGCCs foi caracterizada por citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=8). Bt 1 mM e Bt 5mM (A); Bt 5 mM (B) = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.
A seguir, estão os perfis das populações celulares, frente aos tratamentos utilizados: acetato 10 e 25 mM; butirato 1 e 5 mM após incubação de 4 horas e também no tempo 0 (Figura 5). As células incubadas na presença da bactéria apresentaram perfil semelhante e por isso, não são apresentados resultados representativos dessas análises.
Figura 5 - Gráficos representativos das amostras de neutrófilos incubadas com e sem AGCCs, nos
tempos 0 e 4 horas, na ausência da bactéria Aa. Análise realizada através de citometria de fluxo. Os gráficos foram gerados pelo programa FlowJo v. X.0.7. A figura 5A é composta pela população total de células obtidas durante a análise; à partir da população de células obtidas na figura 5A, foi determinada a população de neutrófilos (células Ly6G+) (5B) e a partir dessa população determinou-se a positividade para os marcadores Anexina V FITC e 7-AAD. A porcentagem de células em apoptose (Anexina V +, quadrante superior esquerdo), apoptose tardia (Anexina e 7-AAD +, quadrante superior direito), necrose (AAD +, quadrante inferior direito) e viáveis (Anexina-V e 7-AAD -, quadrante inferior esquerdo), são apresentadas à partir da figura 5C, na qual a análise representa os neutrófilos obtidos no tempo 0, sem tratamento. A figura 5D representa neutrófilos incubados sem AGCCs por 4 horas, assim como as demais amostras de neutrófilos tratadas com AGCCs. Os neutrófilos foram incubados com acetato nas concentrações de 10 mM (Figura 5E) e 25 mM (Figura 5F), e com butirato 1 mM (Figura 5G) e 5 mM (Figura 5H).
4.1.2 Viabilidade de neutrófilos FFAR2-/- tratados com ácidos graxos de cadeia curta
As células provenientes do sistema imune são alvos importantes dos ácidos graxos de cadeia curta, os quais atuam sobre elas através de diferentes
Anexina + 7-AAD + Anexina + 7-AAD + Anexina – 7AAD -A B C D E F G H
mecanismos, como os receptores acoplados à proteína G, como por exemplo, FFAR2, FFAR3, GPR109A e Olfr78. (CORRÊA, R.O. et al, 2016). Diante deste fato, avaliou-se a capacidade dos ácidos graxos acetato (25 mM) e butirato (1 e 5 mM) em alterar a viabilidade de neutrófilos provenientes de animais que não possuíam o receptor FFAR2, principal receptor de AGCCs expresso nesse tipo celular. As células também foram incubadas por 4 horas com os ácidos graxos, utilizados de modo isolado. Após análise por citometria de fluxo, constatou-se que na ausência do receptor, os neutrófilos incubados com butirato 5 mM apresentaram redução da viabilidade celular (Figura 6).
Figura 6 – Efeito dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) sobre a viabilidade de neutrófilos
FFAR2-/-.Os neutrófilos foram tratados isoladamente com acetato na concentração 25 mM ou butirato
1 e 5 mM, durante 4 horas. A análise de viabilidade celular foi realizada por citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=8). Bt 5mM = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.
Conforme apresentado na figura 7, observou-se efeito apoptótico do butirato em células que não expressam o receptor FFAR2. Na maior concentração utilizada de butirato houve aumento da taxa de apoptose, que se mostrou significativo frente às análises estatísticas utilizadas. Não houve alteração significativa nessas células quanto a apoptose tardia e necrose (Figura 7B e 7C). Nesses experimentos, vale ressaltar que o butirato apesar de ter induzido apoptose nos neutrófilos que não expressam FFAR2, o seu efeito foi menos evidente do que o observado em neutrófilos de animais WT, uma vez que somente na maior concentração apresentou essa ação. Além disso, mesmo considerando essa condição a porcentagem de células apoptóticas foi inferior ao observado em células portadoras do receptor FFAR2 (Figura 7D).
Figura 7 – Efeito dos AGCCs sobre a apoptose (A), apoptose tardia (B) e necrose (C) de neutrófilos
FFAR2-/-, comparação das taxas de apoptose entre neutrófilos WT e KO quando tratados com butirato
5 mM (D). Os neutrófilos foram tratados isoladamente com acetato na concentração 25 mM ou butirato 1 e 5 mM, durante 4 horas. A análise dos tipos de morte desencadeadas pelos AGCCs foi caracterizada por citometria de fluxo. O grupo controle foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=8). Bt 5mM (A)= p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.
4.2 Análise de viabilidade celular na presença de bactéria
Após verificar os efeitos dos AGCCs sobre a morte celular de neutrófilos com e sem o receptor FFAR2, incubados por 4 horas, na ausência da bactéria, passou-se a avaliar o perfil de resposta dos neutrófilos quando da adição da bactéria
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) que é um patógeno periodontal, capaz
de produzir de ácido graxo de cadeia curta, conjuntamente com outras bactérias, no local da infecção e alterar o perfil de resposta imune. No tempo de 4 horas de incubação houve significativa redução da viabilidade das células, tanto na presença quanto ausência da bactéria, porém na presença da bactéria a redução foi mais acentuada (Figura 8).
Figura 8 – Análise quantitativa da viabilidade de neutrófilos na presença e ausência de
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa). Os neutrófilos foram incubados na ausência da
bactéria (condições Tempo 0 e Tempo 4 horas sem bactéria) ou na presença da bactéria (condição Tempo 4h com Aa), na concentração de 1 neutrófilo para 10 bactérias, por 4 horas, sem uso dos tratamentos com AGCCs. A análise da viabilidade dos neutrófilos foi realizada por citometria de fluxo. O grupo Tempo 0h foi utilizado como referência. Cada resultado representa a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes (n=9). Tempo 4h sem bactéria e Tempo 4h com Aa = p<0,05 diferença significativa por ANOVA, seguida por teste de Tukey.
Após quatro horas de incubação houve aumento tanto da porcentagem de neutrófilos em apoptose inicial quanto tardia em comparação com o tempo 0. Entretanto, no caso das células incubadas com Aa observou-se um aumento mais acentuado do número de células em apoptose tardia em comparação com a condição sem bactéria (Figura 8B). A porcentagem de células em necrose (valores baixos, inferiores a 1%), foi menor após 4 horas de incubação, tanto na presença quanto ausência de bactéria. (Figura 8C)
