Efeitos colaterais das terapias isoladas e combinadas com Orl e Ptx em modelo ortotópico de CCE de língua (experimento 2).

Todos os camundongos estudados tiveram seus pesos mensurados no dia da inoculação ortotópica das células LN1-A, o que foi repetido a cada 2 dias (Figura 20) para o cálculo das doses e o controle de saúde geral dos animais.

Figura 20 – Média de peso corporal dos camundongos BALB/c nude incluídos no modelo ortotópico de

CCE de língua após 16 dias de tratamento e limite de perda de peso considerado indicação para eutanásia (linha pontilhada). Observamos perda de peso dos grupos Ctrl e Orl próximo ao 14 ° dia do período experimental (A e B). Os grupos Ptx e Orl/Ptx apresentaram padrão de peso relativamente constante, com pequenas oscilações (C e D). Dados referentes ao experimento 2.

Ao contrário do que aconteceu no experimento 1, não houve dificuldade na aplicação de Ptx (15 mg/kg) nos 5°, 10° e 15° dias pois a redução da dose deixou a solução menos viscosa. Além disto, não notamos nenhum efeito adverso, imediato ou tardio, nos dias subsequentes ao tratamento. Por outro lado, observamos que alguns animais dos grupos que não receberam Ptx começaram a perder peso por volta do 14 ° dia do período experimental, atingindo o limite máximo de 20 % de perda (apêndice 1) segundo o “Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook – IACUC”. É possível especular que esta perda se deve a progressão mais acelerada do tumor primário nos grupos Ctrl e tratados isoladamente com o Orl, pois fato semelhante não ocorreu nos grupos tratados com Ptx ou com a associação Orl/Ptx. Por esta razão decidimos encerrar o experimento no 17° dia do período experimental (alguns dias antes do inicialmente planejado).

6 DISCUSSÃO

Recentemente, Hanahan e Weinberg (2011) revisaram os hallmarks do câncer e incluíram a reprogramação do metabolismo energético como uma característica importante no desenvolvimento das neoplasias malignas e como possível alvo terapêutico. Seguindo essa linha de raciocínio, vários grupos de pesquisa têm demonstrado que a lipogênese é aumentada no câncer para satisfazer as demandas de maior biogênese das membranas celulares e de energia (Mounier et al., 2014). FASN é a enzima chave no metabolismo lipídico endógeno e sua alta expressão e atividade estão associados a agressividade tumoral, resistência aos quimioterápicos e ao processo de disseminação metastática em diferentes tipos de neoplasias malignas (Menendez e Lupu, 2007; Liu et al., 2008; Witkiewicz et al., 2008; Murata et al., 2010; Zeng et al., 2010; Zaytseva et al., 2012; Duan et al., 2016; Röhrig e Schulze, 2016). Nos tecidos normais sua atividade é baixa ou até mesmo ausente, no entanto, é superexpressa e hiperativada em diversas linhagens celulares de câncer, incluindo o CCE oral (Kuhajda, 2000; Silva et al., 2010). Devido a expressão diferencial de FASN entre os tecidos normais e as células neoplásicas, esta enzima tem sido considerada um alvo terapêutico promissor.

A resistência terapêutica, principalmente associada a fatores extrínsecos e adquiridos, representa uma grande limitação no tratamento do câncer, incluindo o CCE oral, e representa um dos principais determinantes de mortalidade (Nikolaou et al., 2018; Wang et al., 2019). A terapia combinada é uma estratégia importante para

superar a resistência aos medicamentos e melhorar as respostas e as taxas de cura. Em geral, agentes que possuem mecanismos bioquímicos de ação distintos e complementares são explorados para obter-se sinergia bioquímica (Bouffard et al., 2003; Damaraju et al., 2007). A expressão aumentada de FASN nas células neoplásicas já foi associada a resistência quimioterápica em carcinomas de mama, fígado, ovário e próstata, o que reforça a exploração da inserção dos inibidores desta enzima nos protocolos quimioterápicos atuais (Montgomery et al., 2008; Meena et al., 2013; Warmoes et al., 2013; Bauerschlag et al., 2015).

