Ensaio com maiores valores de tempo de liofilização e concentração de

Como o objetivo envolve a obtenção de partículas com tamanho inferior a 200 nm e com um valor de PDI recomendável inferior a 0,25, a partir dos gráficos das superfícies de resposta para tamanho (Figura 48) e PDI (Figura 49) observou-se que a melhor condição de liofilização das partículas foi obtida no maior nível da concentração de trealose. Contudo, mesmo nestas condições tanto o tamanho quanto o PDI estão acima dos valores desejados. Por este motivo, um novo ensaio foi realizado com intuito de avaliar se seria possível a obtenção de melhores resultados empregando-se maiores concentrações de trealose (30, 40 e 50% m/V) com um tempo de liofilização de 72 h ou 96 h. Estes resultados encontram-se na Tabela 29, e para ilustrar o perfil obtido pelo equipamento, os gráficos de distribuição do tamanho de partículas (Figura A12) e potencial Zeta (Figura A13), equivalentes a 1 medida, para a amostra 22 da Tabela 29 são mostrados no Anexo.

Tabela 29. Novos pontos experimentais e as respostas observadas em função do tempo de liofilização e da concentração de trealose

Amostra Tempo (horas) Trealose (% m/V) Tamanho (nm) PDI Potencial Zeta (mV) 15 72 30 215,5 0,237 -24,1 16 230,4 0,321 -28,9 17 72 40 202,0 0,209 -23,5 18 205,4 0,255 -25,6 19 72 50 228,1 0,346 -27,1 20 191,1 0,185 -21,8 21 96 30 201,2 0,224 -26,1 22 202,5 0,208 -26,2 23 96 40 206,6 0,233 -30,2 24 203,4 0,258 -26,4 25 26 96 50 197,8 0,234 -25,3 206,1 0,231 -22,0

É importante ressaltar que a concentração máxima de trealose escolhida foi 50% m/V por causa do seu limite de solubilidade em água (68,9 g em 100 mL) [150]. De acordo com os resultados da Tabela 29 observa-se uma pequena diminuição nos valores tanto de tamanho quanto de PDI quando a concentração de trealose aumentou de 20% para 30% m/V. Em relação ao tempo, as amostras que permaneceram 96 h no liofilizador apresentaram valores ligeiramente menores de tamanho e PDI em comparação com as que ficaram 72 h, sendo que as amostras 21-22 foram as que apresentaram valores mais próximos às dimensões das nanopartículas antes da liofilização: Φi = 161,6 nm, PDIi = 0,118 e ζi = -33,4 mV.

Conforme relatado na literatura, em alguns casos um aumento na concentração do crioprotetor até determinado valor pode alcançar um limite de estabilização, podendo até mesmo desestabilizar as nanopartículas [141,151].

A partir das condições otimizadas da liofilização (tempo = 96 h e trealose = 30% m/V), realizou-se um ensaio com as nanopartículas funcionalizadas com folato de quitosana, que foram preparadas usando as condições ótimas: tempo de agitação = 80 min e concentração de QTS-FOL = 0,10% m/V, para verificar se a adição de trealose seria necessária para manter a dimensão das partículas após a liofilização. Estes resultados encontram-se na Tabela 30. Conforme observado para as partículas não-funcionalizadas, na ausência de trealose ocorre agregação e coalescência, enquanto que quando se utiliza as condições ótimas ocorre um pequeno aumento nos valores dos parâmetros, não havendo formação de agregados ou dificuldades na redispersão das partículas modificadas com QTS-FOL.

Tabela 30. Valores de tamanho, PDI e potencial Zeta das partículas funcionalizadas com QTS-FOL antes e após a liofilização

Amostra Φ(i) (nm) Φ(f) (nm) PDI(i) PDI(f) ζ(i) (mV) ζ(f) (mV)

NPs sem trealose 177,5 784,1 0,196 0,609 49,7 ---

NPs 1 174,6 196,0 0,214 0,271 51,0 54,8

NPs 2 173,4 194,4 0,198 0,241 50,3 45,8

4.10 Ensaio de estabilidade em tampão fosfato salino pH 7,4

A estabilidade coloidal de qualquer formulação é um parâmetro importante e deve ser verificada frente à força iônica e à variação de pH no local de

administração, uma vez que em meio biológico a agregação de nanopartículas é um fenômeno comum e que pode dificultar a reprodutibilidade experimental devido a mudanças na captação celular e no seu perfil de toxicidade [152,153].

