UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
ISADORA FERRARI TEIXEIRA
PADRONIZAÇÃO DO MODELO ORTOTÓPICO DE CCE DE
LÍNGUA E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ASSOCIAÇÃO
DE ORLISTAT/PACLITAXEL EM RELAÇÃO A
DISSEMINAÇÃO METASTÁTICA E PROGRESSÃO
TUMORAL
Piracicaba 2020
ISADORA FERRARI TEIXEIRA
PADRONIZAÇÃO DO MODELO ORTOTÓPICO DE CCE DE
LÍNGUA E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ASSOCIAÇÃO
DE ORLISTAT/PACLITAXEL EM RELAÇÃO A
DISSEMINAÇÃO METASTÁTICA E PROGRESSÃO
TUMORAL
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Estomatopatologia, na Área de Patologia.
Orientador: Prof. Dr. Edgard Graner
Coorientador: Profa. Dra. Débora Campanella Bastos
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ISADORA FERRARI TEIXEIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. EDGARD GRANER.
Piracicaba 2020
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES
Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Marilene Girello - CRB 8/6159
Teixeira, Isadora Ferrari, 1993-
T235p TeiPadronização do modelo ortotópico de CCE de língua e avaliação dos efeitos da associação orlistat/paclitaxel em relação a disseminação metastática e progressão tumoral / Isadora Ferrari Teixeira. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2020.
TeiOrientador: Edgard Graner.
TeiCoorientador: Débora Campanella Bastos.
TeiDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Tei1. Carcinoma de células escamosas oral. 2. Ácido graxo sintases. 3. Paclitaxel. 4. Orlistate. 5. Camundongo. I. Graner, Edgard, 1968-. II. Bastos, Débora Campanella, 1981-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Standardization of the orthotopic model of tongue SCC and
evaluation of the effects of the orlistat/paclitaxel association in relation to metastatic dissemination and tumoral progression Palavras-chave em inglês:
Oral squamous cell carcinoma Fatty acid synthases
Paclitaxel Orlistat Mice
Área de concentração: Patologia Titulação: Mestra em Estomatopatologia Banca examinadora:
Edgard Graner [Orientador] Lucas Novaes Teixeira Jacks Jorge Junior
Data de defesa: 03-07-2020
Programa de Pós-Graduação: Estomatopatologia
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a):
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-2757-3805
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Vladimir e Maura, os quais sempre batalharam para que não me faltasse nada, que me apoiaram em todas as minhas decisões e que muitas vezes abriram mão de seus sonhos para tornarem os meus realidade. A vocês minha eterna gratidão.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa do seu Diretor, Francisco
Haiter Neto;
À Coordenadoria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba na pessoa da Profa. Dra. Karina Gonzales Silveiro Ruiz e ao Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia em nome do coordenador Prof. Dr. Márcio
Ajudarte Lopes;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Edgard Graner, agradeço todos os ensinamentos, trocas de conhecimentos, dedicação, paciência e, principalmente pela inspiração de pessoa humilde, atenciosa e acima de tudo ética. Registro toda minha admiração e respeito;
A minha coorientadora Prof. Dra. Débora Campanella Bastos que contribuiu tanto para meu desenvolvimento pessoal como profissional, através de toda dedicação, amizade e, principalmente pela paciência, desde a época da iniciação científica até hoje. Agradeço por todo conhecimento transmitido no laboratório e especialmente com os animais, por sempre estar presente e me transmitir segurança. Agradeço ainda pelo convívio com a pessoa ética, organizada, dedicada e apaixonada incondicionalmente pelo que faz;
Ao Prof. Dr. Marcio Ajudarte Lopes e em especial ao Prof. Dr. Alan Roger Silva, pela oportunidade de participar do OROCENTRO durante todo o período do mestrado, onde tive um aprendizado enriquecedor e pude conviver com profissionais excepcionais. Expresso aqui minha admiração e gratidão;
Aos Profs. Drs. Alan Roger dos Santos Silva, Jacks Jorge Júnior, Márcio Ajudarte
Lopes, Oslei Paes de Almeida, Pablo Augustin Vargas e Ricardo Della Coletta
das áreas de Patologia Oral e Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, que contribuíram com a minha formação, através de todos os ensinamentos;
Aos funcionários do OROCENTRO Daniele Morelli e Rogério Elias por toda receptividade e carinho;
Aos funcionários do Laboratório de Patologia e Biotério que sempre foram atenciosos e receptivos quando precisei;
Aos colegas de laboratório Ana Laura, Maurício e Iara, por toda ajuda, trocas de experiência, e momentos de descontração;
A Florence e Renato, os quais tive a oportunidade de me aproximar nesses últimos anos e que se tornaram grandes amigos. Meu muito obrigada por todos os conselhos, risadas, dramas e pelo ombro amigo nos dias difíceis. Amo vocês;
A todos os meus familiares, que sei que torcem pelo meu sucesso, em especial a minha avó Josefina, que sempre tem uma palavra de conforto e aos meus pais pelo amor incondicional;
Ao meu noivo Luiz Guilherme, por todo carinho, amizade, parceria, cumplicidade e por todos os dias demonstrar que me ama;
Aos amigos Kelly, Lucas, Mayra e Cézar, por todo apoio e incentivo e, que apesar da correria do dia-a-dia sempre arrumam tempo para estarmos juntos. A Jéssica e
Carolina, que apesar da distância sempre se fazem presentes.
As amigas Mariana e Camila, por terem sido minha família de Piracicaba, por toda convivência, conversas, risadas, conselhos e todas as comidas gostosas. Graças a vocês pude chamar nossa casa de lar.
A todos os demais colegas do programa de pós-graduação, pela convivência.
RESUMO
O carcinoma de células escamosas (CCE) oral é de grande relevância em saúde pública. Consiste na sexta neoplasia mais comum no mundo e a mais frequente na cavidade bucal, onde representa 90% de todos os casos. Os CCEs orais possuem comportamento agressivo demonstrado por metástases cervicais e recidivas frequentes. A principal modalidade para seu tratamento é a cirurgia, no entanto, pacientes em estágios avançados da doença frequentemente são inseridos em protocolos quimioterápicos. Diversos estudos têm demonstrado que a ácido graxo sintase (FASN), enzima responsável pela síntese endógena de ácidos graxos, é superexpressa em diversas neoplasias, incluindo o CCE oral. Isto se deve as maiores demandas de membranas celulares e de energia necessárias para a proliferação e sinalização celular e tem sido correlacionada com agressividade e pior prognóstico para o paciente. Por estas razões, FASN é considerada um alvo promissor para o tratamento do câncer. Orlistat (Orl) é um fármaco aprovado pelo FDA para o tratamento da obesidade e também capaz de inibir irreversivelmente a atividade de FASN. O tratamento com Orl promove parada do crescimento celular e induz apoptose em várias linhagens de cânceres humanos e em modelos de xenoenxerto e sua associação com taxanos produz efeitos sinérgicos. O objetivo deste estudo foi padronizar um modelo ortotópico de CCE de língua metastático para estudar os efeitos da associação de Orl com paclitaxel (Ptx) sobre a incidência de metástases cervicais e crescimento dos tumores primários. Células SCC-9 LN1-A ZsGreen (LN1-A) foram inoculadas na língua de camundongos BALB/c nude, os quais foram tratados com Orl (240 mg/kg), Ptx (15 mg/kg ou 30 mg/kg) ou com a associação dos dois fármacos (Orl/Ptx) por períodos experimentais de 15 ou 17 dias. Os linfonodos cervicais das cadeias mandibular medial direita e esquerda (MMD e MME), após processados, foram seccionados de maneira seriada ou semisseriada e analisados por meio de fluorescência, colorações com hematoxilina e eosina e imunoistoquímica. A associação Orl/Ptx foi superior aos tratamentos isolados e resultou em diminuição tanto do número de linfonodos metastáticos como dos volumes dos tumores primários. As metástases foram mais frequentes nas cadeias MMD e colonizaram preferencialmente a região subcapsular. Por fim, o minucioso mapeamento da disseminação metastática no presente modelo ortotópico de CCE de língua deve
servir como protocolo para experimentos futuros, com estas e outras drogas contra o CCE oral.
Palavras-chave: Carcinoma de células escamosas oral. Ácido graxo sintase. Orlistat. Paclitaxel. Modelo ortotópico. Camundongo.