Estudos têm demonstrado que a terapia combinada com inibidores FASN (cerulenina e C75) e agentes antitubulínicos (Ptx e docetaxel) produz um efeito citotóxico sinérgico em linhagem celular de câncer de mama, com aumento das taxas de apoptose (Menendez et al., 2004a; b, 2005a). Nosso grupo também foi capaz de demonstrar resultados favoráveis na terapia combinada entre o inibidor de FASN Orl com o agente antitubulínico Ptx em linhagem de CCE oral. Neste trabalho, a combinação Orl/Ptx in vitro mostrou efeito sinérgico em relação as taxas de apoptose e redução da adesão de células altamente metastáticas (SCC9 ZsGreen LN1-A) (Almeida LY, 2015).

No presente trabalho, demonstramos que a terapia combinada Orl/Ptx em modelo ortotópico de CCE oral desenvolvido por nossa equipe (Agostini et al., 2014) proporciona resultados superiores aos tratamentos isolados, diminuindo a progressão dos tumores primários e a disseminação metastática. Nossos resultados corroboram os estudos recentes realizados por Heuer et al. (2017) demonstrando que a combinação de TVB-3166, um inibidor de FASN, com Ptx potencializa a inibição do crescimento tumoral. Esses mesmos autores observaram que a combinação TVB- 3166/Ptx diminui o crescimento de xenoenxertos ovarianos (OVCAR-8), de próstata (22Rv1) e pancreáticos (PANC-1) em 130, 97 e 88 %, respectivamente, bem como xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) com câncer de pulmão de células não pequenas, os quais foram inibidos em 76-183%. Da mesma forma que o TVB-3166, a terapia isolada com Orl também não mostrou efeitos significantes sobre o desenvolvimento dos tumores primários na presente pesquisa.

Em trabalho prévio desenvolvido em nosso laboratório, foi demonstrado que Orl reduz o crescimento de tumores ortotópicos primários e a sua disseminação metastática em 43% (Agostini et al., 2014). Em nosso estudo, apesar de Orl não ter

afetado o crescimento dos tumores primários, observamos redução no número de linfonodos metastáticos de 15,8 % e 21 % nos desenhos experimentais 1 e 2, respectivamente. As diferenças encontradas no presente estudo podem ser explicadas, pelo menos em parte, pela utilização de uma nova linhagem (LN1-A) isolada posteriormente aos estudos de Agostini et al. (2014)

O mecanismo pelo qual a associação Orl/Ptx interfere no crescimento dos tumores ainda não está bem clara. No entanto, foi demonstrado que a inibição de FASN diminui a palmitoilação da tubulina, alvo do Ptx, o que leva a uma profunda perturbação da organização dos microtúbulos das células tumorais (Heuer et al., 2017). Além disto, uma abordagem proteômica recente mostrou pela primeira vez que FASN não é o único alvo de Orl. Neste estudo, foram identificados oito novos alvos de atuação do fármaco, alguns dos quais estão associados com a biologia tumoral, como a β-tubulina (Yang et al., 2010; Schcolnik-Cabrera et al., 2018). Estes dados, em conjunto, podem explicar a razão pela qual a eficácia antitumoral é significativamente melhorada quando o Orl é combinado com outro medicamento direcionado aos microtúbulos, como o Ptx.