Para formulações que serão administradas via intravenosa, é importante verificar a estabilidade das partículas no fluido sanguíneo, que apresenta íons e sais. Por este motivo, é importante o estudo de sua estabilidade em solução de tampão fosfato salino com pH 7,4. O efeito da adição de íons na estabilidade de emulsões já é conhecido: o aumento da concentração de eletrólitos diminui a espessura da dupla camada elétrica e reduz os efeitos de repulsão e de resistência à deformação da nuvem iônica, levando à coagulação das partículas [152,154]. A Figura 50 ilustra este fenômeno: a separação entre as partículas e a força de repulsão da dupla camada diminui quando há um aumento na concentração do eletrólito [155].

Figura 50. Força de repulsão, em função da separação superficial, entre partículas suspensas em uma solução contendo eletrólito monovalente em diferentes

concentrações. Adaptado de Szilagyi [155]

Para ilustrar o perfil obtido pelo equipamento, os gráficos de distribuição do tamanho de partículas são mostrados no Anexo, sendo equivalentes a 1 medida,

para uma amostra do dia 3 (NPs, Figura A14) e uma amostra do dia 2 (NPs/QTS- FOL, Figura A15) da Figura 51. A partir dos resultados obtidos (Figura 51) foi possível observar que não ocorreram alterações significativas nos valores de tamanho, PDI e potencial Zeta tanto para as partículas não-modificadas (NPs) quanto para as funcionalizadas com folato de quitosana (NPs/QTS-FOL) em meio de tampão fosfato salino, durante 9 dias a 37ºC. Alterações importantes seriam observadas com a ocorrência de agregação, o que provocaria aumento no tamanho das partículas e no PDI para valores acima de 500 nm e 0,30, respectivamente [156].

Conforme relatado na literatura, nanopartículas de PLGA não sofrem agregação após incubação em PBS, fato que pode estar relacionado à repulsão eletrostática por causa da elevada carga negativa presente na superfície das partículas, assim como um recobrimento adequado do núcleo polimérico devido ao TPGS [41,100].

Figura 51. Avaliação do tamanho (A), PDI (B) e potencial Zeta (C) das nanopartículas (NPs e NPs/QTS-FOL) em função do tempo, em tampão fosfato

No caso das partículas funcionalizadas, não foi observada alteração em sua estabilidade devido à baixa concentração de folato de quitosana utilizada (0,10% m/V). Porém, esta concentração foi suficiente para manter a elevada carga positiva das partículas, conforme pode ser observado nos valores de potencial Zeta que permaneceram praticamente constantes ao longo deste estudo. Nafee e colaboradores mostraram que quanto maior a concentração de quitosana (0,3%- 0,6%-0,9% m/V), maior é a propensão das partículas de PLGA funcionalizadas à aglomeração em meio de cultura com pH 7,4 [157]. Este fato é explicado pela ocorrência de reticulação das cadeias de quitosana devido à presença de ânions multivalentes, o que provoca precipitação das nanopartículas [31].

4.11 Espectroscopia de fluorescência

Uma das principais preocupações no desenvolvimento de sistemas carreadores de fármacos envolve a retenção de sua atividade farmacológica após o processo de encapsulação, sendo extremamente importante e alvo de diversos estudos principalmente quando se trata de biomoléculas [158].

No caso da carboplatina, sua citotoxicidade está relacionada com a formação de adutos platina-DNA, que distorcem a estrutura de dupla hélice do DNA e levam à morte celular. Porém, antes da ligação ao DNA a formação de aqua espécies é necessária. Devido à presença dos ligantes NH3, que permanecem

coordenados, tanto a cisplatina quanto a carboplatina formam adutos idênticos com o DNA: ligações intrafita no nitrogênio N7 de guaninas vizinhas [130,159], conforme ilustrado na Figura 52.

Figura 52. Estrutura do aduto formado entre o fragmento [Pt(NH3)2]2+ e 2 guaninas

De forma a avaliar se a carboplatina manteve sua capacidade de formar ligação covalente com o DNA após a encapsulação, foi realizado um ensaio no qual as partículas carregadas com carboplatina foram colocadas em uma solução contendo DNA. Contudo, para evitar artefatos espectrais causados por elas devido ao espalhamento de luz [147], a solução contendo DNA foi colocada em uma membrana de diálise que foi imersa na suspensão de nanopartículas e o sistema ficou sob agitação magnética a 37ºC por 48 h.

Por causa do efeito estéreo e do efeito quelato existente no ligante ciclobutano-dicarboxilato (cbdca), a carboplatina apresenta reatividade muito baixa frente a substituições nucleofílicas e com isso a formação da espécie intermediária,

cis-[Pt(NH3)2(H2O)2]2+, que posteriormente reage com o DNA, é lenta [160,161]. A

Figura 53 ilustra este mecanismo de reação [10].

