Efeitos do Orl, Ptx e da associação Orl/Ptx sobre os tumores primários em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 2).

Após 17 dias da inoculação das células LN1-A na região dorsolateral direita da língua, todos os animais foram eutanasiados e tiveram suas línguas coletadas. Avaliamos a formação dos tumores, bem como as suas localizações, volumes e porcentagem das áreas afetadas da língua. A maioria dos tumores foi facilmente localizada no momento da coleta pela coloração verde conferida pela proteína ZsGreen (Figura 13 A, B, C, D – Painel 1). Os tumores de menor volume foram localizados em câmara escura com exposição a luz azul (Figura 13 A, B, C, D – Painel 2).

Todos os animais dos grupos Ctrl e Ptx apresentaram tumores detectáveis ao final do período de tratamento. No entanto, estes foram observados em apenas 85% e 87,5% dos animais dos grupos Orl e Orl/Ptx, respectivamente (Tabela 3). A localização dos tumores primários foi homogênea, com a maior parte deles no ponto de inoculação das células. No entanto, como ocorreu no experimento 1, alguns dos tumores se formaram em outras regiões da língua, como o ventre e o lado oposto ao da inoculação (Tabela 3).

Tabela 3 – Avaliação da formação de tumores primários e sua localização em modelo ortotópico de CCE de língua, nos grupos Ctrl, Orl, Ptx e Orl/Ptx, tratados com Orl, Ptx ou a associação dos dois fármacos (Orl/Ptx). Dados relativos ao experimento 2.

figuras A, B, C e D, mostram fotos realizadas do dorso (painéis 1 e 2– linhas superiores) e ventre lingual (painéis 1 e 2 – linhas inferiores), logo após a eutanásia (painéis 1) e sob exposição aluz azul em câmara escura (painéis 2), respectivamente. A maioria dos tumores foi facilmente localizada macroscopicamente pela presença da coloração verde, conferida pela proteína ZsGreen (A, B, C e D, painéis 1). Os tumores de menores proporções foram visualizados com auxílio do aparelho de fotodocumentação (UVITEC) com exposição de luz azul (A, B, C e D, painéis 2). Não observamos diferenças importantes nos volumes e áreas afetadas da língua pelo tumor primário nos grupos Ctr e Orl. O grupo Ptx apresentou ligeira diminuição no volume em relação aos grupos Ctrl e Orl. Observamos efeito sinérgico no grupo tratado com Orl/Ptx na redução do desenvolvimento tumoral (E e F).

Em relação ao tamanho dos tumores primários, foi notável a redução que ocorreu no grupo tratado com a associação das drogas (Orl/Ptx) (Figura 13 E, F). O grupo tratado apenas com Ptx apresentou ligeira redução do volume do tumor primário, quando comparado com os grupos Ctr e Orl. Da mesma maneira que no experimento 1, não observamos diferenças significativas nos tamanhos dos tumores dos grupos Ctrl e Orl. As duas formas de avaliação dos tamanhos dos tumores primários (volume e porcentagem da área afetada da língua) apresentaram resultados similares (Figura 13 E, F). Como também ocorreu no experimento 1, observamos o desenvolvimento de um tumor de grandes proporções em um dos animais do grupo Orl/Ptx (Figura 13 D, seta).

5.2.2 Avaliação da disseminação metastática regional em modelo ortotópico de CCE de língua com a linhagem LN1-A, nos grupos Ctrl, Orl, Ptx e Orl/Ptx, após 16 dias de tratamento (experimento 2).

No primeiro experimento observamos que não houve envolvimento das cadeias MLD e MLE pelas metástases no modelo ortotópico utilizado no presente estudo. Por esta razão, no experimento 2 somente as cadeias MMD e MME foram coletadas e analisadas.

Todos os linfonodos coletados foram inicialmente analisados em microscópio de epifluorescência no aumento de 25X (Figura 15A). De todos os linfonodos coletados no grupo Ctrl, 40 % apresentaram metástases, sendo que 28 % delas pertenciam a cadeia MMD e 12 % a cadeia MME. O grupo Orl apresentou envolvimento metastático em 31,6 % dos linfonodos coletados, nos quais 26,3 % estavam restritos a cadeia MMD e 5,3 % a cadeia MME. No grupo Ptx observamos que 21,4 % dos linfonodos afetados estavam localizados na cadeia MMD e 14, 3% na cadeia MME, totalizando 35,7 % de linfonodos metastáticos. O grupo Orl/Ptx apresentou a menor porcentagem de linfonodos positivos (20,8 %), dentre os quais 8,3 % pertenciam a cadeia MMD e 12,5 % a cadeia MME (Figura 14). Ao contrário do experimento 1, todos os grupos do experimento 2 desenvolveram metástases nas cadeias MME (Figura 15A) e o acometimento simultâneo das cadeias MMD e MME no mesmo animal foi visualizado nos grupos Ctrl, Ptx e Orl/Ptx (Figura 15A).