Apesar dos resultados promissores observados na presente pesquisa, enfrentamos uma série de dificuldades no decorrer dos experimentos. A primeira delas foi a determinação da dose de Ptx. A dose 30 mg/kg/dia utilizada no experimento 1, tanto no grupo Ptx como no Orl/Ptx, foi estabelecida por meio de ensaios de dose máxima tolerada (DMT) previamente realizados em nosso laboratório (Almeida LY, 2015). A DMT é definida como a dose mais alta possível, que permita que 100% dos animais sobrevivam sem sinais clínicos como infecções, sangramento ou diarreia, além de perda de peso corporal abaixo de 20 % (Martensson et al., 2005). Após a primeira administração de Ptx, observamos resultados não esperados em relação a tolerabilidade do fármaco. Somente com uma única administração, obtivemos 12,5 % de morte no grupo Ptx e 55,56 % no grupo Orl/Ptx. Além disto, os animais que sobreviveram apresentaram efeitos colaterais que não se reverteram até o final do período experimental, como caquexia, ascite e dificuldade de locomoção. O número de mortes poderia ter sido ainda maior, se realizássemos a segunda aplicação de Ptx no 10° dia do período experimental, como inicialmente planejado. As razões pelas quais a toxicidade do Ptx foi maior no estudo atual em relação aos trabalhos prévios desenvolvidos pelo nosso grupo não está clara. No entanto, a forma de administração,

o uso de um lote diferente da droga e a sua forma de diluição podem ser possíveis explicações. Em nosso trabalho, a administração de Orl/Ptx no experimento 1 foi realizada de forma conjunta, ou seja Orl, Ptx e PBS estavam misturados em um única solução com um volume final de 200 µl. Além disso, as doses foram inicialmente calculadas pela média dos pesos dos camundongos de cada grupo, o que possivelmente fez com que alguns animais tenham recebido uma dosagem maior ou menor do que a planejada (30 mg/Kg/dia).

O problema da dosagem de Ptx foi contornado por um novo desenho experimental, no qual reduzimos a dose inicial pela metade (15 mg/kg/dia). Esta nova proposta foi baseada em estudos prévios da literatura que demonstraram que as doses entre 10-20 mg/kg/dia apresentam boa tolerabilidade e permitem uma maior frequência nas aplicações (Moisan et al., 2014; Heuer et al., 2017; Hirst et al., 2018; Liu et al., 2018; Zhou et al., 2018). Com a diminuição da dose, não observamos perda de peso e ou efeito colateral evidente em nenhuma das administrações de Ptx (5 °, 10° e 15 ° dia do período experimental). Além do mais, os efeitos antimetastáticos da terapia com Orl/Ptx parecem não ter sido prejudicados. Observamos redução do número de metástases de 50 % e 47,9 % nos experimentos 1 e 2, respectivamente. Por outro lado, a maior dosagem de Ptx (30 mg/kg/dia) apresentou efeito inibitório superior em relação ao tumor primário, tanto na terapia isolada (Ptx) como na combinada (Orl/Ptx). A menor dosagem de Ptx (15 mg/kg), por sua vez, mostrou diminuição de 10,7 % na disseminação metastática, ao contrário do experimento 1, que apresentou aumento de 17,6 % no número de metástases em relação ao grupo Ctrl. É importante ressaltar que os experimentos 1 e 2 foram realizados por diferentes períodos experimentais (15 ou 17 dias), com um número de ciclos de Ptx diferente, portanto, não podem ser analisados em conjunto. Apesar das diferenças as terapias combinadas com Orl/Ptx foram superiores as isoladas nos dois desenhos experimentais, reforçando a hipótese de que FASN é um alvo importante para o tratamento oncológico, principalmente quando em associação aos agentes taxanos.

O segundo desafio encontrado neste trabalho foi a correta classificação dos linfonodos em metastáticos ou livre de metástases. Na análise individual dos linfonodos encontramos diferentes intensidades e padrões de fluorescência, indicativas de presença de células tumorais (que produzem a proteína verde fluorescente ZsGreen). Tais diferenças nos levaram a acreditar que algumas

estruturas apresentam autofluorescência e que restos celulares fagocitados ou em processo de filtragem dentro dos linfonodos poderiam ainda apresentar a fluorescência da proteína ZsGreen, podendo causar uma superestimação do número de linfonodos afetados. Diante disso, decidimos padronizar o mapeamento de todos os focos metastáticos, por meio da positividade para fluorescência associada a colorações com colorações com H&E e IHC para citoqueratina.