Figura 53. Esquema da reação entre carboplatina e água, formando a espécie cis-

[Pt(NH3)2(H2O)2]2+, que se liga ao DNA. Adaptado de Dabrowiak [10]

Com isso, para acelerar a reação da carboplatina com o DNA foi adicionado à suspensão de nanopartículas carbonato de sódio, na mesma concentração em que é encontrado no plasma sanguíneo (aproximadamente 0,024 mol L-1). Estudos mostram que, em tampão carbonato, a carboplatina forma espécies mais reativas (complexos do tipo platina-carbonato e platina-hidroxo) que também conseguem se ligar ao DNA, levando à formação dos adutos 1,2-intrafita [162,163]. A Figura 54 ilustra as reações que ocorrem com carboplatina na presença de carbonato [10].

Figura 54. Reações para a carboplatina em tampão carbonato 0,0238 mol L-1 com pH 8,4. Adaptado de Dabrowiak [10]

Com o objetivo de investigar a ocorrência da ligação entre carboplatina e DNA, neste trabalho foi realizado um estudo de fluorescência empregando-se um composto intercalador de DNA. A fluorescência foi escolhida já que ela apresenta uma elevada sensibilidade em termos de detecção quando comparada com técnicas baseadas em absorção de luz [164], uma vez que a baixa quantidade de carboplatina encapsulada pode provocar alterações na estrutura do DNA que não sejam detectadas por técnicas de absorção, como espectroscopia na região do UV- Vis e dicroísmo circular.

Neste trabalho foi utilizado o composto intercalador conhecido como SYBR Green, um fluoróforo específico que interage com o DNA em forma de dupla hélice, intercalando entre os pares de base e, com isso, aumentando sua emissão de fluorescência em mais de 1000 vezes. Portanto, mudanças observadas na intensidade de fluorescência do sistema SYBR Green/DNA, na presença de algum composto, são indício de alterações na estrutura de dupla hélice [101,165]. A Figura 55 ilustra um modelo proposto para o complexo SYBR Green/DNA.

Figura 55. Esquema do modelo proposto para a intercalação do SYBR Green (SG) entre os pares de base do DNA. Adaptado de Dragan [165]

Neste experimento, quantidades crescentes de uma solução contendo SYBR Green foram adicionadas às soluções de DNA incubado com diferentes concentrações de carboplatina encapsulada: considerando uma eficiência de encapsulação = 35%, as concentrações estimadas de carboplatina em cada ensaio foram 10, 20, 35 e 50 μg mL-1

. É importante ressaltar que a carboplatina não apresenta bandas de absorção na região investigada (500-700 nm) [166], conforme observado nos espectros de absorção no UV-Vis (Figura A16 no Anexo) que foram adquiridos em água deionizada.

O gráfico da intensidade de fluorescência a 520 nm (máximo de emissão do SYBR Green) em função do volume adicionado está na Figura 56. Para ilustrar o perfil dos espectros de fluorescência, a Figura A17 (Anexo) contém os espectros obtidos quando o volume adicionado da solução de SYBR Green foi igual a 80 μL.

A partir da Figura 56, com o aumento da concentração de carboplatina foi observada diminuição na intensidade de fluorescência do SYBR Green. Portanto, este resultado pode ser um indicativo de que, mesmo após a encapsulação, a carboplatina poderia ter mantido sua capacidade de formar ligação covalente com o DNA, o que provocou alterações na estrutura de dupla hélice e, com isso, impedindo a intercalação do SYBR Green. Porém, estudos complementares são necessários para afirmar que a carboplatina encapsulada formou ligações covalentes com o DNA, tais como eletroforese em gel de agarose [167], precipitação do DNA com álcool etílico (95%) [168] e posterior quantificação de platina por ICP-OES.

Figura 56. Intensidades de emissão a 520 nm do SYBR Green, em função do volume adicionado, após incubação do DNA com diferentes quantidades de

carboplatina encapsulada (n = 2)

4.12 Perfil de liberação da carboplatina

O perfil de liberação da carboplatina, a partir das nanopartículas de PLGA, em tampão fosfato salino pH 7,4 foi obtido por meio do gráfico de percentual de massa acumulada do fármaco em função do tempo (em horas). Considerando as 8 horas iniciais, o resultado deste experimento é apresentado na Figura 57.