ABSTRACT
Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is a major problem of public health, being the sixth most common malignant neoplasm in the world and the most common in the oral cavity (90% of all cases). OSCC has an aggressive behavior with frequent cervical metastases and local recurrences. Its main treatment modality is surgery, however, patients in advanced stages are often included in chemotherapy protocols. Fatty acid synthase (FASN), the enzyme responsible for the endogenous synthesis of fatty acids, is overexpressed in several human malignancies, including OSCC, in order to sustain cell membrane production and supply energy for proliferation and signaling. In addition, its expression has been correlated with advanced disease and worse prognosis. Orlistat (Orl) is a FDA approved drug for the treatment of obesity that is also capable to irreversibly inhibit FASN activity. Orl promotes cell growth arrest and induces apoptosis in several cancer cell lines and xenograft models. Moreover, the association between Orl and taxanes shows a clear synergistic effect against cancer cells. Here we establish an orthotopic model of metastatic tongue SCC in order to evaluate the effects of Orl and paclitaxel (Ptx), alone or associated, on the metastatic spread and primary tumor growth. SCC-9 LN1-A ZsGreen (LN1-A) cells were inoculated into the tongue of BALB/c nude mice, which were treated with Orl (240 mg/kg), Ptx (15 mg/kg or 30 mg/kg) or the combination of the both drugs (Orl/Ptx) for experimental periods of 15 or 17 days. Cervical lymph nodes of the right and left medial mandibular chains (MMD and MME) were macroscopically analysed and after histological processing sectioned in a serial or semiserial manner and observed regarding their fluorescence, hematoxylin and eosin and immunohistochemical staining. The association of Orl/Ptx was more efficient than isolated treatments, promoting a decrease in the number of metastatic lymph nodes and tumor volumes. Metastases were more frequent in in the subcapsular portion of the MMD chain lymph nodes. The meticulous mapping of OSCC metastases in our orthotopic model may be useful for future experiments with these and other anticancer drugs.
Key Words: Oral squamous cell carcinoma. Fatty acid synthase. Orlistat. Paclitaxel. Orthotopic model. Mouse.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 13
2 REVISÃO DA LITERATURA 16
2.1 Carcinoma de células escamosas (CCE) Oral 16
2.2 Paclitaxel 19
2.3 Ácido Graxo Sintase (Fatty acid Synthase – FASN, (EC 3.2.1.85))
21
2.3.1 Inibição de FASN 25
2.3.2 FASN e CCE oral 26
2.4 Orlistat (Orl): experiência prévia do nosso grupo de Pesquisa
27 2.5 Modelos xenográficos para o estudo do CCE oral 30
3 PROPOSIÇÃO 34
3.1 Objetivo geral 34
3.2 Objetivos específicos 34
4 MATERIAL E MÉTODOS 35
4.1 Aprovação do Comitê de ética 35
4.2 Cultura de células 35
4.3 Preparo dos fármacos Orlistat (Orl) e Paclitaxel (Ptx) 36 4.4 Modelo ortotópico murino de CCE de língua 36 4.5 Preparações histológicas e coloração com
hematoxilina e eosina (H&E)
41
4.6 Imunoistoquímica 41
4.7 Coloração com Oil Red O 42
5 RESULTADOS 43
5.1.1 Efeitos do Orl, Ptx e da associação Orl/Ptx sobre os tumores primários em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 1).
43
5.1.2 Avaliação da disseminação metastática regional em modelo ortotópico de CCE de língua com a linhagem LN1-A, nos grupos Ctrl, Orl, Ptx e Orl/Ptx, após 14 dias de tratamento (experimento 1).
5.1.3 Associação das técnicas de fluorescência com colorações H&E e IHC para confirmação da disseminação metastática em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 1).
50
5.1.4 Efeitos colaterais das terapias isoladas e
combinadas com Orl e Ptx em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 1).
52
5.2.1 Efeitos do Orl, Ptx e da associação Orl/Ptx sobre os tumores primários em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 2).
55
5.2.2 Avaliação da disseminação metastática regional em modelo ortotópico de CCE de língua com a linhagem LN1-A, nos grupos Ctrl, Orl, Ptx e Orl/Ptx, após 16 dias de tratamento (experimento 2).
57
5.2.3 Associação das técnicas de fluorescência com colorações H&E e IHC para confirmação da disseminação metastática em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 2).
60
5.2.4 Avaliação da quantidade de lipídios no fígado dos animais tratados com Orl, Ptx e Orl/Ptx por meio de coloração Oil Red O (experimento 2).
62
5.2.5 Efeitos colaterais das terapias isoladas e
combinadas com Orl e Ptx em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 2).
64
6 DISCUSSÃO 65
7 CONCLUSÃO 70
REFERÊNCIAS 71
APÊNDICE 1 - Média de peso dos animais que apresentaram peso crítico no desenho experimental 2.
ANEXOS
91
ANEXO 1 - Verificação de originalidade e prevenção de plágio 92
ANEXO 2 – Certificado CEUA 93
1 INTRODUÇÃO
O CCE oral é um problema relevante na saúde pública, representando a sexta neoplasia maligna mais comum no mundo e a mais frequente da cavidade oral. Ele compreende mais de 90% de todos os tumores orais e a língua é o local de ocorrência mais frequente. As recidivas e as metástases para os linfonodos cervicais são comuns e estão claramente associadas a um pior prognóstico (Moore et al., 2000; Montero e Patel, 2015; Ho et al., 2017). Atualmente, o status dos linfonodos cervicais é reconhecido como principal fator prognóstico de sobrevida global no CCEs orais (Sano e Myers, 2007). Em estágios iniciais, a cirurgia é a primeira modalidade de tratamento para os CCEs orais, no entanto, nos casos recorrentes e/ou metastáticos, a quimioterapia é frequentemente empregada, em associação ou não com a radioterapia. Os agentes platínicos, 5-fluorouracil, taxanos, metrotexato e cetuximabe são os medicamentos mais comumente escolhidos pelos oncologistas e podem ser utilizados de forma isolada ou em diferentes associações (Pulte e Brenner, 2010; Fury e Pfister, 2011; Hartner, 2018). Apesar dos inúmeros avanços em métodos diagnósticos e terapias contra o câncer, nas últimas décadas o cenário para o CCE oral não apresentou mudanças significativas, permanecendo com altas taxas de mortalidade e sobrevida em 5 anos próxima a 50% (Kumar et al., 2016; Van Dijk et al., 2016; Ho et al., 2017). Portanto, a busca por novas terapias mais efetivas do que as atuais e o desenvolvimento de modelos que possam recriar o curso clínico dos CCE orais são essenciais.
Trabalhos recentes demonstraram uma expressão aberrante da enzima ácido graxo sintase (FASN) e um consequente aumento da lipogênese nos CCEs orais e em outros tipos de câncer (Menendez e Lupu, 2007; Silva et al., 2008a). FASN é um mediador central da lipogênese neoplásica, que catalisa exclusivamente a produção de palmitato, o componente básico dos ácidos graxos de cadeia longa, sendo um mecanismo de conversão de glicose em lipídios necessários para apoiar a proliferação e sinalização das células malignas. As células tumorais têm maior dependência da lipogênese de novo que as células normais e expressam níveis mais altos de FASN (Kuhajda, 2000; Menendez e Lupu, 2007; Flavin et al., 2010). Além disto, vários estudos mostraram uma correlação entre altos níveis de expressão da FASN e estágio avançado da doença, resistência a quimioterápicos, disseminação de metástases e pior prognóstico para os pacientes (Innocenzi et al., 2003; Rossi et al., 2003;
Menendez e Lupu, 2007; Liu et al., 2008; Witkiewicz et al., 2008; Murata et al., 2010; Zeng et al., 2010; Zaytseva et al., 2012; Duan et al., 2016; Röhrig e Schulze, 2016). FASN desempenha papel importante na sinalização das células neoplásicas, incluindo produção de fosfolipídios, alteração da arquitetura das membranas, formação de jangadas lipídicas (lipid rafts) e subsequente montagem de moléculas sinalizadoras em microdomínios justapostos a membrana (Menendez e Lupu, 2007; Flavin et al., 2010). Em conjunto, as diversas funções de FASN nas células neoplásicas fazem desta enzima um alvo promissor para o tratamento do câncer.