Com relação ao efeito dos tratamentos, verificamos que os grupos tratados com Orl e principalmente com a associação das drogas (Orl/Ptx) apresentaram

diminuição da disseminação metastática de 21 % e 47,9%, respectivamente, comparados com o grupo Ctrl (Figura 14B). Não ocorreram diferenças na disseminação metastática entre os animais dos grupos Ctrl e Ptx (Figura 14B). A quantificação da área afetada de cada linfonodo pelos focos metastáticos realizada com o auxílio do software Image J não evidenciou diferenças importantes entre os tratamentos estudados pois os valores obtidos se mostraram bastante variáveis (Figura 15B, C).

Figura 14 – Análise da disseminação metastática entre as cadeias MMD e MME em modelo ortotópico

de CCE de língua e comparação do efeito dos tratamentos com Orl, Ptx e Orl/Ptx. Os grupos Ctrl, Orl e Ptx apresentaram a maior porcentagem de linfonodos afetados na cadeia MMD, enquanto o grupo Orl/Ptx teve mais linfonodos afetados na cadeia MME (A). Houve maior redução da disseminação metastática no grupo Orl/Ptx, quando comparado com o grupo Ctrl (B).

5.2.3 Associação das técnicas de fluorescência com colorações H&E e IHC para confirmação da disseminação metastática em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 2).

No experimento 1 pudemos verificar que os cortes semisseriados dos blocos com os linfonodos resultaram em perda de algumas metástases que haviam sido detectadas por meio da fluorescência. Assim, no experimento 2, realizamos secções de forma seriada a fim de localizarmos todos os focos metastáticos e confirmá-los por H&E e IHC. Todos os cortes obtidos foram então reanalisados com relação a fluorescência e as lâminas que se mostraram positivas foram subsequentemente coradas em H&E e submetidas a reações de IHC.

As dúvidas sobre a positividade ou não dos linfonodos estudados que surgiram durante a análise do experimento 1 foram menos frequentes no experimento 2, mas algumas ainda ocorreram. Por exemplo, foram detectadas áreas com intensa fluorescência que, no entanto, foram negativas nas reações de IHC (Figura 16). Da mesma forma, observamos algumas células com marcações positivas nas reações de IHC, as quais não coincidiram com a fluorescência. Além disso, quando comparadas com as células metastáticas (células positivas na fluorescência e IHC) notamos diferenças na morfologia, no padrão de distribuição e na expressão de pan-CK. Dentre essas diferenças estão: núcleo reduzido, citoplasma escasso, ausência de adesão entre as células e expressão aumentada para pan-CK (Figura 17).

Figura 16 – Imagens representativas de áreas dos linfonodos estudados que se mostraram positivas

pelo método da fluorescência e que não puderam ser confirmadas pela técnica de IHC. Em (A) observa- se a presença de áreas com intensa fluorescência localizadas na região da cápsula do linfonodo (seta). A foto mostrada em (B) representa a mesma lâmina após reação de IHC para pan-CK, que foi negativa. Aumento original 100X.

Figura 17 – Imagens representativas de linfonodos que apresentaram áreas positivas nas reações de

IHC que não foram coincidentes com a fluorescência. Observa-se em (A) diversas áreas positivas (seta) para pan-CK humana, que não apresentaram fluorescência (B). Aumento original de 200X.

Diante dessas dificuldades, os linfonodos só foram considerados positivos ou negativos no presente trabalho após confirmação pelos três métodos (fluorescência, H&E e IHC para pan-CK) (Figura 18).

Figura 18 – Imagens representativas da associação das técnicas de fluorescência, coloração por H&E

e IHC na confirmação das metástases linfonodais. As metástases foram inicialmente localizadas por fluorescência após o processamento e realização dos cortes histológicos dos linfonodos obtidos dos grupos Ctrl, Orl, Ptx e Orl/Ptx. Aumento original de 100X.

5.2.4 Avaliação da quantidade de lipídios no fígado dos animais tratados com