Realizamos então um estudo minucioso da disseminação metastática linfonodal no modelo ortotópico de CCE de língua. Inicialmente, todos os linfonodos coletados foram separados em cadeias e identificados por animais, cuidado extra que nos trouxe informações relevantes do modelo experimental, como a identificação das cadeias não suscetíveis a metástases (MLD e MLE) e a previsibilidade do linfonodo sentinela (MMD), já que os animais mostraram um padrão de drenagem similar entre si. Acreditamos que estes dados serão de grande importância para reproduções experimentais futuras, pelo nosso ou por outros grupos de pesquisa. Além disto, o padrão de drenagem metastática aqui identificado pode auxiliar na criação de modelos similares, sem a necessidade da proteína ZsGreen.

Só foi possível classificar com segurança os linfonodos em negativos ou metastáticos após a confirmação pelos três métodos (fluorescência, HE e IHC) e cuidadosa análise. As metástases localizam-se geralmente na região da cápsula linfonodal e apresentam-se como grupos de células agrupadas em padrão de ilhas tumorais. Células malignas isoladas não foram identificadas. O reconhecimento do padrão de invasão dos linfonodos pelas células metastáticas é de alta relevância para a correta quantificação dos linfonodos metastáticos neste modelo, principalmente se o método da fluorescência for utilizado como única forma de análise.

Por fim, nas reações de imunoistoquímica para pan-CK (AE1/AE3) realizadas nas amostras dos linfonodos, observamos algumas marcações aparentemente inespecíficas em células isoladas, as quais poderiam ter sido consideradas metastáticas se não fosse a análise conjunta com a fluorescência. Estudos anteriores demonstraram que as células do retículo dos linfonodos podem expressar citoqueratina, o que pode resultar certa dificuldade na interpretação dos resultados (Doglioni et al., 1990; Gould et al., 1995; Linden e Zarbo, 2001). A intensidade da imunocoloração bem como padrão de distribuição das células do retículo são distintas das células metastáticas e seus agrupamentos (Gould et al.,

1995; Linden e Zarbo, 2001). Embora o significado biológico das células reticulares positivas para citoqueratina não seja claro, é necessário considerarmos este tipo de reatividade durante a análise de colonização de linfonodos por CCE oral. No entanto, não encontramos estudos na literatura relatando a presença deste tipo de marcação em camundongos, o que reforça a necessidade de futuras investigações. Além disto, não realizamos controles negativos nas reações de IHC, portanto, embora improvável, a reatividade com os anticorpos secundários também não pode ser descartada.

Em resumo, a presente pesquisa demonstra a relevância da associação de inibidores de FASN com drogas da família dos taxanos como potencial tratamento para o CCE oral, principalmente os casos avançados. O minucioso mapeamento da disseminação das metástases no modelo ortotópico de CCE de língua gerou dados de grande importância para a reprodutibilidade do mesmo e será muito importante para experimentos futuros de nosso e de outros grupos de pesquisa sobre tratamento do CCE oral.

7 Conclusão

A inibição de FASN com Orl associado ao quimioterápico Ptx (Orl/Ptx) apresenta efeito sinérgico na inibição do crescimento do tumor primário e da disseminação metastática regional em modelo ortotópico de CCE de língua.

Todas as metástases nos linfonodos regionais podem ser identificadas com o método da fluorescência associada as colorações de H&E e a IHQ para pan-CK. Com treinamento adequado, a observação do padrão morfológico e localização das áreas de fluorescência podem ser suficientes para a detecção destas metástases com maior rapidez e sem perder em precisão.

O padrão de drenagem metastática linfonodal em modelo ortotópico de CCE oral é similar entre os animais, sendo o envolvimento primário observado nas cadeias mandibulares mediais. O que torna possível a previsibilidade do linfonodo sentinela.

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