Existem vários fármacos capazes de inibir FASN, dentre eles o orlistat (Orl), um inibidor de lipases pancreáticas e gástricas aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento da obesidade, que também é capaz de inibir irreversivelmente o seu domínio TE (Kridel et al., 2004). As propriedades antineoplásicas do Orl foram descritas em diferentes modelos animais, como os de melanoma e de cânceres de próstata, mama, colorretal e oral (Kridel et al., 2004; Carvalho et al., 2008; Chuang et al., 2011; Agostini et al., 2014; Paulmurugan et al., 2016). Estes efeitos têm sido atribuídos à interrupção do ciclo celular e ao aumento das taxas de apoptose (Carvalho et al., 2008; Chuang et al., 2011; Zecchin et al., 2011; Agostini et al., 2014; Rossato et al., 2014). Em modelo ortotópico de CCE oral desenvolvido por nosso grupo com linhagem de CCE oral metastática (SCC-9 LN-1 ZsGreen), Orl foi capaz de reduzir significativamente o número de metástases linfonodais (43%) assim como o volume dos tumores primários (Agostini et al., 2014).
Recentemente, a associação de inibidores de FASN com outros quimioterápicos, principalmente os agentes taxanos, vem sendo explorada. Heuer et al. (2017) demonstraram, em diferentes modelos xenográficos, que a inibição de FASN diminui a palmitoilação da tubulina, efeito que, quando em associação com paclitaxel, apresenta evidente sinergismo na inibição do crescimento tumoral. Souchek et al. (2017) também exploraram a inibição de FASN em conjunto com agentes antitubulínicos e demonstraram que a combinação de docetaxel com nanopartículas contendo Orl (NanoOrl) em linhagens resistentes de câncer de próstata potencializa a indução de apoptose.
Modelos animais capazes de simular o curso clínico das neoplasias malignas são essenciais para o desenvolvimento de novas terapias. Os xenoenxertos
ortotópicos murinos são frequentemente utilizados com o objetivo de reproduzir o ambiente natural do sítio anatômico no qual o tumor se origina, desenvolve e metastatiza, assim como suas interações com o estroma (Bibby, 2004; Sano e Myers, 2009; Mcmillin et al., 2013; Simons e Brayton, 2017).
O objetivo da presente pesquisa foi padronizar um modelo de xenoenxerto ortotópico de CCE de língua para avaliar os efeitos da combinação do inibidor de FASN Orl com o quimioterápico paclitaxel sobre a disseminação das metástases cervicais e progressão dos tumores primários.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Carcinoma de células escamosas (CCE) oral
O CCE oral é a sexta neoplasia maligna mais comum no mundo e a mais frequente na região de cabeça e pescoço, sendo responsável por mais de 90% do total dos casos (Montero e Patel, 2015; WHO, 2017). Para o Brasil, estima-se 11.180 novos casos de CCE oral em homens e 4.010 em mulheres para cada ano do triênio 2020-2022. Esses valores corresponderam a um risco estimado de 10,69 novos casos a cada 100 mil homens e de 3,71 para cada 100 mil mulheres, sendo o 5º e o 13º colocados, respectivamente, entre todos os cânceres (INCA, 2019). De maneira geral o CCE oral se comporta de forma agressiva e suas taxas de incidência e mortalidade diferem de um país para outro e mesmo dentro de cada país. Essas variações ocorrem, principalmente, pelas diferenças de idade, gênero, hábitos, características socioeconômicas, fatores ambientais, raça, educação preventiva e qualidade da assistência médica nas suas diversas regiões (Brener et al., 2007; Coaracy et al., 2008).
Tabaco e álcool são dois fatores de risco reconhecidos na etiologia do CCE oral e, quando combinados, apresentam efeito sinérgico. Outros fatores tem sido relacionados com a etiologia desta doença, como radiação solar (somente para os CCE de lábio inferior), imunossupressão, deficiências minerais e, recentemente, a infecção pelo papiloma vírus humano (HPV), especialmente com tipo 16, para os CCEs de orofaringe (Neville, 2016; Kumar et al., 2016; Gillison, 1999, Kaminagakura et al., 2012). Tradicionalmente, o CCE oral acomete homens entre a sexta e sétima década de vida, com hábitos de tabagismo e etilismo crônico e raramente é visto em pacientes com menos de 40 anos de idade (Montero e Patel, 2015). No entanto, nas últimas duas décadas, tem sido observado aumento da incidência neste último grupo de pacientes jovens, especialmente mulheres, que não tem exposição aos fatores de riscos clássicos da doença (Patel et al., 2011; Zhang et al., 2017). Essa mudança no perfil ainda não é completamente compreendida e requer compreensão adicional em relação à biologia do tumor, etiologia genética e patogênese (Montgomery et al., 2008; Ng, 2016).
A apresentação clínica do CEC oral é variada, as lesões podem ter caráter leucoplásico, eritoplásico e ainda ambas associadas, nos casos eritroleucoplásicos, sendo essas formas observadas nos estágios iniciais da doença, quando ainda não produziram aumento de volume e áreas ulceradas; em seus estágios mais avançados é observado um padrão de crescimento endofítico, em que as lesões apresentam ulcerações centrais com bordas elevadas e consistência firme, devido ao padrão de invasão característico do CCE oral. (Barnes et al., 2005; Bagan et al., 2010; Neville, 2016). As lesões podem surgir em qualquer região da cavidade oral, no entanto, a região com maior prevalência é a língua (Moore et al., 2000). Microscopicamente, as células dos CCE orais são caracterizadas pela presença de ilhas e cordões de células epiteliais malignas, com núcleos volumosos e hipercromáticos, figuras mitóticas, pérolas de queratina, além de pleomorfismo celular e nuclear em diferentes graus (Neville, 2016; Sloan et al., 2017).
O CCE oral é, em geral, agressivo, com propensão a invasão local (WHO, 2017) e comumente é diagnosticado em estágios avançados. Os motivos mais comuns para o diagnóstico tardio são os erros de diagnóstico e a ignorância do paciente ou do profissional, o que evidentemente diminui a chance de sobrevivência (Scott et al., 2006). As recidivas e as metástases para os linfonodos cervicais ou a distância são frequentes e estão associadas a um pior prognóstico (Montero e Patel, 2015; Ho et al., 2017). Atualmente, o status dos linfonodos cervicais é reconhecido como principal fator prognóstico de sobrevida global no CCEs orais (Sano e Myers, 2007). De fato, a presença de apenas um linfonodo metastático coloca os pacientes numa categoria de doença em estágio avançado e reduz em até 50% as taxas de sobrevida global (Cerezo et al., 1992).
O tratamento primário do câncer de boca é determinado de acordo com o estágio da doença, sendo a cirurgia base do tratamento multimodal (Omura, 2014). O estadiamento é realizado com auxílio do sistema TNM, que é uma ferramenta importante para prever a história natural da doença e principalmente o prognóstico (Mupparapu e Shanti, 2018). A doença em estágio inicial (I e II) é gerenciada com cirurgia e/ou radioterapia sem morbidade funcional significante, enquanto que para a doença em estágio avançado (III e IV) é recomendado tratamento composto por cirurgia, radioterapia e quimioterapia, para aumentar a sobrevida e melhorar a
qualidade de vida do paciente. Nos casos recorrentes e/ou metastáticos, a quimioterapia é frequentemente empregada, podendo estar associada ou não a radioterapia. Os agentes platínicos, 5- fluorouracil, taxanos, metrotexato e cetuximabe são os medicamentos mais comumente escolhidos pelos médicos oncologistas e podem ser utilizados de forma isolada ou em diferentes associações (Pulte e Brenner, 2010; Fury e Pfister, 2011; Hartner, 2018).
Apesar dos esforços e avanços para o diagnóstico precoce e também dos avanços no tratamento, com técnicas cirúrgicas radicais, uso de novos fármacos quimioterápicos e técnicas de radiação, o prognóstico do câncer oral ainda é desfavorável e possui altas taxas de mortalidade, permanecendo próximas a 50% (Kumar et al., 2016; Van Dijk et al., 2016; Ho et al., 2017).
O processo de carcinogênese oral é complexo e ainda não está totalmente esclarecido. No entanto, numerosos estudos revelam que o desenvolvimento e a progressão dessa neoplasia são induzidos por alterações epigenéticas e genéticas associadas a exposição prolongada aos fatores de risco ambientais que, em conjunto, promovem instabilidade genômica, desenvolvimento e progressão tumoral (Sadikovic et al., 2008; Irimie et al., 2018). Esses eventos estão associados a aquisição de características específicas das células neoplásicas, como autossuficiência nos sinais de crescimento, insensibilidade aos sinais inibidores de crescimento, evasão de sinais programados de morte celular (apoptose), potencial replicativo ilimitado, angiogênese sustentada, invasão tecidual e metástase. Além disto, o progresso conceitual ocorrido na última década permitiu a inclusão da capacidade de reprogramação do metabolismo e fuga a destruição imune, como importantes processos na tumorigênese (Hanahan e Weinberg, 2011; Sinevici e O’sullivan, 2016). Os processos multifatoriais e altamente complexos envolvidos na patogênese dos CCEs orais tornam difícil e desafiador o estabelecimento de terapias específicas e realmente eficientes para o tratamento dessa doença.