A partir do perfil de liberação (Figura 57) foi possível observar que, nas primeiras 5 horas de ensaio, aproximadamente 80% da quantidade total de carboplatina encapsulada nas nanopartículas de PLGA foi liberada para o meio externo. Após este período não houve liberação adicional do fármaco já que a porcentagem liberada manteve-se constante até o final do ensaio (de 6 h até 144 h), conforme mostrado na Figura A18 (Anexo) que contém o perfil de liberação durante todo o período investigado.

Figura 57. Perfil de liberação da carboplatina a partir das nanopartículas de PLGA durante 8 h, em tampão fosfato salino pH 7,4 (n = 2)

A liberação mais rápida durante as 5 horas iniciais pode ser explicada pela presença de fármaco adsorvido na superfície das nanopartículas. Este fenômeno ocorre por causa da hidrofilicidade da carboplatina, assim como por causa do caráter anfifílico do TPGS, o que promove uma rápida absorção de moléculas de água na matriz polimérica, levando a uma rápida difusão do fármaco para o meio externo [53]. Em relação à quantidade de carboplatina que não foi liberada (cerca de 20%), esta pode estar localizada no interior da matriz polimérica que não foi completamente degradada.

De acordo com Lao e colaboradores, o processo de degradação do PLGA ocorre em 4 passos. Primeiramente, o polímero absorve água e sofre intumescimento. A água penetra na região amorfa e altera sua conformação, antes estabilizada por forças de van der Waals e ligações de hidrogênio. Então, segue a clivagem das ligações éster da cadeia polimérica, sendo que cada vez mais são formados grupos terminais carboxílicos que podem catalisar a hidrólise. Com isso,

observa-se diminuição da massa molar e da força mecânica da estrutura. A clivagem das cadeias continua e, por fim, o polímero perde massa significante devido à solubilização de oligômeros para o meio [169]. No caso do PLGA utilizado neste trabalho (razão lático:glicólico 50:50, Mw 7000-17000 Da), estudos indicam que este

copolímero sofre degradação completa em torno de 30 a 40 dias em meio aquoso, ou seja, em um período superior ao investigado no ensaio de liberação (144 horas = 6 dias) [170,171].

De forma a elucidar o mecanismo envolvido na liberação da carboplatina a partir das nanopartículas de PLGA, a modelagem matemática dos dados foi realizada utilizando-se os modelos cinéticos apresentados na seção 1.8 da Introdução, sendo empregado um programa suplementar baseado no Excel conhecido como DDSolver [172]. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 31.

Tabela 31. Ajuste dos modelos matemáticos da liberação de carboplatina a partir de nanopartículas de PLGA Modelo Parâmetro NPs Ordem zero k0 0,2392 R2ajustado 0,7035 RMSE 11,94 Primeira ordem k1 0,3995 R2ajustado 0,9669 RMSE 3,991 Higuchi kH 0,3901 R2ajustado 0,9780 RMSE 3,256 Korsmeyer-Peppas kPK 0,3574 R2ajustado 0,9762 RMSE 3,381 n 0,6235 Baker-Londsdale kBL 0,0345 R2ajustado 0,9415 RMSE 5,306

Neste trabalho, os testes estatísticos aplicados para comparação entre os modelos foram o coeficiente de determinação ajustado (R2ajustado), mais adequado

para comparação entre modelos com número diferente de parâmetros, e a raiz do erro quadrático médio (RMSE, do inglês “root-mean-square error”). O melhor modelo será aquele que apresentar o maior valor de R2ajustado e o menor valor da raiz do erro

quadrático médio [31,173]. Além disso, recomenda-se que os modelos sejam aplicados até a liberação de 70% do fármaco encapsulado [90,174]: desta forma, somente os dados obtidos até 4 horas de liberação foram utilizados para o ajuste dos modelos.

A partir dos resultados da Tabela 31 é possível observar que o maior valor de R2ajustado e o menor valor de RMSE foram obtidos para o modelo de Higuchi

(0,9780 e 3,256, respectivamente), sugerindo que a liberação da carboplatina a partir das nanopartículas de PLGA ocorre por difusão fickiana. Entretanto, considerando que a diferença entre os valores de R2ajustado e RMSE é pequena

comparando-se com o modelo de Korsmeyer-Peppas (0,9762 e 3,381, respectivamente), não é possível afirmar com precisão que o mecanismo de liberação ocorre unicamente por difusão. O valor do expoente n (0,6235) encontra- se na faixa entre 0,43 e 0,85 considerando a geometria esférica, sugerindo que fenômenos como o intumescimento também podem estar envolvidos na liberação do fármaco. Neste caso de transporte anômalo, as velocidades de difusão e de relaxação das cadeias poliméricas por causa do intumescimento apresentam magnitudes similares [89,90].