2.2 Paclitaxel (Ptx)
Paclitaxel (Ptx), um membro da família dos taxanos, é um fármaco com significante atividade antitumoral e o primeiro agente estabilizador de microtúbulos descrito na literatura (Yang e Horwitz, 2017). Ptx foi isolado a partir da casca da árvore Taxus brevifolia pelos Drs. Monroe Wall e Mansukh Wani e seus colaboradores, na década de 1960, os quais relataram atividade antitumoral em vários sistemas experimentais (Wani et al., 1971; Wani e Horwitz, 2014). No entanto, somente em 1992 esta droga teve o seu uso aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento do câncer de ovário e, atualmente, vem sendo utilizada como agente antineoplásico para diversos tipos de neoplasias malignas, incluindo as de mama, pulmão e de cabeça e pescoço (Perez, 1998; Johnson et al., 2004; Sparano et al., 2008; Tahara et al., 2011; Wani e Horwitz, 2014).
Microtúbulos são compostos de heterodímeros de α e β-tubulina e desempenham papel importante nas células eucarióticas. São componentes essenciais do citoesqueleto e estão envolvidos na mitose, na manutenção da forma celular, motilidade e trafego intracelular de organelas e macromoléculas (Jordan e Wilson, 2004). O mecanismo de ação de Ptx é decorrente da inibição da despolimerização dos microtúbulos, através da ligação seletiva a subunidade β da tubulina, essa ligação estabiliza o microtúbulo aumentando sua polimerização (Schiff et al. 1979; Jordan e Wilson, 2004). Isso leva a formação de um fuso mitótico inativo, que causa parada mitótica na fase G2 / M, resultando em morte celular por apoptose (Horwitz, 1992; Woods et al., 1995; Shu et al., 1997). Também já foi relatado na literatura que o Ptx restringe a angiogênese tumoral e induz a expressão de genes que levam à inibição do crescimento celular e promovem apoptose (Belotti et al., 1996; White et al., 1998; Bani et al., 2004; Schwartz, 2009). A combinação de propriedades antiproliferativas e citotóxicas acima descritas contribui para a eficácia antineoplásica do Ptx.
A atual abordagem padrão para o tratamento do CCE de cabeça e pescoço recorrente ou metastático é a combinação de cisplatina, 5-fluorouracil e cetuximabe (Vermorken e Specenier, 2010). No entanto, estudos clínicos também confirmam a eficácia do uso de Ptx para o tratamento do CCE de cabeça e pescoço, como monoterapia ou associado a outros quimioterápicos, além de ser alternativa para o
tratamento de pacientes não elegíveis para o uso de agentes platínicos (Fayette et al., 2010; Narveson et al., 2016). Em estudo clínico fase II, Kies et al. (2010) demonstraram, em CCEs de cabeça e pescoço, que a associação de cetuximabe com Ptx e carboplatina, durante seis semanas consecutivas tiveram resultados favoráveis com toxicidade moderada, sendo observadas metástases à distância em 4 de 47 pacientes com taxa de sobrevida de 91% em três anos. Como alternativa aos agentes platínicos, Hitt et al. (2012) exploraram a combinação semanal de Ptx e cetuximabe como primeira linha de tratamento para o CCE recorrente e/ou metastático de cabeça e pescoço. Estes autores observaram redução tumoral de 54%, com tempo médio de sobrevida global de 8,1 meses, sugerindo que a boa tolerabilidade e atividade da combinação Ptx/cetuximabe pode ser uma opção para pacientes em mau estado de saúde, particularmente naqueles em que a quimioterapia a base de cisplatina é contraindicada. Tahara et al. (2011) também avaliaram a eficácia e segurança da administração semanal de Ptx em pacientes com CCE de cabeça e pescoço recorrente e/ou metastático e observaram taxa de resposta geral de 29 % e tempo médio de sobrevida de 14,3 meses, com boa tolerabilidade por parte dos pacientes.
Apesar das respostas clínicas significativas nas fases iniciais do tratamento, grande parte dos pacientes desenvolve resistência ao Ptx (Yusuf et al., 2003). Assim como outros agentes quimioterápicos, a resistência a este medicamento é um obstáculo que limita o sucesso no tratamento contra o câncer. Os tumores podem ser intrinsecamente resistentes à quimioterapia ou a resistência pode ser adquirida durante o tratamento, pela exposição de células tumorais inicialmente sensíveis a droga (Holohan et al., 2013). Os mecanismos associados na resistência ao Ptx incluem alterações na estrutura da tubulina (Kavallaris et al., 1997; Martello et al., 2003), mudanças na afinidade de ligação do fármaco aos microtúbulos (Orr et al., 2003), desregulação do ciclo celular (Tan et al., 2002) e aumento da glicoproteína P, capaz de transportar a droga para o exterior da célula e diminuir sua concentração intracelular a níveis subletais (Yusuf et al., 2003).
2. 3 Ácido Graxo Sintase (Fatty Acid Synthase – FASN, (EC 3.2.1.85))
Os ácidos graxos são essenciais para todas as células vivas e têm uma ampla diversidade de funções biológicas. Como componentes de fosfolipídios, triglicerídeos e outros lipídios complexos, fornecem integridade estrutural às membranas celulares e servem como fonte de energia. No estado livre, podem atuar na transmissão de sinais intracelulares ou serem utilizados para modificar proteínas durante o processamento pós-traducional. Os ácidos graxos derivam de fontes exógenas (dieta) ou da síntese de novo mediada por FASN (Wakil, 1989; Kuhajda et al., 1994; Kumar-Sinha et al., 2003; Kridel et al., 2004).
FASN sintetiza ácidos graxos de cadeia longa usando acetil-CoA como iniciador, malonil-CoA como doador de dois carbonos e NADPH como equivalente redutor, tendo como produto final o palmitato (Kuhajda, 2000; Menendez e Lupu, 2007; Flavin et al., 2010). Palmitato é um ácido graxo saturado de 16 carbonos, componente importante das membranas celulares e precursor da maioria dos ácidos graxos não essenciais, além de ser substrato para a palmitoilação de proteínas da membrana e desempenhar papel fundamental em processos biológicos como sinalização celular, apoptose e tumorigênese (Carta et al., 2017). FASN possui duas cadeias polipeptídicas (250-270 kDa) multifuncionais, cada uma contendo sete domínios justapostos entre as extremidades amino terminal e carboxil terminal (Figura 1) na seguinte sequência: β-cetoacil-sintase (KS), malonil / acetiltransferase (MAT), desidrase (DH), enoil redutase (ER), β-cetoredutase (KR) e tioesterase (TE), além do domínio transportador representado pela proteína transportadora de acil (ACP), que interagem sequencialmente produzindo o palmitato (Smith et al., 2003; Wu et al., 2014). Embora cada monômero de FANS contenha todas as atividades necessárias para a síntese de palmitato, apenas a forma dimérica da enzima é funcional (Chirala e Wakil, 2004).
Figura 1. Desenho esquemático da enzima ácido graxo sintase (FASN) em sua estrutura
homodimérica. Estruturalmente FASN consiste em duas cadeias polipeptídicas multifuncionais idênticas, cada uma com sete domínios catalíticos: β-cetoacil-sintase (KS), malonil/acetiltransferase (MAT), desidrase (DH), enoil redutase (ER), β‑cetoredutase (KR), proteína transportadora de acila (ACP) e tioesterase (TE). A FASN adota uma estrutura em forma de “X” com um conjunto completo de locais ativos drogáveis presentes em cada uma das duas 'câmaras de reação' semicirculares em ambos os lados da molécula. Orl atua sobre o sitio catalítico TE.
Fonte: Modificado a partir de Liu et al., 2010
Na maior parte dos tecidos normais, a expressão de FASN é baixa ou ausente, pois os lipídios provêm principalmente da dieta. Exceções incluem casos em que mais intensa lipogênese é necessária, como no fígado, no tecido adiposo, no tecido das glândulas mamárias durante a lactação, no endométrio durante sua fase proliferativa e nos pulmões dos recém-nascidos (Kuhajda, 2000; Menendez e Lupu, 2007). No entanto, o oposto é observado em neoplasias malignas em franco crescimento, nas quais a maior parte dos ácidos graxos, necessários para o suprimento energético e síntese de membranas celulares são fornecidos pela síntese de novo, independente dos níveis de lipídios circulantes (Kuhajda, 2000; Kridel et al., 2004; Menendez e Lupu, 2007).
A ligação entre câncer e alterações metabólicas não é recente. Em meados do século passado, Otto Warburg observou as primeiras alterações metabólicas na indução da tumorigênese e aquisição do fenótipo maligno, quando detectou que a
produção de energia nas células neoplásicas é anormalmente dependente da glicólise aeróbica, fenômeno que ficou conhecido como “efeito Warburg” (Warburg, 1956; Vander Heiden et al., 2009). De fato, os níveis elevados do consumo de carbono por meio da glicólise aeróbica são fundamentais na obtenção do fenótipo maligno, pois proporciona ao microambiente tumoral vantagens seletivas para as células em proliferação (Garber, 2004; Shaw, 2006). Outra característica metabólica importante na progressão das neoplasias malignas é a elevada taxa de consumo energético nos processos de síntese de proteínas e de DNA (Clemens, 2004; Averous, J; Proud, 2006). Paralelamente, aumento de atividade da via anabólica lipogênica mediada por FASN leva a um aumento na síntese de ácidos graxos nas células malignas (Kuhajda, 2000).
A primeira associação da expressão da FASN com o câncer foi identificada em tumores de mama em 1994, quando esta enzima foi chamada de antígeno oncogênico 519 ou OA-519 (Kuhajda et al., 1994). Desde então, a superexpressão de FASN foi demonstrada em vários outros tipos de câncer, incluindo de pâncreas, cólon e reto, ovário, mama, melanoma, próstata e CCE oral (Swinnen et al., 2002; Ogino et al., 2007; Liu et al., 2008; Grunt et al., 2009; Silva et al., 2010; Zecchin et al., 2011; Bian et al., 2015). Em muitos destes trabalhos, níveis mais altos de FASN se correlacionaram com agressividade tumoral, resistência a quimioterápicos, disseminação de metástases e pior prognóstico (Innocenzi et al., 2003; Rossi et al., 2003; Menendez e Lupu, 2007; Liu et al., 2008; Witkiewicz et al., 2008; Murata et al., 2010; Zeng et al., 2010; Zaytseva et al., 2012; Duan et al., 2016; Röhrig e Schulze, 2016).
A regulação da expressão de FASN no câncer é complexa e pode envolver o controle transcricional por meio de fatores de crescimento (EGFR, ErbB2) ou hormônios esteróides (estrogênio, progesterona e andrógeno), que interagem e ativam as vias de sinalização PI3K-AKT (fosfatidilinositol-3-quinase) e MEK-EKR1/2 (Mitogen-activated protein / Proteína ERK ativada por mitógeno) que estimulam a expressão de FASN por meio das proteínas SREBP1c (Sterol regulatory element binding protein 1c), que interagem com promotor do gene FASN (Figura 2A) (Yang et al., 2003; Menendez e Lupu, 2007; Flavin et al., 2010; Guo et al., 2015). O controle pós-traducional por meio de enzimas desubiquitinantes podem também contribuir para a regulação positiva da expressão de FASN nas células malignas (Menendez e Lupu,
2007; Flavin et al., 2010). Graner et al. (2004), em linhagem de câncer de próstata LNCaP, demostraram que a isopeptidase USP2a (Ubiquitin-specific protease 2a) interage e estabiliza a proteína FASN, evitando sua degradação proteossômica (Figura 2B). Por fim, fatores microambientais também podem exercer influência regulatória sobre FASN (Flavin et al., 2010). Os tumores sólidos são comumente caracterizados por um microambiente fisiopatológico único, caracterizado por hipóxia, pH ácido e escassez de nutrientes, que ativa vias de sinalização intracelular que favorecem a progressão tumoral (Mashima et al., 2009).
Figura 2. Regulação da expressão de FASN no câncer. (A) fatores de crescimento (FC) ou
hormônios esteroides (E) interagem com seus respectivos receptores (RFC ou RE) e levam à ativação a jusante das vias PI3K / AKT ou MECK/EKR1/2. Ambas as vias de transdução regulam a expressão de FASN através da modulação da expressão de SREBP-1c, a qual interage com o sitio de ligação do complexo SREBP no promotor do gene FASN. (B) A superexpressão de FASN nas células neoplásicas também pode ser alcançada no nível pós-traducional por meio da interação com USP2a, uma protease específica da ubiquitina pré-proteasomal que, ao remover a ubiquitina da FASN, estabiliza fortemente a enzima.
Fonte: Modificado a partir de Menendez e Lupu, 2007; Flavin et al., 2010.
Devido a variação na expressão de FASN entre células normais e células neoplásicas, esta enzima tornou-se um potencial alvo terapêutico para o tratamento do câncer (Schrijver et al., 2003; Liu et al., 2010). Estudos farmacológicos mostraram que o bloqueio farmacológico de FASN ou seu “knockdown” induz apoptose e reduz
a proliferação celular (Menendez e Lupu, 2007). Além disto, FASN tem sido referida como uma oncoproteína metabólica devido sua relação com o desenvolvimento e progressão de células tumorais (Flavin et al., 2010; Duan et al., 2016).
2.3.1 Inibição de FASN
Diversos inibidores naturais ou sintéticos da FASN têm sido descritos na literatura científica dos últimos anos, com propriedades antiproliferativas e antitumorais importantes. Apesar dos mecanismos responsáveis pelos efeitos antitumorais da inibição da FASN não serem totalmente esclarecidos, acredita-se que com a escassez endógena de ácidos graxos ocorre acúmulo intracelular tóxico de malonil-CoA, dificuldade de formação de novas membranas celulares necessárias para a proliferação, assim como a desativação de redes de transdução de sinal pela ruptura da estrutura dos domínios da jangada lipídica (lipid rafts), que em conjunto inibem o crescimento tumoral (Bandyopadhyay et al., 2006; Angeles e Hudkins, 2016).
A relevância de FASN como um alvo para o tratamento oncológico tem sido sugerida por experimentos com siRNAs e pequenas moléculas, com variados mecanismos bioquímicos e perfis de seletividade, que inibem a fosforilação de AKT, induzem apoptose, sensibilizam células tumorais resistentes à quimioterapia e são capazes de inibir o crescimento de xenoenxertos de camundongos (Schrijver et al., 2003; Kridel et al., 2004; Puig et al., 2008, 2009; Tomek et al., 2011; Zheng et al., 2016).
Dentre os inibidores de FASN mais estudados estão a cerulenina, c75 e o orlistat, que em estudos pré-clínicos foram capazes de promover a parada do crescimento celular e induzir apoptose em várias linhagens de câncer e modelos de xenoenxerto. No entanto, nenhum destes compostos foi testado clinicamente devido a limitações conferidas por suas propriedades farmacológicas ou efeitos colaterais, que limitariam sua aplicação e desenvolvimento clínico (Jones e Infante, 2015).
Uma nova geração de moléculas, incluindo GSK2194069, JNJ-54302833, IPI-9119, Fasnall, TVB-3166 e TVB-2640 está em desenvolvimento, mas destas, apenas o TVB-2640 já encontra-se em testes clínicos (Jones e Infante, 2015; Menendez e Lupu, 2017). O TVB-2640 é o primeiro inibidor oral, seletivo, potente e reversível de FASN aprovado para testes em humanos. Quando administrado em combinação com Ptx, esta droga promoveu resposta parcial em um paciente com
carcinoma seroso do peritônio, sendo observado 42 % de redução no diâmetro da lesão e 58 % de queda nos níveis do antígeno CA-125. Além disso, foi observado doença estável prolongada em pacientes com carcinoma pulmonar de células não pequenas (24 semanas) e com câncer de mama (20 semanas). Por fim, o mesmo estudo demonstrou níveis aumentados de malonil carnitina, um derivado de malonil-coA e diminuição de tripalmitina, um derivado de palmitato, efeitos consistentes com a inibição da FASN (Arkenau et al., 2015).
2.3.2 FASN e CCE Oral
Krontiras et al. (1999), por meio de estudos imunoistoquímicos, foram os primeiros autores a descrever a expressão de FASN em CCE orais. Neste estudo foi demonstrado que a expressão de FASN é maior nos CCEs orais e no epitélio displásico do que no epitélio adjacente normal e que, ao contrário das outras neoplasias malignas, sua maior expressão está associada ao maior grau de diferenciação celular dos CCEs orais. Estudo realizado em nosso laboratório explica, pelo menos em parte, este fenômeno com base no fato de FASN estar envolvida na diferenciação dos queratinócitos. Segundo esta pesquisa, maior expressão de FASN visualizada nos CCE orais bem diferenciados se dá pela sobreposição das atividades enzimáticas relacionadas com a proliferação celular e produção de queratina, fazendo com que estes sejam ainda mais positivos que sua contraparte pouco indiferenciada (Silva et al., 2008a). O papel de FASN na proliferação celular de diferentes linhagens de CCEs orais foi demonstrado por Agostini et al. (2014), que por meio da inibição específica desta enzima observaram redução significante no crescimento celular. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a expressão de FASN está correlacionada com o grau histológico, presença de permeação linfática, infiltração perineural e linfonodos metastáticos, sugerindo uma relação entre FASN e a progressão e prognóstico dos CCEs orais (Silva et al., 2008c).
Evidências experimentais comprovaram a existência de uma conexão direta entre a expressão do receptor de superfície celular ErbB2 e FASN em células malignas (Menendez et al., 2004b; c). Silva et al. (2004) analisaram 62 casos de CCE de cabeça e pescoço e, com o auxílio de reações de imunoistoquímica, detectaram expressão simultânea de FASN e de ErbB2 em 70% dos tumores estudados e sugeriram que ErbB2 regula a produção de FASN também nos CCEs de cabeça e
pescoço. Posteriormente, os mesmos autores analisaram amostras de CEC de língua bem diferenciados e pouco diferenciadas, descrevendo nos tumores bem diferenciados correlação significativamente positiva entre a expressão de FASN e ErbB2 na membrana celular. Nos CCE pouco diferenciados foi observada correlação inversa entre a expressão de FASN e ErbB2 citoplasmático, o que foi associado a taxas de sobrevida e recorrência significativamente menores (Silva et al., 2008b).
Estudo realizado com amostra de CCEs orais microdissecados a laser, demonstrou que a expressão de ErbB2, FASN e USP2a foi maior no tecido tumoral do que no epitélio normal adjacente, o que foi associado a presença de linfonodos regionais metastáticos (Silva et al., 2009). Adicionalmente, Silva et al. (2010), avaliaram os padrões de expressão dos receptores da família ErbB (ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4) e de FASN em CCEs de cabeça e pescoço com comportamento agressivo e observaram que tanto os membros da família ErbB e FASN são altamente expressos em amostras de CCEs de cabeça e pescoço oriundas de tumores agressivos. Esses autores avaliaram ainda a co-expressão entre os receptores ErbB e mostraram que ErbB2 é preferencialmente co-expresso com os membros da família ErbB e que FASN é mais expressa nas metástases pulmonares do que nos respectivos tumores primários.
Nosso grupo também demonstrou previamente que, a inibição farmacológica de diferentes domínios de FASN com triclosan, orlistat ou C75 leva a parada do ciclo celular na fase G0/G1 e concomitante aumento das taxas de apoptose, além de diminuir a migração, invasão e adesão celular em linhagem celular derivada de CCE oral (Teixeira IF, 2017; Boelcke WP, 2019). Agostini et al. (2014), em linhagem de CCE oral com fenótipo metastático (SCC-9 ZsGreen LN-1), demonstrou que a inibição de FASN com orlistat reduz a proliferação e migração, promove apoptose e estimula a produção da isoforma antiangiogênica VEGFA165b. Neste mesmo estudo, foi demonstrado in vivo que a inibição de FASN com orlistat é capaz de restringir o crescimento tumoral e a disseminação metastática para linfonodos regionais em modelo ortotópico. Considerados em conjunto, estes dados reforçam o potencial da inibição de FASN para o manejo dos CCEs orais.
2.4 Orlistat (Orl): experiência prévia do nosso grupo de pesquisa.
Orlistat (Orl) ou tetrahidrolipstatina (Figura 3) é um fármaco amplamente utilizado para o tratamento da obesidade, aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA). Orl atua localmente na parede do trato gastrointestinal promovendo a inibição seletiva das lipases gástricas e pancreáticas, o que resulta na menor absorção de gordura da dieta e consequentemente maior excreção de gordura pelas fezes (Guerciolini, 1997). Orl também é capaz de inibir irreversivelmente o domínio tiosterase (TE) da FASN por formar um aduto covalente com a serina ativa deste domínio, o que foi demonstrado em estrutura cristalina (Pemble et al., 2007; Flavin et al., 2010).
Figura 3. Estrutura química do Orl
Fonte: Modificado a partir de Kridel et al., 2004
Kridel et al. (2004) foram os primeiros a identificar Orl como um potente inibidor da FASN em estudo proteômico com enzimas específicas do câncer de próstata. Neste estudo, Orl mostrou atividade antiproliferativa em várias linhagens celulares de câncer de próstata, tanto in vitro como in vivo, além de induzir a morte celular específica de células tumorais, com pouco ou nenhum efeito sobre células normais. Os efeitos antiproliferativos e antitumorais de Orl também foram observados em diversas outras linhagens celulares, incluindo as de câncer de mama, ovário, cólon, gástrico, pâncreas, melanoma, retinoblastoma, linfomas de células T e CCE de
cabeça e pescoço (Menendez et al., 2005b; Carvalho et al., 2008; Dowling et al., 2009; Chuang et al., 2011; Huang et al., 2012; Kant et al., 2012; Vandhana et al., 2013; Agostini et al., 2014; Sokolowska et al., 2017).
Nosso grupo de pesquisa também vem apresentando resultados antineoplásicos consistentes com Orl em linhagens de melanoma e CCE oral. Carvalho et al. (2008) demonstraram que Orl reduz em 52% as metástases espontâneas em linfonodos mediastinais em modelo experimental de melanoma criado pela injeção intraperitoneal de células B16-F10 em camundongos C57BL/6. Neste estudo, Orl foi também capaz de diminuir significativamente a proliferação celular e promover apoptose na mesma linhagem de melanoma murino. Adicionalmente, Zecchin et al. (2011), investigou os mecanismos biológicos responsáveis pela apoptose induzida pela inibição da FASN nestas células e demonstrou que Orl reduz significativamente a proliferação e provoca apoptose, por ativar as caspases -9 e -3 e liberar citocromo C, independente da ativação de p53 e da transição da permeabilidade mitocondrial (TPM). Por meio de ensaios de colonização pulmonar, provocada pela inoculação de células B16-F10 nas caudas de camundongos C57BL/6, foi observada uma redução superior a 50% no número das metástases pulmonares naqueles animais tratados com Orl (Seguin et al., 2012). Nesta pesquisa, Orl também foi capaz de reduzir o processo de angiogênese peritumoral em melanomas experimentais cutâneos,de reduzir a viabilidade e a proliferação de células endoteliais RAEC, bem como a formação de estruturas similares a capilares sanguíneos por estas últimas. Ainda neste estudo, foi observado que a indução da formação de capilares pelas células RAEC por células tumorais foi reduzida pela exposição ao Orl e que esta droga é capaz de estimular a produção de VEGFA total e de suas isoformas VEGFA121, 165, 189 e 165b em células de melanoma
humano (SK-MEL-25) e células SCC-9. De maneira semelhante, Bastos et al. (2017) demonstraram que Orl reduz a linfangiogênese in vitro. Neste estudo, além da inibição da formação de capilares linfáticos, houve redução da viabilidade, proliferação e migração das células endoteliais linfáticas (HDLEC). Em modelo animal, estes autores verificaram ainda que o volume de metástases em linfonodos cervicais de camundongos portadores de melanomas experimentais B16-F10 foi reduzido em aproximadamente 39% nos animais tratados com Orl, assim como a expressão de VEGF-C nesses tecidos. Com linhagem de CCE oral, Agostini et al. (2014)
observaram que este medicamento é capaz de reduzir o número de metástases linfonodais (43%) e o volume dos tumores primários em modelo ortotópico de CEC de língua padronizado em nosso laboratório.
A associação de Orl com outros agentes quimioterápicos, principalmente os taxanos, vem sendo recentemente bastante explorada. Estudos mostram que a inibição da FASN com o Orl reduz significamente a palmitoilação da tubulina, de modo que a organização interrompida dos microtúbulos nas células tumorais seja uma consequência adicional da inibição da FASN, quando em associação com agentes taxanos (Schcolnik-Cabrera et al., 2018). Souchek et al. (2017) realizaram a combinação de docetaxel com nanopartículas contendo Orl (NanoOrl) em linhagens resistentes de câncer de próstata e demonstraram que a associação dos dois fármacos teve efeito sinérgico na indução de apoptose. Além disto, o efeito sinérgico entre NanoOrl e docetaxel foi independente dos efeitos da Glicoproteina P, superexpressa nessas células.
Apesar dos potentes efeitos de Orl como agente antineoplásico e de sua utilidade como ferramenta para os estudos de inibição farmacológica de FASN, existem limitações que dificultam seu uso sistêmico em humanos, dentre elas sua baixa permeabilidade celular, baixa solubilidade, falta de seletividade, baixa biodisponibilidade oral e baixa estabilidade metabólica (Flavin et al., 2010).
2.5 Modelos xenográficos para o estudo do CCE oral
O desenvolvimento de modelos animais in vivo que recapitulam a história natural dos cânceres humanos e sua resposta clínica à terapia constituem um pré-requisito importante para a aplicação de terapias antineoplásicas que se mostraram promissores em modelos in vitro. Vários modelos animais foram desenvolvidos para estudar a patogênese, etiologia e novas terapias contra o câncer. Embora nenhum modelo único possa recapitular todos os aspectos desta doença, as informações obtidas em modelos animais são essenciais para o avanço do tratamento e diagnóstico (Ballegeer et al., 2013; Supsavhad et al., 2016).
O camundongo como modelo para a pesquisa das neoplasias humanas já provou ser uma ferramenta útil, pois apresenta várias características anatômicas, celulares e moleculares semelhantes às dos seres humanos, que são críticas para o
desenvolvimento neoplásico. Além do mais, cerca de 99 % dos genes de camundongos têm um homólogo no genoma humano (Waterston et al., 2002), o que proporciona um excelente sistema experimentalmente tratável como ferramenta para investigar mecanismos básicos e tratamentos para o câncer (Ogilvie et al., 2017).
Numerosos modelos murinos foram desenvolvidos para estudar o câncer humano, sendo os xenoenxerto derivados de linhagens celulares de tumores humanos os mais amplamente explorados (Jung, 2014; Szadvari et al., 2016). Nestes, células tumorais são transplantadas em camundongos nude atímicos, com deficiência de células T, ou em camundongos com deficiência imune combinada grave (SCID). Estas deficiências no sistema imunológico permitem que as linhagens celulares humanas estabelecidas in vitro sejam propagadas por vias ectópicas ou ortotópicas, reconstituindo tumores sólidos sem risco de rejeição por parte do animal hospedeiro (Povlsen e Rygaard, 1972; Morton e Houghton, 2007). Os estudos típicos de xenoenxerto envolvem injeção subcutânea de células humanas retiradas da cultura in vitro de uma linhagem celular humana imortalizada em camundongos nude (xenoenxerto ectópico). Estes inóculos subcutâneos geralmente crescem rapidamente e formam tumores relativamente síncronos, com períodos de latência de duplicação curtos (Szadvari et al., 2016; Simons e Brayton, 2017). Porém, embora este tipo de modelo experimental seja relativamente fácil de operar e tecnicamente simples, não é o mais relevante para ensaios pré-clínicos pois o local transplantado é diferente da origem anatômica das células cultivadas. Sendo assim, eles não reproduzem o sítio primário do tumor e não compartilham as mesmas vias de propagação de metástases (Johnson et al., 2001; Francia et al., 2011; Jung, 2014). Estes argumentos têm sido usados para explicar por que muitos compostos terapêuticos que mostraram atividade promissora em xenoenxertos subcutâneos não foram reproduzidos em ensaios clínicos (Suggitt e Bibby, 2005).
Os xenoenxertos ortotópicos são utilizados para reproduzir o ambiente natural do órgão em que o tumor se origina, cresce e metastatiza, assim como as interações estromais, por meio da inoculação das células no órgão ou tecido de origem (Bibby, 2004; Sano e Myers, 2009; Mcmillin et al., 2013; Simons e Brayton, 2017). Os primeiros modelos de xenoenxerto murino de CCE oral foram realizados por via subcutânea, mas os resultados obtidos não justificaram ensaios clínicos (Sano e Myers, 2009). Esta falta de correlação pode estar correlacionada ao fato de que na
clínica trata-se com quimioterapia, em geral, a doença na sua forma avançada e/ou metastática (Sano e Myers, 2009). Uma série de investigações de Isaiah J. Fidler e outros pesquisadores, no final do século passado, demonstraram que a metástase não é um fenômeno aleatório e sim específico (Fidler e Hart, 1982), e que os padrões metastáticos em modelos animais são dependentes do local da injeção das células, achados que foram precursores da criação dos modelos "ortotópicos" (Talmadge et al., 2007).
Diversos modelos ortotópicos foram descritos como ferramentas úteis no estudo do CCE oral. Dinesman et al. (1990) implantaram células tumorais no assoalho da boca por uma via submandibular em camundongos nude e relataram que 5% dos camundongos apresentaram metástases linfonodais e 40% tiveram metástases pulmonares, corroborando a hipótese de que modelos ortotópicos reproduzem efetivamente as vias de metástase que ocorrem nos humanos. Shuichi Kawashiri e colaboradores descreveram modelo ortotópico de CCE oral que apresentou alta incidência de metástases nos linfonodos cervicais após a inoculação das células na língua (Kawashiri et al., 1995, 1999). Myers et al. (2002) também estabeleceram modelos ortotópicos de CCE de língua pela injeção de linhagens celulares humanas na língua de camundongos nude, o que levou ao desenvolvimento de colonização em linfonodos cervicais e metástases pulmonares. Neste mesmo trabalho, os autores descobriram que a passagem em série dos linfonodos, após isolamento das células metastáticas dos linfonodos cervicais, resulta em linhagens mais metastáticas do que a parental. Por fim, estes autores demonstraram que a capacidade tumorigênica das células de CCE oral é maior quando estas são injetadas na língua do que sob a pele dos camundongos (Myers et al., 2002). Em nosso grupo de pesquisa, Agostini et al. (2014) desenvolveram um modelo metastático de CCE oral que permite a localização dos linfonodos afetados por fluorescência. Estes autores transfectaram o gene que codifica a proteína verde fluorescente ZsGreen em células de CCE oral SCC-9 e as inocularam nas patas dianteiras de camundongos BALB/c nude. Após metastatizarem para os linfonodos da cadeia axilar, as células foram recolocadas em cultura e então inoculadas ortotopicamente na língua de novos camundongos. Nestes, ocorreu disseminação rápida para os linfonodos regionais e tanto as metástases e como os tumores primários puderam ser analisados com auxílio de microscópio de epifluorescência. Neste modelo, o fenótipo metastático agressivo simula a doença
humana em seus estágios avançados e constitui uma ferramenta para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento do CCE oral.
Os modelos de xenoenxerto ortotópico também apresentam desvantagens. Por exemplo, podem ser tecnicamente complexos para padronizar e causar morbidade nos animais animal e até mesmo morte. Além disto, em localizações ortotópicas internas pouco acessíveis pode ser difícil avaliar a eficácia de tratamentos antitumorais de maneira contínua, sem o auxílio de exames de imagem (Bibby, 2004; Sano e Myers, 2009). Estas últimas limitações não ocorrem em CCE de língua, pois estas podem ser acessadas com relativa facilidade (Sano e Myers, 2009).
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos da terapia combinada entre o inibidor de FASN orlistat com o quimioterápico paclitaxel, em modelo de xenoenxerto ortotópico de língua, com utilização de linhagem de CCE oral metastática (SCC-9 LN1-A ZsGreen). Mapeamento da disseminação metastática linfonodal em modelo ortotópico de CCE de língua com a associação das técnicas de fluorescência, histoquímica e imunoistoquímica.
3.2 Objetivos específicos
3.2.1 Avaliar in vivo os efeitos das terapias com orlistat, paclitaxel e com orlistat/paclitaxel em relação a disseminação metastática e a progressão do tumor primário.
3.2.2 Analisar as cadeias linfonodais cervicais suscetíveis a disseminação de metástases no modelo ortotópico de CCE de língua.
3.2.3 Confirmação dos focos metastáticos com a associação das técnicas de fluorescência, histoquímica e imunoistoquímica em modelo ortotópico de CCE de língua.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Aprovação do Comitê de ética
Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as regulamentações de ética em pesquisa animal, diante de aprovação prévia do Comitê de Ética em Experimentação Animal - CEUA / UNICAMP, sob os protocolos 4922-1/2018 e 4922-1(A) 2019.
4.2 Cultura de células
Células SCC-9 ZsGreen LN1-A (LN1-A), linhagem metastática de CCE oral previamente isolada por nosso grupo, foram utilizadas nesta pesquisa. As células LN1-A foram obtidas a partir das células SCC-9 (American Type Culture Collection; ATCC) transfectadas com a proteína verde fluorescente ZsGreen (Agostini et al., 2014) e posteriormente transplantadas na pata dianteira de camundongos atímicos BALB/c nude, o que induziu a formação de metástases em linfonodos axilares, que por sua vez foram coletadas e cultivadas pelo método dos explantes dando origem à linhagem LN1-A (Moreira FS, 2017). As células LN1-A foram cultivadas em frascos plásticos de 75 cm² (Corning, E.U.A) com meio de cultura DMEM/F12 (Invitrogen, E.U.A) enriquecido com 10 % de soro fetal bovino (FBS, Cultilab, Brasil), 400 ng/ml de hidrocortisona (succinato sódico de hidrocortisona – Eurofarma, Brasil) e solução antibiótica e antimicótica (Invitrogen) na diluição de 1:100 a 37 °C em atmosfera contendo 5 % de CO2 e 95 % de umidade.
Quando as células atingiram aproximadamente 70 % de confluência, o meio de cultura foi removido e estas lavadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4), e incubadas com tripsina-EDTA (0,25 %) a 37 C° por no máximo 5 minutos, até liberação total das células do assoalho dos frascos, o que foi determinado por meio de visualização em microscópio de contraste de fase. A ação da tripsina foi interrompida pela adição de 10 ml de meio de cultura enriquecido com 10 % de FBS, as suspensões de células transferidas para tubos estéreis de 15 ml (Kasvi, Brasil) e centrifugadas a 220 xg durante três minutos. Após centrifugação, os sobrenadantes foram removidos e os pellets ressuspendidos em 5ml de meio de cultura contendo 10 % de FBS, as células contadas com auxílio de uma câmara de Neubauer e re-plaqueadas em novos frascos de cultura celular. Os meios de cultura foram substituídos a cada 48 horas. Todos os procedimentos foram realizados dentro
de fluxo laminar e as células testadas para verificar possível contaminação por Mycoplasma spp., por meio de reações em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction - PCR), previamente aos experimentos.
4.3 Preparo dos fármacos Orlistat (Orl) e Paclitaxel (Ptx)
As soluções de Orlistat foram preparadas a partir de cápsulas (Orlistate®, Neoquímica, Brasil), de acordo com Kridel et al. (2004). Para isto, estas foram dissolvidas em 1mL de etanol a 33 % (diluído em PBS) e agitadas em vórtex por três vezes em intervalos de 10 minutos, durante os quais a solução foi mantida em agitação. Em seguida, a solução foi centrifugada a 12.000 xg durante cinco minutos a 4 °C. O sobrenadante foi coletado, filtrado, e então realizadas alíquotas com a quantidade de droga necessária para cada dia de tratamento, as quais foram armazenadas em ultrafreezer a -80 °C. O fármaco Ptx (Ontax® 30 mg, Libbs, Brasil) foi obtido na forma de frasco-ampola e diluído em PBS antes de sua utilização.
4.4 Modelo ortotópico murino de CCE de língua
Foram obtidos 65 camundongos BALB/c nude machos, com cinco semanas de vida, provenientes do biotério da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP). Os animais foram mantidos em mini-isoladores, com no máximo cinco por isolador, os quais foram acoplados em rack ventilado (Alesco) durante todo o período experimental. Os animais foram alimentados com ração Labina (Presence, antiga Purina), previamente autoclavada, assim como a água e a maravalha, esta última totalmente substituída a cada dois dias. Toda a manipulação dos animais foi realizada dentro de fluxo laminar previamente esterilizado com luz ultravioleta por no mínimo 20 minutos.
Entre a sexta e sétima semanas de vida, 1x105 células LN1-A, suspendidas em 20 μL de DMEM/F12 (Invitrogen, E.U.A), foram inoculadas na borda lateral direita da língua de cada camundongo com auxílio de seringa de insulina de 0,5 ml e agulha de calibre 30G (BD Ultra-Fine II). Os camundongos foram previamente anestesiados com ketamina (Dopalen ®) e xilazina (Anasedan ®), nas doses de 100 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. Em seguida, os animais foram distribuídos aleatoriamente entre os seguintes grupos experimentais: Controle (Ctrl), Orlistat (Orl), Paclitaxel (Ptx) e Orlistat + Paclitaxel (Orl/Ptx), contendo 7, 8 ou 9 animais cada. Dois desenhos experimentais distintos foram realizados (Figuras 5 e 6). O primeiro teve duração de
15 dias e os animais dos grupos Ptx e Orl/Ptx receberam um ciclo de Ptx (30 mg/kg) (Almeida LY, 2015) no 5° dia de tratamento. No segundo, o período experimental foi de 17 dias e foram feitas três aplicações de Ptx (15 mg/kg) nos 5°, 10° e 15° dias de tratamento, respectivamente. Os animais do grupo Ctrl receberam injeções intraperitoneais diárias de ETOH 33 % (diluído em PBS) e os do grupo Orl receberam injeções, também diárias e pela mesma via, de Orl (240 mg/kg) durante 14 ou 16 dias, dependendo do desenho experimental. Além dos ciclos com Ptx, os animais do grupo Orl/Ptx receberam também injeções diárias de Orl (240 mg/kg) durante o período experimental correspondente (14 ou 16 dias).
Inicialmente, as doses de cada droga aqui utilizada foram calculadas a partir das médias de peso dos camundongos de cada grupo e, posteriormente, passaram a ser calculadas individualmente para cada camundongo, os quais tiveram seus pesos mensurados em dias intercalados. Os animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia seguido de deslocamento cervical, após 15 ou 17 dias decorridos do início do tratamento, ou quando apresentaram perda de peso maior do que 20 %.
Após a eutanásia, coletamos as línguas e os linfonodos cervicais das cadeias mandibulares mediais e laterais dos lados direito e esquerdo (Figura 4), os quais foram imediatamente fixados em formol a 10 % por 12 a 36 horas. Parte dos fígados (porção inferior direita do lobo lateral esquerdo) foi imediatamente congelada em OCT Compound (Scigen Scientific Gardena, E.U.A) para posterior corte por congelação e coloração com Oil Red O. As línguas com os tumores primários foram observadas e documentadas no equipamento de fotodocumentação com câmara escura (Alliance-2.7-Uvitec), sob exposição de luz azul. Os linfonodos, após fixados, foram avaliados e fotografados em microscópio de epifluorescência (Nikon, Eclipse Ti) em aumento de 25X, para a avaliação da presença de metástases. As áreas afetadas pelos tumores primários e focos metastáticos foram avaliadas com auxílio do software Image J (National Institutes of Health, E.U.A.). Os volumes dos tumores primários foram determinados com o auxílio da fórmula V= Comprimento x Largura² x 0,52.
Figura 4 – Imagem representativa da topografia dos linfonodos cervicais de camundongo BALB/c nude
em modelo ortotópico de CCE de língua. As cadeias mandibulares mediais direita e esquerda (MMD e MME) estão localizadas na borda caudal da mandíbula logo acima da glândula submandibular (GSM). Já os linfonodos mandibulares laterais direito e esquerdo (MLD e MLE) estão do lado caudolateral dos linfonodos mandibulares mediais e incorporados na glândula parótida (Kawashima et al., 1964). No detalhe, foco metastático evidenciado pela presença da proteína ZsGreen (verde) nas células tumorais.
Figura 5 – Desenho experimental 1. Tratamentos realizados nos grupos controle (Ctrl), orlistat (Orl), paclitaxel (Ptx) e orlistat + paclitaxel (Orl/Ptx), 24 horas
após inoculação ortotópica das células LN1-A na língua de camundongos BALB/c nude. Os grupos Ctrl e Orl receberam injeções intraperitoneais (IP) diárias de ETOH e Orl a 240 mg/kg, respectivamente. O grupo Ptx recebeu injeções IP de Ptx (30 mg/kg) no 5º dia de tratamento e os animais do grupo Orl/Ptx, além de receberem injeções IP diárias de Orl (240 mg/kg) também receberam injeções IP de Ptx (30 mg/kg) no 5° dia de tratamento.
